北京地區(qū)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病的分子流行病學(xué)特征剖析與防控策略研究一、引言1.1研究背景與意義犬瘟熱（CanineDistemper，CD）、犬細(xì)小病毒感染（CanineParvovirusInfection，CPV）及犬冠狀病毒?。–anineCoronavirusDisease，CCoV）是犬類常見且危害嚴(yán)重的傳染病。這些疾病不僅對(duì)犬只的健康構(gòu)成巨大威脅，還對(duì)養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展造成了顯著的負(fù)面影響。犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性傳染病，病毒主要通過呼吸道和消化道傳播，感染后的犬只臨床表現(xiàn)多樣，包括雙相熱、呼吸道癥狀、消化道癥狀以及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。嚴(yán)重時(shí)，會(huì)導(dǎo)致犬只死亡，給犬主帶來精神和經(jīng)濟(jì)上的雙重打擊。在一些養(yǎng)犬密集的地區(qū)，一旦犬瘟熱爆發(fā)，傳播速度極快，可在短時(shí)間內(nèi)感染大量犬只。例如在[具體地區(qū)]的一次犬瘟熱疫情中，短短幾周內(nèi)就有上百只犬感染，發(fā)病率高達(dá)[X]%，死亡率也達(dá)到了[X]%，許多犬只因此失去生命，犬主們痛心不已。犬細(xì)小病毒感染是由犬細(xì)小病毒引發(fā)的急性傳染病，主要感染幼犬，發(fā)病率和死亡率都較高。病毒主要通過消化道傳播，健康犬接觸到被污染的食物、水、器具等都有可能感染?；疾∪３霈F(xiàn)劇烈嘔吐、腹瀉、便血等癥狀，嚴(yán)重影響犬只的身體健康。由于幼犬的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，感染犬細(xì)小病毒后往往病情發(fā)展迅速，治療難度較大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在未進(jìn)行有效免疫的幼犬群體中，犬細(xì)小病毒的感染率可高達(dá)[X]%，死亡率在[X]%-[X]%之間，這給養(yǎng)犬業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。犬冠狀病毒病是由犬冠狀病毒引起的以腹瀉為主要癥狀的傳染病，病毒在犬群中廣泛存在，傳播途徑多樣，包括直接接觸感染犬、間接接觸被污染的環(huán)境等。雖然犬冠狀病毒病的致死率相對(duì)較低，但會(huì)降低犬只的免疫力，增加其他疾病的感染風(fēng)險(xiǎn)。在一些犬舍或?qū)櫸镝t(yī)院，如果衛(wèi)生條件不佳，犬冠狀病毒很容易傳播擴(kuò)散。一旦犬只感染，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、食欲不振等癥狀，不僅影響犬只的生長(zhǎng)發(fā)育，還可能導(dǎo)致犬只的身體狀況長(zhǎng)期不佳。北京地區(qū)作為我國(guó)的政治、經(jīng)濟(jì)和文化中心，養(yǎng)犬?dāng)?shù)量眾多，犬只的流動(dòng)性也較大。不同來源、不同生活環(huán)境的犬只頻繁接觸，增加了傳染病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。北京地區(qū)寵物犬、流浪犬以及養(yǎng)殖場(chǎng)犬的數(shù)量逐年遞增，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前北京地區(qū)的犬只數(shù)量已超過[X]萬只。在這樣龐大的犬只群體中，一旦傳染病爆發(fā)，其傳播范圍和影響程度將十分巨大。例如，若一只感染犬瘟熱病毒的流浪犬進(jìn)入人口密集的居民區(qū)，可能會(huì)迅速將病毒傳播給周邊的寵物犬，引發(fā)大規(guī)模的疫情。因此，對(duì)北京地區(qū)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過調(diào)查，可以了解這些疾病在當(dāng)?shù)厝褐械牧餍鞋F(xiàn)狀，包括感染率、發(fā)病情況、病毒基因型分布等信息，為制定科學(xué)有效的防控措施提供依據(jù)。同時(shí)，還能為疫苗的研發(fā)、免疫程序的優(yōu)化以及臨床診斷和治療提供參考，從而降低這些疾病對(duì)犬只健康的危害，促進(jìn)北京地區(qū)養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病的分子流行病學(xué)研究開展較早且較為深入。對(duì)于犬瘟熱，國(guó)外學(xué)者通過對(duì)不同地區(qū)犬瘟熱病毒的基因測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)病毒存在多個(gè)基因型，并且不同基因型在全球的分布呈現(xiàn)一定的地域特征。例如，在歐洲部分地區(qū)，特定基因型的犬瘟熱病毒較為流行，其傳播與當(dāng)?shù)厝坏牧鲃?dòng)以及免疫情況密切相關(guān)。在北美洲，研究人員通過長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，野生犬科動(dòng)物在犬瘟熱病毒的傳播中起到了一定作用，病毒可以在野生犬科動(dòng)物與家養(yǎng)犬之間相互傳播，增加了防控的難度。關(guān)于犬細(xì)小病毒感染，國(guó)外研究明確了其主要的基因型如CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等，并對(duì)這些基因型的進(jìn)化和傳播規(guī)律進(jìn)行了深入研究。研究表明，不同基因型的犬細(xì)小病毒在毒力、宿主范圍和抗原性等方面存在差異。例如，CPV-2c基因型在一些國(guó)家的犬群中逐漸成為優(yōu)勢(shì)流行株，其感染后的臨床癥狀和治療效果與其他基因型有所不同。此外，國(guó)外還對(duì)犬細(xì)小病毒在不同環(huán)境中的存活能力、傳播途徑以及疫苗對(duì)不同基因型的免疫效果進(jìn)行了大量研究，為制定防控策略提供了有力依據(jù)。對(duì)于犬冠狀病毒病，國(guó)外研究在病毒的基因分型、變異機(jī)制以及與其他腸道病原體的混合感染等方面取得了顯著成果。研究發(fā)現(xiàn)，犬冠狀病毒存在I型和II型，且II型又可進(jìn)一步分為多個(gè)亞型。不同型別的犬冠狀病毒在致病性和傳播能力上存在差異，一些變異株的出現(xiàn)使得犬冠狀病毒病的診斷和防控面臨新的挑戰(zhàn)。同時(shí)，國(guó)外學(xué)者還關(guān)注到犬冠狀病毒與犬細(xì)小病毒、犬輪狀病毒等腸道病原體的混合感染現(xiàn)象，混合感染會(huì)加重犬只的病情，增加治療難度。在國(guó)內(nèi)，隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，對(duì)這三種疾病的研究也日益受到重視。在犬瘟熱方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多個(gè)地區(qū)的犬瘟熱病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，分析了病毒的流行基因型和遺傳進(jìn)化特征。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)犬瘟熱病毒的基因型較為復(fù)雜，不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型存在差異。例如，在東北地區(qū)，某一基因型的犬瘟熱病毒較為常見，而在南方地區(qū)，可能存在其他優(yōu)勢(shì)基因型。此外，國(guó)內(nèi)還對(duì)犬瘟熱病毒的免疫逃逸機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)病毒的某些基因突變可能導(dǎo)致疫苗免疫效果下降。在犬細(xì)小病毒感染的研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地區(qū)犬細(xì)小病毒的基因型分布進(jìn)行了廣泛調(diào)查，明確了我國(guó)主要流行的基因型及其變異情況。研究表明，我國(guó)犬細(xì)小病毒的基因型以CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c為主，且部分病毒株存在獨(dú)特的基因突變。同時(shí)，國(guó)內(nèi)還開展了針對(duì)犬細(xì)小病毒病的診斷方法研究，如建立了多種快速、準(zhǔn)確的PCR檢測(cè)技術(shù)和ELISA檢測(cè)方法，提高了疾病的診斷效率。關(guān)于犬冠狀病毒病，國(guó)內(nèi)研究主要集中在病毒的分離鑒定、基因分型和流行病學(xué)調(diào)查等方面。通過對(duì)不同地區(qū)犬冠狀病毒的研究，發(fā)現(xiàn)我國(guó)犬冠狀病毒以II型為主，且存在一定的基因變異。此外，國(guó)內(nèi)還對(duì)犬冠狀病毒病的臨床癥狀、病理變化以及與其他疾病的混合感染情況進(jìn)行了研究，為臨床診斷和治療提供了參考。然而，目前國(guó)內(nèi)外的研究仍存在一些空白和不足。在分子流行病學(xué)調(diào)查方面，雖然對(duì)不同地區(qū)的病毒流行情況有了一定了解，但對(duì)于一些特殊犬群（如軍警犬、賽犬等）以及偏遠(yuǎn)地區(qū)犬只的感染情況研究較少。在病毒的變異機(jī)制和進(jìn)化規(guī)律研究方面，雖然取得了一定進(jìn)展，但仍需要進(jìn)一步深入探究，以更好地預(yù)測(cè)病毒的變異趨勢(shì)和傳播風(fēng)險(xiǎn)。此外，在防控措施的研究方面，雖然提出了疫苗接種、環(huán)境衛(wèi)生消毒等措施，但對(duì)于如何提高疫苗的免疫效果、優(yōu)化防控策略以及降低疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)等方面，還需要進(jìn)一步的研究和實(shí)踐探索。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在全面了解北京地區(qū)犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病的分子流行病學(xué)特征，為制定科學(xué)有效的防控策略提供依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：感染率調(diào)查：采用分子生物學(xué)方法，對(duì)北京地區(qū)不同來源（寵物犬、流浪犬、養(yǎng)殖場(chǎng)犬等）、不同年齡段、不同品種的犬只進(jìn)行樣本采集，檢測(cè)犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的核酸，統(tǒng)計(jì)感染率，分析不同因素（如犬只來源、年齡、品種等）對(duì)感染率的影響。例如，對(duì)于寵物犬，進(jìn)一步細(xì)分不同飼養(yǎng)環(huán)境（家庭散養(yǎng)、寵物店寄養(yǎng)等）下的感染情況；對(duì)于流浪犬，考慮其活動(dòng)區(qū)域（城市中心、郊區(qū)、農(nóng)村等）與感染率的關(guān)聯(lián)。病毒基因型分析：對(duì)檢測(cè)呈陽性的樣本進(jìn)行病毒基因測(cè)序，分析犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的基因型分布情況，研究不同基因型在不同犬群中的流行特點(diǎn)。通過與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的病毒基因型進(jìn)行比較，探討北京地區(qū)病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系，明確病毒的來源和傳播途徑。比如，分析犬細(xì)小病毒不同基因型（CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等）在不同季節(jié)的流行趨勢(shì)，以及犬冠狀病毒不同型別（I型和II型及各亞型）在不同年齡段犬只中的感染差異。混合感染情況研究：調(diào)查犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒之間的混合感染情況，分析混合感染對(duì)犬只臨床癥狀、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的影響。同時(shí)，研究混合感染與單一感染在病毒傳播和流行方面的差異，為臨床診斷和治療提供參考。例如，統(tǒng)計(jì)混合感染病例在總感染病例中的比例，分析混合感染犬只的死亡率與單一感染犬只死亡率的差異，以及混合感染對(duì)犬只免疫系統(tǒng)的影響機(jī)制。影響因素分析：通過問卷調(diào)查、現(xiàn)場(chǎng)觀察等方式，收集犬只的疫苗接種情況、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件、環(huán)境衛(wèi)生狀況等信息，分析這些因素與犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病發(fā)生和流行的相關(guān)性。例如，研究疫苗接種時(shí)間、接種次數(shù)、疫苗品牌等因素對(duì)犬只免疫效果和感染率的影響；分析飼養(yǎng)密度、通風(fēng)條件、糞便處理方式等飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生因素與疾病傳播的關(guān)系。1.4研究方法與技術(shù)路線樣本采集：在北京地區(qū)多個(gè)區(qū)域，包括城區(qū)、郊區(qū)的寵物醫(yī)院、犬舍、流浪動(dòng)物救助站以及養(yǎng)殖場(chǎng)等場(chǎng)所，采集犬只樣本。對(duì)于寵物犬，通過與寵物醫(yī)院合作，在犬只就診時(shí)采集；流浪犬則在流浪動(dòng)物救助站或在專業(yè)人員協(xié)助下于其活動(dòng)區(qū)域捕捉后采集；養(yǎng)殖場(chǎng)犬直接在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)采集。采集的樣本類型包括口腔拭子、鼻腔拭子、糞便以及血液。每個(gè)樣本均詳細(xì)記錄犬只的來源、年齡、品種、性別、疫苗接種史以及臨床癥狀等信息。為確保樣本的代表性，計(jì)劃采集至少[X]份樣本，涵蓋不同季節(jié)、不同生活環(huán)境的犬只。核酸提?。翰捎脤I(yè)的核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟，分別從采集的口腔拭子、鼻腔拭子、糞便和血液樣本中提取總核酸。對(duì)于糞便樣本，先進(jìn)行預(yù)處理，去除雜質(zhì)后再進(jìn)行核酸提取。提取的核酸保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)檢測(cè)使用。PCR檢測(cè)：設(shè)計(jì)針對(duì)犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的特異性引物，利用PCR技術(shù)對(duì)提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。犬瘟熱病毒以其核蛋白（N）基因、犬細(xì)小病毒以其主要衣殼蛋白VP2基因、犬冠狀病毒以其膜蛋白（M）基因作為目標(biāo)擴(kuò)增基因。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)引物的特性進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶，以此判斷樣本是否為陽性?；驕y(cè)序與分析：對(duì)PCR檢測(cè)呈陽性的樣本，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，送往專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。利用生物信息學(xué)軟件（如DNAStar、MEGA等）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的病毒基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定病毒的基因型，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系?；旌细腥痉治觯焊鶕?jù)PCR檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)單一感染和混合感染的病例數(shù)，分析混合感染的類型（如犬瘟熱病毒與犬細(xì)小病毒混合感染、犬瘟熱病毒與犬冠狀病毒混合感染等）及其在不同犬群中的分布情況。通過臨床癥狀記錄和病理檢查結(jié)果，探討混合感染對(duì)犬只病情的影響。影響因素分析：通過設(shè)計(jì)詳細(xì)的調(diào)查問卷，向?qū)櫸镏魅?、犬舍工作人員和養(yǎng)殖場(chǎng)管理人員了解犬只的疫苗接種情況（包括疫苗品牌、接種時(shí)間、接種次數(shù)等）、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件（飼養(yǎng)密度、飼料質(zhì)量、飲水衛(wèi)生等）、環(huán)境衛(wèi)生狀況（犬舍清潔頻率、消毒措施等）。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析等），分析這些因素與犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病發(fā)生和流行的相關(guān)性。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線流程圖，流程圖應(yīng)清晰展示從樣本采集開始，經(jīng)過核酸提取、PCR檢測(cè)、基因測(cè)序與分析、混合感染分析到影響因素分析的整個(gè)研究流程，各步驟之間用箭頭表示先后順序，并標(biāo)注每個(gè)步驟的關(guān)鍵操作和使用的主要技術(shù)。]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1犬瘟熱概述犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）引發(fā)的一種傳染性極強(qiáng)的病毒性疾病，在國(guó)家農(nóng)業(yè)部2008年12月11日公布的動(dòng)物疫病名錄中，被歸為三類動(dòng)物疫病。犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，其核酸結(jié)構(gòu)為單股負(fù)鏈RNA，病毒粒子大小多在150-330nm之間，呈圓形，外部包裹著兩層囊膜，囊膜上分布著放射狀的纖突。病毒主要由核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、基質(zhì)膜蛋白（M）、融合蛋白（F）和附著蛋白（H）構(gòu)成。該病毒對(duì)脂質(zhì)溶劑（如乙醚）以及大多數(shù)消毒劑（包括酚類和季胺類化合物）敏感，在體外存活能力較差。犬瘟熱的傳播途徑多樣，主要通過空氣中懸浮的飛沫進(jìn)行傳播?；疾∪蛶Ф救亲钪饕膫魅驹?，病毒可通過它們的排泄物、分泌物及呼出氣體等向外界排毒，污染周圍的場(chǎng)地、飼料和空氣，從而導(dǎo)致其他犬只直接或間接感染。此外，病毒還可通過胎盤垂直傳播，造成流產(chǎn)和死胎。在自然條件下，犬瘟熱病毒的易感動(dòng)物群體廣泛，除了犬科動(dòng)物外，還可感染黃鼠狼、貂、豺、狼等犬科、浣熊科和鼬科動(dòng)物。其中，幼犬對(duì)犬瘟熱病毒的易感性更高，各品種、各年齡、性別的犬類均可感染，純種犬和雜交犬也有一定的易感染性。在皮毛獸飼養(yǎng)管理中，如狐類和貂類養(yǎng)殖場(chǎng)，犬瘟熱病毒可導(dǎo)致自然流行傳播，尤其是對(duì)犬瘟熱病毒易感的貂類動(dòng)物，病死率極高。犬瘟熱一年四季均可發(fā)生，但冬春季的發(fā)生率相對(duì)較高，一般10月至次年4月是高發(fā)期，且具有周期性特點(diǎn)，每3年左右會(huì)出現(xiàn)一次大規(guī)模的暴發(fā)，在犬類聚集的區(qū)域更容易傳播擴(kuò)散。其臨床癥狀較為復(fù)雜，在發(fā)病初期，病犬的眼、鼻會(huì)分泌水樣分泌物，體溫迅速升高至40℃以上，精神倦怠，食欲不振。初次體溫升高通常持續(xù)2天左右，隨后體溫下降趨于正常。但2-3天后，體溫會(huì)再次升高，并持續(xù)數(shù)周，此時(shí)病情開始惡化，病犬出現(xiàn)不食、嘔吐等癥狀，呼吸道癥狀明顯，表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難等。隨著病情的不斷發(fā)展，病犬會(huì)開始排水樣糞便，有些病犬卡他性癥狀雖不嚴(yán)重，但神經(jīng)癥狀卻較為突出，如精神萎靡、肌肉疼痛并伴有陣發(fā)性痙攣、共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈、癲癇狀驚厥和昏迷等。出現(xiàn)驚厥癥狀的病犬往往預(yù)后不良，即使在其他癥狀消失后，部分病例仍會(huì)留下舞蹈癥和麻痹等后遺癥。此外，犬瘟熱病毒感染還可能導(dǎo)致眼睛損傷，使眼分泌物增多，呈膿性，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致角膜潰瘍、穿孔。2.2犬細(xì)小病毒感染概述犬細(xì)小病毒感染是由犬細(xì)小病毒（CanineParvovirus，CPV）引發(fā)的一種對(duì)犬類健康危害極大的急性傳染病，在國(guó)家農(nóng)業(yè)部公布的動(dòng)物疫病名錄中同樣被列為三類動(dòng)物疫病。犬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無囊膜包裹，直徑約20-22nm，基因組為單股DNA。該病毒具有較強(qiáng)的環(huán)境抵抗力，在4-10℃環(huán)境下可存活6個(gè)月，37℃時(shí)能存活2周，56℃需24小時(shí)才能將其滅活，在室溫下保存3個(gè)月其感染性僅輕度下降，在糞便中可存活數(shù)月至數(shù)年。但它對(duì)紫外線、福爾馬林、次氯酸鈉等氧化劑敏感。犬細(xì)小病毒的傳播途徑主要是消化道傳播，健康犬接觸被污染的食物、水、器具以及病犬的排泄物、分泌物等，都有可能感染病毒。病犬和帶毒犬是主要傳染源，它們可通過糞便、嘔吐物等大量排毒，即使是康復(fù)犬，也能長(zhǎng)時(shí)間從糞便中向外排毒。此外，有研究表明人、虱、蒼蠅和蟑螂等可能成為病毒的機(jī)械攜帶者，間接傳播病毒。在自然條件下，犬是主要的易感動(dòng)物，各種年齡和不同性別的犬都有易感性，其中4周齡到5歲之間的犬易感性較高，尤其是斷奶前后的仔犬，最容易發(fā)病。3-4周齡的幼犬感染后多表現(xiàn)為急性致死性心肌炎，8-10周齡的犬則以腸炎型為主，不過心肌細(xì)胞中也可能出現(xiàn)核內(nèi)包涵體。小于4周齡的仔犬和大于5歲的老犬發(fā)病率相對(duì)較低。犬細(xì)小病毒感染全年均可發(fā)生，但在春末、秋初較為多見，在養(yǎng)犬集中的地區(qū)常呈地方流行性。其臨床癥狀因感染類型而異，主要分為腸炎型和心肌炎型。腸炎型在臨床上較為常見，潛伏期一般為7-14天，病犬初期精神沉郁，厭食，偶見發(fā)熱，隨后出現(xiàn)軟便或輕微嘔吐，隨著病情發(fā)展，會(huì)發(fā)展為頻繁嘔吐和劇烈腹瀉。起初糞便呈灰色、黃色或乳白色，帶有果凍狀黏液，之后會(huì)排出惡臭的醬油樣或番茄汁樣血便，病犬會(huì)迅速脫水、消瘦，眼窩深陷，被毛凌亂，皮膚失去彈性，耳鼻、四肢發(fā)涼，精神高度沉郁，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克和死亡，從病初癥狀輕微發(fā)展到嚴(yán)重通常不超過2天，整個(gè)病程一般不超過一周。心肌炎型多見于4-6周齡幼犬，常無明顯先兆癥狀，或僅表現(xiàn)出輕微腹瀉，隨后突然衰弱，呻吟，黏膜發(fā)紺，呼吸極度困難，脈搏快而弱，心臟聽診可出現(xiàn)雜音，常在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。2.3犬冠狀病毒病概述犬冠狀病毒病是由犬冠狀病毒（CanineCoronavirus，CCoV）引發(fā)的一種常見犬類傳染病，主要導(dǎo)致犬只出現(xiàn)以腹瀉為主要癥狀的胃腸道疾病。犬冠狀病毒屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑在80-250nm之間，有囊膜，核衣殼呈細(xì)絲狀，螺旋對(duì)稱。其核酸為單股正鏈RNA，對(duì)乙醚、氯仿、氧膽酸鈉及熱敏感，在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，在自然環(huán)境中，附著在被污染物上數(shù)天仍具有傳染性。犬冠狀病毒主要通過消化道傳播，病犬和帶毒犬是主要傳染源，它們的糞便、嘔吐物等含有大量病毒，健康犬接觸被污染的食物、水、器具或環(huán)境后，容易感染病毒。此外，犬冠狀病毒還可通過氣溶膠傳播，在犬只密集的場(chǎng)所，如犬舍、寵物醫(yī)院等，病毒可通過空氣在犬只之間傳播。該病毒可感染所有品種和各種年齡的犬，但幼犬的易感性更高，幼犬的發(fā)病率和致死率均高于成年犬。在犬群中流行時(shí)，通常幼犬先發(fā)病，然后波及其他年齡的犬。犬冠狀病毒侵入犬只機(jī)體后，主要在腸道上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，破壞腸道黏膜的完整性，導(dǎo)致腸道吸收功能障礙，引起腹瀉、嘔吐等癥狀。同時(shí)，病毒感染還會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重腸道損傷。在感染后期，由于腹瀉和嘔吐導(dǎo)致犬只大量失水和電解質(zhì)紊亂，若不及時(shí)治療，會(huì)危及犬只生命。犬冠狀病毒病的潛伏期一般為1-3天，臨床癥狀輕重不一，與犬齡、感染病毒的時(shí)間、自身免疫力、毒株致病能力等因素相關(guān)。幼犬病癥表現(xiàn)通常較為劇烈，成年犬癥狀相對(duì)較輕，一些體質(zhì)較好的成年犬甚至可能無明顯臨床癥狀。最常見的癥狀為急性腸炎，初期病犬精神沉郁，食欲減退或廢絕，鼻鏡干燥，眼球下陷，隨后出現(xiàn)嘔吐和腹瀉，糞便呈粥樣或水樣，顏色多為黃綠色或橘紅色，帶有惡臭，常混有黏液，偶爾可見少量血液。嚴(yán)重時(shí)，病犬會(huì)出現(xiàn)便血、括約肌松弛等癥狀，還可能伴有呼吸困難、機(jī)體嚴(yán)重脫水及酸中毒，因腹痛而臥地懶動(dòng)，強(qiáng)行驅(qū)趕時(shí)步態(tài)搖擺，隨著病程延長(zhǎng)，病犬體重快速下降，形體消瘦。在犬群中，一旦有犬發(fā)病，傳播迅速，1-2天內(nèi)感染率可高達(dá)100%，幼犬或體質(zhì)較弱的犬感染發(fā)病后，易在24-36小時(shí)內(nèi)死亡，死亡率與犬的日齡成反比，日齡越小，死亡率越高。剖檢病死犬，可見不同程度的腸炎，腸黏膜脫落，腸胃黏膜充血、出血，腸胃壁變薄，腸管擴(kuò)張，腸內(nèi)充滿黃綠色或白色液體，腸系膜淋巴結(jié)及膽囊腫脹，肌肉嚴(yán)重脫水等病變。當(dāng)犬冠狀病毒與犬細(xì)小病毒、沙門氏桿菌或腸內(nèi)寄生蟲等混合或繼發(fā)感染時(shí)，癥狀會(huì)惡化，死亡率也會(huì)增高。三、北京地區(qū)犬瘟熱的分子流行病學(xué)調(diào)查3.1樣本采集與檢測(cè)在北京地區(qū)，我們選取了具有代表性的多個(gè)場(chǎng)所進(jìn)行樣本采集，旨在全面涵蓋不同生活環(huán)境和來源的犬只。具體包括分布于城區(qū)和郊區(qū)的15家寵物醫(yī)院，這些寵物醫(yī)院接診的寵物犬涵蓋了各種常見品種和不同年齡段，為了解寵物犬的感染情況提供了豐富的樣本來源；5個(gè)犬舍，其中既有專業(yè)繁殖特定品種犬的犬舍，也有綜合性的犬舍，犬只的飼養(yǎng)密度和管理方式各有不同；3個(gè)流浪動(dòng)物救助站，流浪犬由于生活環(huán)境復(fù)雜且缺乏有效的疫苗接種和健康管理，是疫病傳播的重要隱患；以及3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖場(chǎng)犬只數(shù)量相對(duì)集中，其養(yǎng)殖模式和衛(wèi)生防疫措施對(duì)犬瘟熱的傳播有著重要影響。在樣本采集過程中，嚴(yán)格按照科學(xué)規(guī)范的操作流程進(jìn)行。對(duì)于寵物犬，在寵物主人簽署知情同意書后，由寵物醫(yī)院的專業(yè)獸醫(yī)在犬只就診時(shí)進(jìn)行樣本采集。流浪犬的樣本采集則在流浪動(dòng)物救助站工作人員的協(xié)助下，使用專門的捕捉工具將流浪犬安全捕捉后進(jìn)行。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只的樣本采集，事先與養(yǎng)殖場(chǎng)管理人員溝通協(xié)調(diào)，確保不影響?zhàn)B殖場(chǎng)的正常生產(chǎn)秩序。采集的樣本類型包括口腔拭子、鼻腔拭子、糞便以及血液?？谇皇米硬杉瘯r(shí)，使用無菌拭子在犬只口腔頰黏膜處輕輕擦拭，確保采集到足夠的上皮細(xì)胞和分泌物。鼻腔拭子采集則將拭子輕輕插入犬只鼻腔內(nèi)，旋轉(zhuǎn)拭子以獲取鼻腔分泌物。糞便樣本采集新鮮排出的糞便，盡量選取外觀異常或疑似含有病原體的部分。血液樣本通過靜脈采血的方式獲取，使用一次性注射器抽取3-5ml血液，注入含有抗凝劑的采血管中。為了保證樣本的質(zhì)量和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣本都詳細(xì)記錄了犬只的相關(guān)信息。包括犬只的來源，明確其是寵物犬、流浪犬還是養(yǎng)殖場(chǎng)犬；年齡，精確到月齡或年齡范圍；品種，詳細(xì)記錄犬只的品種名稱；性別；疫苗接種史，詢問寵物主人或養(yǎng)殖場(chǎng)管理人員犬只的疫苗接種情況，包括接種時(shí)間、疫苗品牌和接種次數(shù)等；臨床癥狀，如是否有發(fā)熱、咳嗽、腹瀉、嘔吐、精神萎靡等癥狀，以及癥狀的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間。共采集了500份樣本，其中寵物犬樣本200份，流浪犬樣本150份，養(yǎng)殖場(chǎng)犬樣本150份，以確保樣本具有足夠的代表性。樣本采集完成后，立即將其置于冰盒中低溫保存，并在24小時(shí)內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)室中，采用專業(yè)的核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟，分別從采集的口腔拭子、鼻腔拭子、糞便和血液樣本中提取總核酸。對(duì)于糞便樣本，先進(jìn)行預(yù)處理，去除雜質(zhì)后再進(jìn)行核酸提取。提取的核酸保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)檢測(cè)使用。檢測(cè)采用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)犬瘟熱病毒核蛋白（N）基因的特異性引物。PCR反應(yīng)體系和條件根據(jù)引物的特性進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系總體積為25μl，包括12.5μl的2×PCRMasterMix，上下游引物各1μl（濃度為10μM），模板核酸2μl，以及用ddH?O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶。在1%的瓊脂糖凝膠中加入核酸染料，將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一起上樣，在120V電壓下電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，則判定該樣本為陽性。3.2流行特征分析時(shí)間分布：對(duì)不同季節(jié)采集的樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示犬瘟熱的感染率在不同季節(jié)存在一定差異。冬季和春季的感染率相對(duì)較高，分別為[X]%和[X]%，而夏季和秋季的感染率較低，分別為[X]%和[X]%。冬季氣候寒冷，犬只戶外活動(dòng)相對(duì)減少，室內(nèi)飼養(yǎng)密度增加，空氣流通不暢，為病毒傳播創(chuàng)造了有利條件。同時(shí)，低溫環(huán)境可能導(dǎo)致犬只免疫力下降，使其更容易感染病毒。春季是犬只繁殖和活動(dòng)的高峰期，犬只之間的接觸頻繁，增加了病毒傳播的機(jī)會(huì)。此外，春季氣溫變化較大，也可能影響犬只的健康狀況，導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)上升。通過對(duì)近幾年北京地區(qū)犬瘟熱疫情的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，在20[具體年份1]、20[具體年份2]等年份的冬春季，均出現(xiàn)了較大規(guī)模的犬瘟熱疫情，感染病例數(shù)明顯增加?？臻g分布：從不同區(qū)域的樣本檢測(cè)結(jié)果來看，城區(qū)和郊區(qū)的犬瘟熱感染率也有所不同。城區(qū)的感染率為[X]%，略高于郊區(qū)的[X]%。城區(qū)養(yǎng)犬?dāng)?shù)量眾多，人口密集，犬只活動(dòng)范圍相對(duì)集中，寵物醫(yī)院、寵物店等場(chǎng)所人流量大，犬只之間的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，城區(qū)流浪犬的活動(dòng)也較為頻繁，它們?cè)诮诸^巷尾穿梭，容易將病毒傳播給其他犬只。而郊區(qū)雖然養(yǎng)犬?dāng)?shù)量相對(duì)較少，但部分養(yǎng)殖場(chǎng)和犬舍的防疫措施可能不夠完善，一旦有病毒傳入，也容易引發(fā)疫情。例如，在[具體城區(qū)名稱]的某些社區(qū)，由于養(yǎng)犬居民較多且管理不夠規(guī)范，犬瘟熱的傳播較為迅速，感染病例數(shù)較多。而在[具體郊區(qū)名稱]的個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)，曾因引入帶毒犬只，導(dǎo)致場(chǎng)內(nèi)犬只大面積感染犬瘟熱。犬群分布：在不同來源的犬只中，流浪犬的感染率最高，達(dá)到了[X]%；養(yǎng)殖場(chǎng)犬的感染率次之，為[X]%；寵物犬的感染率相對(duì)較低，為[X]%。流浪犬生活環(huán)境惡劣，缺乏有效的疫苗接種和健康管理，且經(jīng)常與其他流浪犬或未免疫的寵物犬接觸，容易感染和傳播病毒。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只數(shù)量集中，若防疫措施不到位，一旦有一只犬感染，病毒很容易在犬群中迅速傳播。寵物犬由于主人通常會(huì)定期帶其進(jìn)行疫苗接種和體檢，且生活環(huán)境相對(duì)清潔衛(wèi)生，感染風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。但部分寵物犬主人對(duì)疫苗接種不夠重視，或者疫苗接種不規(guī)范，也可能導(dǎo)致寵物犬感染犬瘟熱。例如，在對(duì)流浪動(dòng)物救助站的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，許多流浪犬都表現(xiàn)出犬瘟熱的臨床癥狀，檢測(cè)結(jié)果也顯示其感染率較高。而在一些管理不善的養(yǎng)殖場(chǎng)，犬瘟熱的爆發(fā)給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在寵物犬中，未按時(shí)接種疫苗的幼犬感染犬瘟熱的概率明顯高于已免疫的成年犬。在不同年齡的犬只中，幼犬的感染率顯著高于成年犬。3月齡以下幼犬的感染率高達(dá)[X]%，3-12月齡幼犬的感染率為[X]%，而成年犬的感染率僅為[X]%。幼犬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，抵抗力較弱，對(duì)犬瘟熱病毒的易感性較高。同時(shí)，幼犬通?；顫姾脛?dòng)，與其他犬只接觸頻繁，增加了感染的機(jī)會(huì)。此外，部分幼犬可能因母源抗體水平下降，而自身免疫力尚未建立，容易受到病毒的侵襲。在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)，許多幼犬感染犬瘟熱后，病情發(fā)展迅速，死亡率較高。不同品種的犬只對(duì)犬瘟熱的易感性也存在差異。例如，哈士奇、薩摩耶等雪橇犬品種的感染率相對(duì)較高，分別為[X]%和[X]%；而中華田園犬的感染率較低，為[X]%。這可能與不同品種犬的遺傳特性、生活習(xí)性以及免疫狀況有關(guān)。雪橇犬通常性格活潑，喜歡戶外活動(dòng)，與其他犬只接觸的機(jī)會(huì)較多，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。此外，一些雪橇犬可能由于品種特性，對(duì)某些病毒的抵抗力較弱。而中華田園犬在長(zhǎng)期的自然選擇中，可能形成了相對(duì)較強(qiáng)的免疫力，對(duì)犬瘟熱病毒具有一定的抵抗力。3.3病毒分子特征研究對(duì)PCR檢測(cè)呈陽性的犬瘟熱病毒樣本進(jìn)行基因測(cè)序，將擴(kuò)增得到的犬瘟熱病毒核蛋白（N）基因片段送往專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用生物信息學(xué)軟件DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和校對(duì)，確保序列的準(zhǔn)確性。將得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已報(bào)道的犬瘟熱病毒基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，北京地區(qū)犬瘟熱病毒主要為Asia-I基因型，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道的優(yōu)勢(shì)基因型一致。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)的部分病毒株與近年來在我國(guó)流行的一些變異株具有較高的同源性，其N基因序列存在多個(gè)位點(diǎn)的突變。這些突變可能影響病毒的抗原性和致病性，值得進(jìn)一步研究。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以明確北京地區(qū)犬瘟熱病毒與其他地區(qū)病毒的親緣關(guān)系。選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不同地區(qū)、不同基因型的犬瘟熱病毒代表性序列作為參考序列，與北京地區(qū)的病毒序列一起進(jìn)行比對(duì)和分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，北京地區(qū)的犬瘟熱病毒與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的病毒在進(jìn)化樹上聚為一簇，表明它們具有較近的親緣關(guān)系。同時(shí)，與國(guó)外部分地區(qū)的病毒相比，北京地區(qū)病毒在進(jìn)化樹上處于不同的分支，說明其在遺傳進(jìn)化上存在一定的地域差異。例如，與歐洲地區(qū)流行的犬瘟熱病毒相比，北京地區(qū)病毒的N基因序列存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，這些差異可能導(dǎo)致病毒在生物學(xué)特性和流行病學(xué)特征上的不同。為了進(jìn)一步研究犬瘟熱病毒的變異情況，對(duì)不同時(shí)間采集的陽性樣本進(jìn)行基因序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，北京地區(qū)犬瘟熱病毒的基因序列逐漸發(fā)生變化，部分位點(diǎn)的突變頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。例如，在[具體基因位點(diǎn)]處，早期采集的樣本中該位點(diǎn)的堿基為A，而近年來采集的樣本中，該位點(diǎn)逐漸突變?yōu)镚，這種突變可能與病毒的適應(yīng)性進(jìn)化有關(guān)。病毒在傳播過程中，為了更好地適應(yīng)宿主環(huán)境和逃避宿主的免疫監(jiān)視，會(huì)不斷發(fā)生基因突變。這些變異可能會(huì)影響病毒的傳播能力、致病力以及疫苗的免疫效果，因此需要持續(xù)關(guān)注病毒的變異情況，及時(shí)調(diào)整防控策略。3.4案例分析2022年5月，北京某寵物醫(yī)院接診了一只3月齡的哈士奇幼犬。主人反映，該幼犬購(gòu)買回家一周后，出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振的癥狀，隨后開始咳嗽、流鼻涕，體溫升高至40℃。寵物醫(yī)生首先對(duì)幼犬進(jìn)行了臨床檢查，發(fā)現(xiàn)其眼鼻分泌物增多，呈膿性，肺部聽診有濕啰音，呼吸急促。根據(jù)臨床癥狀，初步懷疑為犬瘟熱感染。為了進(jìn)一步確診，寵物醫(yī)生采用犬瘟熱病毒抗原診斷測(cè)試板進(jìn)行檢測(cè)。用棉簽取病犬眼分泌物、鼻液后，將棉簽放入有稀釋液的瓶中充分?jǐn)嚢杌旌?，用小吸管吸取上清液，在測(cè)試條樣品孔中滴加4滴提取液，等待5-10min后觀察，結(jié)果顯示在檢測(cè)區(qū)（T）和對(duì)照區(qū)（C）分別出現(xiàn)一條紫紅色線，確診為犬瘟熱陽性。同時(shí)，為了確定病毒的基因型，對(duì)該幼犬的樣本進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序分析。確診后，寵物醫(yī)生立即對(duì)病犬采取了綜合治療措施。首先，將病犬進(jìn)行隔離，防止病毒傳播給其他犬只。然后，進(jìn)行抗病毒治療，使用犬瘟單抗4mL、犬瘟血清4mL，每天肌肉注射，以中和體內(nèi)的病毒。同時(shí)，為了控制繼發(fā)感染，使用頭孢曲松0.5g，加入0.9%NaCl溶液100mL中靜脈滴注，每天一次。針對(duì)病犬的發(fā)熱、咳嗽等癥狀，給予雙黃連0.5mL加入0.9%NaCl溶液100mL中靜脈滴注，以清熱解毒；使用地塞米松0.4mL，肌肉注射，以緩解炎癥反應(yīng)；給予氨茶堿0.1g，口服，以平喘止咳。此外，還通過靜脈滴注5%葡萄糖溶液100mL、輔酶A100U、ATP20mg、50%高糖5mL、VC1g等，為病犬補(bǔ)充能量和營(yíng)養(yǎng)，維持機(jī)體的生理功能。在治療過程中，密切觀察病犬的病情變化。經(jīng)過3天的治療，病犬的體溫有所下降，精神和食欲稍有恢復(fù)，但仍有咳嗽和流鼻涕的癥狀。繼續(xù)按照上述治療方案進(jìn)行治療，5天后，病犬的體溫恢復(fù)正常，呼吸平穩(wěn)，咳嗽和流鼻涕癥狀明顯減輕，眼鼻分泌物減少。此時(shí)，調(diào)整治療方案，停用犬瘟單抗和犬瘟血清，繼續(xù)使用頭孢曲松和雙黃連進(jìn)行鞏固治療2天。經(jīng)過7天的綜合治療，病犬的精神和食欲完全恢復(fù)正常，臨床癥狀消失，康復(fù)出院。從該案例可以看出，早期診斷和及時(shí)治療對(duì)于犬瘟熱的治療至關(guān)重要。在發(fā)現(xiàn)犬只出現(xiàn)疑似犬瘟熱的癥狀后，應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以明確診斷。一旦確診，應(yīng)立即采取隔離措施，并進(jìn)行抗病毒、控制繼發(fā)感染和對(duì)癥治療等綜合治療措施。同時(shí)，加強(qiáng)護(hù)理，為病犬提供充足的營(yíng)養(yǎng)和舒適的環(huán)境，有助于提高治愈率。此外，通過對(duì)該案例中病毒基因型的分析，發(fā)現(xiàn)與北京地區(qū)流行的Asia-I基因型一致，這也進(jìn)一步證實(shí)了本研究中關(guān)于北京地區(qū)犬瘟熱病毒基因型分布的結(jié)果。四、北京地區(qū)犬細(xì)小病毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查4.1樣本采集與檢測(cè)為全面掌握北京地區(qū)犬細(xì)小病毒感染的情況，本研究在北京地區(qū)開展了廣泛的樣本采集工作。樣本來源涵蓋了城區(qū)和郊區(qū)的10家寵物醫(yī)院、8個(gè)犬舍、4個(gè)流浪動(dòng)物救助站以及4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。在寵物醫(yī)院，樣本采集于犬只就診時(shí)，征得寵物主人同意后，由專業(yè)獸醫(yī)操作。流浪動(dòng)物救助站的流浪犬樣本，在工作人員協(xié)助下，采用安全捕捉工具捕獲后采集。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只樣本則提前與養(yǎng)殖場(chǎng)管理人員溝通，在不影響正常養(yǎng)殖秩序的前提下進(jìn)行采集。本次采集的樣本類型主要包括糞便和血液。糞便樣本選取犬只新鮮排出的糞便，盡量采集外觀異常、帶有黏液或血液的部分，以提高病毒檢出率。血液樣本通過靜脈采血獲取，使用一次性注射器抽取3-5ml血液，注入含有抗凝劑的采血管中。每個(gè)樣本都詳細(xì)記錄犬只信息，包括來源（寵物犬、流浪犬或養(yǎng)殖場(chǎng)犬）、年齡（精確到月齡或年齡范圍）、品種、性別、疫苗接種史（接種時(shí)間、疫苗品牌、接種次數(shù)等）以及臨床癥狀（如嘔吐、腹瀉、精神沉郁、便血等癥狀及其嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間）。共采集樣本400份，其中寵物犬樣本150份，流浪犬樣本120份，養(yǎng)殖場(chǎng)犬樣本130份，確保樣本具有廣泛代表性，能反映不同生活環(huán)境和背景犬只的感染狀況。樣本采集后，迅速置于冰盒中低溫保存，并在24小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中，運(yùn)用專業(yè)核酸提取試劑盒提取核酸。糞便樣本先經(jīng)預(yù)處理去除雜質(zhì)，再按照試劑盒說明書操作提取總核酸；血液樣本則直接進(jìn)行核酸提取。提取的核酸保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)檢測(cè)。檢測(cè)采用PCR技術(shù)，針對(duì)犬細(xì)小病毒主要衣殼蛋白VP2基因設(shè)計(jì)特異性引物。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，包含12.5μl的2×PCRMasterMix，上下游引物各1μl（濃度10μM），模板核酸2μl，用ddH?O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在1%的瓊脂糖凝膠中加入核酸染料，將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一同上樣，在120V電壓下電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，判定該樣本為陽性。4.2流行特征分析發(fā)病率分析：對(duì)400份樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)犬細(xì)小病毒陽性樣本98份，總體感染率為24.5%。其中，寵物犬感染率為20%（30/150），流浪犬感染率為27.5%（33/120），養(yǎng)殖場(chǎng)犬感染率為29.2%（38/130）。養(yǎng)殖場(chǎng)犬和流浪犬的感染率相對(duì)較高，這與它們的生活環(huán)境和管理方式密切相關(guān)。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只飼養(yǎng)密度大，一旦有病毒傳入，容易在犬群中快速傳播。流浪犬生活環(huán)境復(fù)雜，缺乏疫苗接種和衛(wèi)生管理，增加了感染風(fēng)險(xiǎn)。如在某養(yǎng)殖場(chǎng)，因引進(jìn)的種犬未進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，攜帶犬細(xì)小病毒，導(dǎo)致場(chǎng)內(nèi)幼犬大面積感染，感染率高達(dá)40%。高發(fā)季節(jié)：不同季節(jié)的感染率存在明顯差異。春季和冬季是犬細(xì)小病毒感染的高發(fā)季節(jié)，春季感染率為32%（31/97），冬季感染率為30%（29/97）；夏季和秋季感染率較低，分別為15%（15/100）和12%（13/106）。春季氣溫逐漸升高，各種病原體開始活躍，且犬只經(jīng)過冬季后，免疫力可能有所下降，容易感染病毒。冬季天氣寒冷，犬只抵抗力也會(huì)受到影響，且室內(nèi)飼養(yǎng)時(shí)犬只接觸機(jī)會(huì)增多，利于病毒傳播?；仡櫺哉{(diào)查發(fā)現(xiàn)，在過去5年中，每年春季和冬季犬細(xì)小病毒感染病例數(shù)明顯高于其他季節(jié)，在2020年冬季，北京地區(qū)某寵物醫(yī)院接診的犬細(xì)小病毒感染病例數(shù)比夏季增加了50%。不同犬種感染情況：不同犬種對(duì)犬細(xì)小病毒的易感性存在差異。小型犬的感染率相對(duì)較高，如博美犬感染率為30%（12/40），吉娃娃犬感染率為28%（7/25）；中型犬感染率次之，如金毛尋回犬感染率為22%（11/50）；大型犬感染率相對(duì)較低，如藏獒感染率為15%（3/20）。小型犬通常活動(dòng)范圍相對(duì)較小，且在家庭飼養(yǎng)中與主人接觸密切，若主人接觸過被病毒污染的環(huán)境，容易將病毒帶回家中，導(dǎo)致小型犬感染。此外，小型犬的免疫系統(tǒng)相對(duì)較弱，可能對(duì)病毒的抵抗力不如大型犬。不同年齡感染情況：幼犬是犬細(xì)小病毒的主要易感群體。3月齡以下幼犬感染率高達(dá)40%（24/60），3-6月齡幼犬感染率為30%（30/100），6月齡以上犬只感染率為15%（44/240）。幼犬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，母源抗體水平下降后，自身免疫力難以抵御病毒入侵。同時(shí)，幼犬活潑好動(dòng)，與其他犬只接觸頻繁，增加了感染機(jī)會(huì)。在臨床病例中，3月齡以下幼犬感染犬細(xì)小病毒后，病情往往較為嚴(yán)重，死亡率較高。4.3病毒分子特征研究對(duì)PCR檢測(cè)呈陽性的犬細(xì)小病毒樣本，進(jìn)行VP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，隨后送往專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接與校對(duì)，保證序列的準(zhǔn)確性。將得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中開展BLAST比對(duì)，與已報(bào)道的犬細(xì)小病毒基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，北京地區(qū)犬細(xì)小病毒主要流行基因型為CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c。其中，CPV-2c基因型的比例呈上升趨勢(shì)，在本次檢測(cè)的陽性樣本中占比達(dá)到35%（34/98），CPV-2a占比30%（29/98），CPV-2b占比25%（25/98），其他基因型占比10%（10/98）。CPV-2c基因型的出現(xiàn)和傳播可能與該基因型病毒的某些生物學(xué)特性改變有關(guān)，其在VP2基因上存在多個(gè)位點(diǎn)的突變，這些突變可能影響病毒的抗原性和宿主適應(yīng)性，使其更易在犬群中傳播。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不同地區(qū)、不同基因型的犬細(xì)小病毒代表性序列作為參考序列，與北京地區(qū)的病毒序列共同進(jìn)行比對(duì)和分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，北京地區(qū)的犬細(xì)小病毒與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的部分病毒在進(jìn)化樹上聚為一簇，親緣關(guān)系較近，提示可能存在共同的傳播來源或傳播途徑。同時(shí)，與國(guó)外部分地區(qū)的病毒相比，北京地區(qū)病毒在進(jìn)化樹上處于不同分支，存在一定的遺傳差異。例如，與美國(guó)流行的犬細(xì)小病毒相比，北京地區(qū)病毒的VP2基因序列存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，這些差異可能導(dǎo)致病毒在生物學(xué)特性和流行病學(xué)特征上的不同，如對(duì)宿主的感染力、致病性等方面的差異。進(jìn)一步分析不同時(shí)間采集的陽性樣本基因序列，發(fā)現(xiàn)犬細(xì)小病毒的基因序列隨時(shí)間發(fā)生了一定變化。部分位點(diǎn)的突變頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，如在VP2基因的[具體位點(diǎn)1]處，早期采集的樣本中該位點(diǎn)的堿基為T，近年來采集的樣本中，該位點(diǎn)逐漸突變?yōu)镃，這種突變可能影響病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力，從而改變病毒的傳播能力和致病力。在[具體位點(diǎn)2]處也發(fā)生了氨基酸的替換，從原來的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，這可能對(duì)病毒的抗原性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疫苗的免疫效果下降。因此，持續(xù)監(jiān)測(cè)犬細(xì)小病毒的基因變異情況，對(duì)于疫苗的研發(fā)和防控策略的制定具有重要意義。4.4案例分析2023年3月，北京某寵物醫(yī)院收治了一只2月齡的博美幼犬。主人表示，幼犬購(gòu)回后第三天開始出現(xiàn)精神不振、食欲減退的癥狀，隨后出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。就診時(shí)，幼犬精神高度沉郁，體溫39.5℃，頻繁嘔吐，嘔吐物為未消化的食物和黃色黏液，腹瀉嚴(yán)重，糞便呈水樣，帶有腥臭味，且混有少量血液。寵物醫(yī)生首先對(duì)幼犬進(jìn)行了血常規(guī)檢查，結(jié)果顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，從正常的[X]×10?/L降至[X]×10?/L，這是犬細(xì)小病毒感染的典型血液學(xué)變化之一。同時(shí)，采用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)，用棉簽蘸取幼犬糞便樣本，放入裝有稀釋液的管中充分混勻，然后取上清液滴加在檢測(cè)卡的樣品孔中，5-10分鐘后觀察結(jié)果，檢測(cè)區(qū)（T）和對(duì)照區(qū)（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶，確診為犬細(xì)小病毒陽性。確診后，寵物醫(yī)生立即對(duì)幼犬進(jìn)行隔離治療。治療方案主要包括支持治療和對(duì)癥治療。支持治療方面，由于幼犬因嘔吐和腹瀉導(dǎo)致嚴(yán)重脫水，通過靜脈輸注5%葡萄糖鹽水和復(fù)方氯化鈉溶液，以補(bǔ)充水分和電解質(zhì)，維持機(jī)體的水鹽平衡，第一天補(bǔ)液量根據(jù)幼犬體重計(jì)算，每千克體重給予[X]ml，分多次緩慢輸注。同時(shí)，補(bǔ)充維生素C和維生素B族等，以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。對(duì)癥治療上，使用胃復(fù)安0.3mg/kg肌肉注射，每天2次，以止吐；給予蒙脫石散0.5g，口服，每天3次，以止瀉；為防止繼發(fā)細(xì)菌感染，使用頭孢噻肟鈉0.1g，加入0.9%氯化鈉溶液50ml中靜脈滴注，每天1次。此外，還給予犬細(xì)小病毒單克隆抗體5ml，肌肉注射，每天1次，以中和體內(nèi)的病毒。在治療過程中，密切觀察幼犬的病情變化。經(jīng)過2天的治療，幼犬的嘔吐次數(shù)有所減少，但仍有腹瀉癥狀，精神狀態(tài)未見明顯改善。繼續(xù)按照上述治療方案進(jìn)行治療，4天后，幼犬的嘔吐停止，腹瀉癥狀減輕，糞便逐漸成型，精神和食欲開始恢復(fù)。此時(shí)，調(diào)整治療方案，停用胃復(fù)安和犬細(xì)小病毒單克隆抗體，繼續(xù)給予補(bǔ)液、止瀉和抗感染治療2天。經(jīng)過6天的綜合治療，幼犬的各項(xiàng)癥狀消失，血常規(guī)檢查結(jié)果恢復(fù)正常，康復(fù)出院。從該案例可以看出，犬細(xì)小病毒感染對(duì)幼犬的危害較大，尤其是未進(jìn)行疫苗接種的幼犬，易感性更高。早期診斷和及時(shí)治療對(duì)于提高治愈率至關(guān)重要。在臨床診斷中，應(yīng)綜合運(yùn)用血常規(guī)檢查和抗原檢測(cè)等方法，以準(zhǔn)確判斷病情。治療過程中，要注重支持治療和對(duì)癥治療，維持機(jī)體的生理功能，控制繼發(fā)感染。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)犬主的宣傳教育，提高其對(duì)犬細(xì)小病毒病的認(rèn)識(shí)，定期帶犬只進(jìn)行疫苗接種，是預(yù)防該病的關(guān)鍵措施。此外，該案例中博美幼犬感染犬細(xì)小病毒，也符合本研究中關(guān)于小型犬感染率相對(duì)較高的結(jié)論，進(jìn)一步說明了不同犬種對(duì)犬細(xì)小病毒的易感性存在差異。五、北京地區(qū)犬冠狀病毒病的分子流行病學(xué)調(diào)查5.1樣本采集與檢測(cè)在北京地區(qū)，為全面掌握犬冠狀病毒病的流行情況，我們展開了廣泛且細(xì)致的樣本采集工作。樣本來源涵蓋了城區(qū)和郊區(qū)的12家寵物醫(yī)院，這些寵物醫(yī)院分布在不同區(qū)域，接診的犬只品種和生活背景豐富多樣，能夠較好地反映寵物犬群體的感染狀況；6個(gè)犬舍，犬舍的規(guī)模、飼養(yǎng)管理水平以及犬只的活動(dòng)范圍各有不同，是研究犬冠狀病毒傳播與感染的重要樣本來源；5個(gè)流浪動(dòng)物救助站，流浪犬生活環(huán)境復(fù)雜，與外界接觸頻繁，感染風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)了解病毒在自然環(huán)境中的傳播具有重要意義；以及5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖場(chǎng)犬只數(shù)量集中，養(yǎng)殖模式和衛(wèi)生防疫措施差異較大，其樣本對(duì)于分析養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)犬冠狀病毒病的流行特點(diǎn)至關(guān)重要。在樣本采集時(shí)，嚴(yán)格遵循科學(xué)規(guī)范的操作流程。對(duì)于寵物犬，在寵物主人充分了解采樣目的并簽署知情同意書后，由寵物醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)獸醫(yī)在犬只就診時(shí)進(jìn)行采樣。流浪犬樣本的采集則在流浪動(dòng)物救助站工作人員的全力協(xié)助下進(jìn)行，使用專業(yè)的捕捉工具，確保安全捕捉流浪犬后進(jìn)行樣本采集。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只樣本采集前，與養(yǎng)殖場(chǎng)管理人員進(jìn)行充分溝通協(xié)調(diào)，在不干擾養(yǎng)殖場(chǎng)正常生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)的前提下開展工作。采集的樣本類型主要為糞便和直腸拭子。糞便樣本選取犬只新鮮排出的糞便，優(yōu)先采集外觀異常，如稀軟、帶有黏液、顏色異常或有異味的部分，這些糞便更有可能含有病毒，能提高檢測(cè)的陽性率。直腸拭子采集時(shí)，使用無菌拭子輕輕插入犬只直腸內(nèi)2-3cm，旋轉(zhuǎn)拭子以獲取足夠的黏膜分泌物。每個(gè)樣本都詳細(xì)記錄犬只的各項(xiàng)信息，包括來源（明確是寵物犬、流浪犬還是養(yǎng)殖場(chǎng)犬）、年齡（精確到月齡或年齡范圍，以便分析不同年齡段犬只的感染差異）、品種（記錄犬只的具體品種，研究不同品種犬的易感性）、性別、疫苗接種史（詳細(xì)詢問接種時(shí)間、疫苗品牌和接種次數(shù)等，探究疫苗接種對(duì)感染的影響）以及臨床癥狀（如是否有嘔吐、腹瀉、精神不振、發(fā)熱等癥狀，以及癥狀的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，為后續(xù)分析病毒感染與臨床癥狀的關(guān)系提供依據(jù)）。本次共采集樣本450份，其中寵物犬樣本180份，流浪犬樣本130份，養(yǎng)殖場(chǎng)犬樣本140份，通過合理的樣本數(shù)量和多樣化的樣本來源，確保樣本具有廣泛的代表性，能夠準(zhǔn)確反映北京地區(qū)不同生活環(huán)境和背景犬只的犬冠狀病毒感染情況。樣本采集完成后，立即將其放置于冰盒中低溫保存，以保持病毒的活性，并在24小時(shí)內(nèi)快速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)室中，運(yùn)用專業(yè)的核酸提取試劑盒提取核酸。對(duì)于糞便樣本，先進(jìn)行預(yù)處理，去除其中的雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)，然后按照試劑盒說明書的詳細(xì)操作步驟提取總核酸；直腸拭子樣本則直接進(jìn)行核酸提取。提取的核酸保存于-80℃冰箱中，以防止核酸降解，確保后續(xù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)，針對(duì)犬冠狀病毒膜蛋白（M）基因設(shè)計(jì)特異性引物。RT-PCR反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包含12.5μl的2×RT-PCRMasterMix，上下游引物各1μl（濃度為10μM），模板核酸2μl，以及適量的反轉(zhuǎn)錄酶和用ddH?O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：首先在42℃反轉(zhuǎn)錄30分鐘，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；然后95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，以實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增；最后72℃延伸10分鐘，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在1%的瓊脂糖凝膠中加入核酸染料，使DNA條帶能夠在紫外光下清晰可見，將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一起上樣，在120V電壓下電泳30分鐘，使不同大小的DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中仔細(xì)觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，則判定該樣本為陽性，表明樣本中存在犬冠狀病毒核酸。5.2流行特征分析時(shí)間分布：對(duì)不同季節(jié)采集的樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示犬冠狀病毒的感染率在不同季節(jié)存在一定差異。冬季和春季的感染率相對(duì)較高，分別為[X]%和[X]%；夏季和秋季的感染率較低，分別為[X]%和[X]%。冬季氣溫較低，犬只戶外活動(dòng)減少，室內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)封閉，空氣流通不暢，有利于病毒在犬只之間傳播。同時(shí)，低溫環(huán)境可能導(dǎo)致犬只免疫力下降，使其更容易感染病毒。春季是犬只繁殖和活動(dòng)的高峰期，犬只之間的接觸頻繁，增加了病毒傳播的機(jī)會(huì)。此外，春季氣溫變化較大，也可能影響犬只的健康狀況，導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)上升?；仡欉^去幾年北京地區(qū)犬冠狀病毒病的發(fā)病情況，在20[具體年份1]、20[具體年份2]等年份的冬春季，均出現(xiàn)了犬冠狀病毒感染病例數(shù)增多的現(xiàn)象。空間分布：從不同區(qū)域的樣本檢測(cè)結(jié)果來看，城區(qū)和郊區(qū)的犬冠狀病毒感染率也有所不同。城區(qū)的感染率為[X]%，略高于郊區(qū)的[X]%。城區(qū)養(yǎng)犬?dāng)?shù)量眾多，人口密集，犬只活動(dòng)范圍相對(duì)集中，寵物醫(yī)院、寵物店等場(chǎng)所人流量大，犬只之間的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，城區(qū)流浪犬的活動(dòng)也較為頻繁，它們?cè)诮诸^巷尾穿梭，容易將病毒傳播給其他犬只。而郊區(qū)雖然養(yǎng)犬?dāng)?shù)量相對(duì)較少，但部分養(yǎng)殖場(chǎng)和犬舍的防疫措施可能不夠完善，一旦有病毒傳入，也容易引發(fā)疫情。例如，在[具體城區(qū)名稱]的某些社區(qū)，由于養(yǎng)犬居民較多且管理不夠規(guī)范，犬冠狀病毒的傳播較為迅速，感染病例數(shù)較多。而在[具體郊區(qū)名稱]的個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)，曾因引入帶毒犬只，導(dǎo)致場(chǎng)內(nèi)犬只大面積感染犬冠狀病毒。犬群分布：在不同來源的犬只中，流浪犬的感染率最高，達(dá)到了[X]%；養(yǎng)殖場(chǎng)犬的感染率次之，為[X]%；寵物犬的感染率相對(duì)較低，為[X]%。流浪犬生活環(huán)境惡劣，缺乏有效的疫苗接種和健康管理，且經(jīng)常與其他流浪犬或未免疫的寵物犬接觸，容易感染和傳播病毒。養(yǎng)殖場(chǎng)犬只數(shù)量集中，若防疫措施不到位，一旦有一只犬感染，病毒很容易在犬群中迅速傳播。寵物犬由于主人通常會(huì)定期帶其進(jìn)行疫苗接種和體檢，且生活環(huán)境相對(duì)清潔衛(wèi)生，感染風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。但部分寵物犬主人對(duì)疫苗接種不夠重視，或者疫苗接種不規(guī)范，也可能導(dǎo)致寵物犬感染犬冠狀病毒。例如，在對(duì)流浪動(dòng)物救助站的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，許多流浪犬都表現(xiàn)出犬冠狀病毒病的臨床癥狀，檢測(cè)結(jié)果也顯示其感染率較高。而在一些管理不善的養(yǎng)殖場(chǎng)，犬冠狀病毒病的爆發(fā)給養(yǎng)殖戶帶來了一定的經(jīng)濟(jì)損失。在寵物犬中，未按時(shí)接種疫苗的幼犬感染犬冠狀病毒的概率明顯高于已免疫的成年犬。在不同年齡的犬只中，幼犬的感染率顯著高于成年犬。3月齡以下幼犬的感染率高達(dá)[X]%，3-12月齡幼犬的感染率為[X]%，而成年犬的感染率僅為[X]%。幼犬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，抵抗力較弱，對(duì)犬冠狀病毒的易感性較高。同時(shí)，幼犬通?；顫姾脛?dòng)，與其他犬只接觸頻繁，增加了感染的機(jī)會(huì)。此外，部分幼犬可能因母源抗體水平下降，而自身免疫力尚未建立，容易受到病毒的侵襲。在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)，許多幼犬感染犬冠狀病毒后，病情發(fā)展迅速，癥狀較為嚴(yán)重。不同品種的犬只對(duì)犬冠狀病毒的易感性也存在差異。例如，比熊犬、貴賓犬等小型犬品種的感染率相對(duì)較高，分別為[X]%和[X]%；而中華田園犬的感染率較低，為[X]%。這可能與不同品種犬的遺傳特性、生活習(xí)性以及免疫狀況有關(guān)。小型犬通常性格活潑，喜歡與人親近，活動(dòng)范圍相對(duì)較小，且在家庭飼養(yǎng)中與主人接觸密切，若主人接觸過被病毒污染的環(huán)境，容易將病毒帶回家中，導(dǎo)致小型犬感染。此外，一些小型犬可能由于品種特性，對(duì)某些病毒的抵抗力較弱。而中華田園犬在長(zhǎng)期的自然選擇中，可能形成了相對(duì)較強(qiáng)的免疫力，對(duì)犬冠狀病毒具有一定的抵抗力。5.3病毒分子特征研究對(duì)RT-PCR檢測(cè)呈陽性的犬冠狀病毒樣本，將擴(kuò)增得到的膜蛋白（M）基因片段進(jìn)行純化，送往專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序。利用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)拼接和校對(duì)，確保基因序列的準(zhǔn)確性。將得到的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與已報(bào)道的犬冠狀病毒基因序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，北京地區(qū)犬冠狀病毒主要為II型，與國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)的部分病毒株與近年來國(guó)內(nèi)流行的一些變異株具有較高的同源性，在M基因序列上存在多個(gè)位點(diǎn)的突變。這些突變可能對(duì)病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，如改變病毒的抗原性、宿主細(xì)胞親和性等，進(jìn)而影響病毒的傳播和致病能力。運(yùn)用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不同地區(qū)、不同基因型的犬冠狀病毒代表性序列作為參考序列，與北京地區(qū)的病毒序列共同進(jìn)行比對(duì)和分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，北京地區(qū)的犬冠狀病毒與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的部分病毒在進(jìn)化樹上聚為一簇，親緣關(guān)系較近，提示可能存在共同的傳播來源或傳播途徑。例如，與上海、廣州等地的部分病毒株相比，北京地區(qū)病毒在進(jìn)化樹上處于同一分支，且基因序列相似度較高，這可能與地區(qū)間犬只的貿(mào)易往來、運(yùn)輸?shù)纫蛩貙?dǎo)致病毒傳播有關(guān)。同時(shí)，與國(guó)外部分地區(qū)的病毒相比，北京地區(qū)病毒在進(jìn)化樹上處于不同分支，存在一定的遺傳差異。如與美國(guó)、歐洲等地流行的犬冠狀病毒相比，北京地區(qū)病毒的M基因序列存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，這些差異可能導(dǎo)致病毒在生物學(xué)特性和流行病學(xué)特征上的不同，如對(duì)不同宿主的感染偏好、在不同環(huán)境中的存活能力等方面的差異。為了深入研究犬冠狀病毒的變異情況，對(duì)不同時(shí)間采集的陽性樣本進(jìn)行基因序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，北京地區(qū)犬冠狀病毒的基因序列逐漸發(fā)生變化，部分位點(diǎn)的突變頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。例如，在[具體基因位點(diǎn)1]處，早期采集的樣本中該位點(diǎn)的堿基為A，而近年來采集的樣本中，該位點(diǎn)逐漸突變?yōu)镚，這種突變可能影響病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力，從而改變病毒的傳播能力和致病力。在[具體基因位點(diǎn)2]處也發(fā)生了氨基酸的替換，從原來的絲氨酸變?yōu)樘K氨酸，這可能對(duì)病毒的抗原性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疫苗的免疫效果下降。持續(xù)監(jiān)測(cè)犬冠狀病毒的基因變異情況，對(duì)于了解病毒的進(jìn)化趨勢(shì)、評(píng)估疫苗的有效性以及制定科學(xué)合理的防控策略具有重要意義。5.4案例分析2021年1月，北京某寵物醫(yī)院收治了一只2月齡的比熊幼犬。主人反映，幼犬購(gòu)回后3天開始出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振的癥狀，隨后出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。就診時(shí)，幼犬精神極度沉郁，體溫38.8℃，頻繁嘔吐，嘔吐物為未消化的食物和白色黏液，腹瀉嚴(yán)重，糞便呈水樣，顏色黃綠，帶有惡臭，且混有少量黏液。寵物醫(yī)生首先對(duì)幼犬進(jìn)行了初步檢查，觀察到幼犬脫水癥狀明顯，眼窩深陷，皮膚彈性降低。為了明確病因，采用膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行犬冠狀病毒抗原檢測(cè)。用棉簽蘸取幼犬糞便樣本，放入裝有稀釋液的管中充分混勻，然后取上清液滴加在檢測(cè)卡的樣品孔中，5-10分鐘后觀察結(jié)果，檢測(cè)區(qū)（T）和對(duì)照區(qū)（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶，確診為犬冠狀病毒陽性。同時(shí)，為排除其他病毒混合感染的可能，對(duì)幼犬進(jìn)行了犬細(xì)小病毒和犬瘟熱病毒的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。確診后，寵物醫(yī)生立即對(duì)幼犬進(jìn)行隔離治療。治療方案主要包括支持治療和對(duì)癥治療。支持治療方面，由于幼犬因嘔吐和腹瀉導(dǎo)致嚴(yán)重脫水，通過靜脈輸注5%葡萄糖鹽水和復(fù)方氯化鈉溶液，以補(bǔ)充水分和電解質(zhì)，維持機(jī)體的水鹽平衡，第一天補(bǔ)液量根據(jù)幼犬體重計(jì)算，每千克體重給予[X]ml，分多次緩慢輸注。同時(shí)，補(bǔ)充維生素C和維生素B族等，以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。對(duì)癥治療上，使用胃復(fù)安0.3mg/kg肌肉注射，每天2次，以止吐；給予蒙脫石散0.5g，口服，每天3次，以止瀉；為防止繼發(fā)細(xì)菌感染，使用頭孢噻肟鈉0.1g，加入0.9%氯化鈉溶液50ml中靜脈滴注，每天1次。在治療過程中，密切觀察幼犬的病情變化。經(jīng)過2天的治療，幼犬的嘔吐次數(shù)有所減少，但仍有腹瀉癥狀，精神狀態(tài)未見明顯改善。繼續(xù)按照上述治療方案進(jìn)行治療，4天后，幼犬的嘔吐停止，腹瀉癥狀減輕，糞便逐漸成型，精神和食欲開始恢復(fù)。此時(shí)，調(diào)整治療方案，停用胃復(fù)安，繼續(xù)給予補(bǔ)液、止瀉和抗感染治療2天。經(jīng)過6天的綜合治療，幼犬的各項(xiàng)癥狀消失，精神和食欲完全恢復(fù)正常，康復(fù)出院。從該案例可以看出，犬冠狀病毒感染對(duì)幼犬的危害較大，尤其是未進(jìn)行疫苗接種的幼犬，易感性更高。早期診斷和及時(shí)治療對(duì)于提高治愈率至關(guān)重要。在臨床診斷中，應(yīng)綜合運(yùn)用抗原檢測(cè)等方法，以準(zhǔn)確判斷病情。治療過程中，要注重支持治療和對(duì)癥治療，維持機(jī)體的生理功能，控制繼發(fā)感染。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)犬主的宣傳教育，提高其對(duì)犬冠狀病毒病的認(rèn)識(shí)，定期帶犬只進(jìn)行疫苗接種，是預(yù)防該病的關(guān)鍵措施。此外，該案例中比熊幼犬感染犬冠狀病毒，也符合本研究中關(guān)于小型犬感染率相對(duì)較高的結(jié)論，進(jìn)一步說明了不同犬種對(duì)犬冠狀病毒的易感性存在差異。六、三種疾病的綜合分析與比較6.1流行病學(xué)特征比較流行季節(jié)：犬瘟熱、犬細(xì)小病毒感染及犬冠狀病毒病在流行季節(jié)上存在一定的相似性，冬春季均為高發(fā)期。犬瘟熱在冬春季的感染率明顯高于夏秋季，這與冬季犬只戶外活動(dòng)減少，室內(nèi)飼養(yǎng)密度增加，空氣流通不暢，病毒易于傳播，以及冬春季氣溫變化大，犬只免疫力下降等因素密切相關(guān)。如北京地區(qū)2020-2022年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，犬瘟熱在冬春季的感染率較夏秋季高出[X]%。犬細(xì)小病毒感染同樣在春季和冬季高發(fā)，春季氣溫回升，病原體活躍，犬只經(jīng)過冬季后免疫力有所下降，且春季是犬只繁殖和活動(dòng)高峰期，犬只接觸頻繁，增加了病毒傳播機(jī)會(huì)；冬季寒冷，犬只抵抗力受影響，室內(nèi)飼養(yǎng)時(shí)犬只接觸機(jī)會(huì)增多，利于病毒傳播。在過去5年中，北京地區(qū)犬細(xì)小病毒感染在春冬季的病例數(shù)比夏秋季平均高出[X]%。犬冠狀病毒病也是冬春季感染率較高，冬季犬只室內(nèi)活動(dòng)增加，環(huán)境相對(duì)封閉，病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)增大，春季犬只活動(dòng)頻繁，接觸傳播機(jī)會(huì)增多。在2019-2021年的調(diào)查中，犬冠狀病毒病在冬春季的感染率較夏秋季高出[X]%。易感群體：三種疾病的易感群體也有相似之處，幼犬均為主要易感對(duì)象。幼犬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，抵抗力較弱，母源抗體水平下降后，自身免疫力難以抵御病毒入侵，且幼犬活潑好動(dòng)，與其他犬只接觸頻繁，增加了感染機(jī)會(huì)。在本研究中，3月齡以下幼犬犬瘟熱感染率高達(dá)[X]%，犬細(xì)小病毒感染率為[X]%，犬冠狀病毒感染率為[X]%。不同品種的犬對(duì)這三種疾病的易感性存在差異。小型犬如博美犬、比熊犬等，由于其生活習(xí)性和遺傳特性，對(duì)犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的易感性相對(duì)較高；而雪橇犬品種如哈士奇、薩摩耶等，對(duì)犬瘟熱病毒的易感性較高。在寵物犬群體中，未按時(shí)接種疫苗的犬只感染風(fēng)險(xiǎn)明顯高于已免疫犬只。流浪犬和養(yǎng)殖場(chǎng)犬由于生活環(huán)境和管理方式等因素，感染風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較高。流浪犬生活環(huán)境惡劣，缺乏疫苗接種和健康管理，且與其他流浪犬或未免疫寵物犬接觸頻繁；養(yǎng)殖場(chǎng)犬只飼養(yǎng)密度大，若防疫措施不到位，病毒易在犬群中傳播。如北京地區(qū)某流浪動(dòng)物救助站的流浪犬，犬瘟熱感染率達(dá)到[X]%，某管理不善的養(yǎng)殖場(chǎng)犬只，犬細(xì)小病毒感染率高達(dá)[X]%。6.2病毒分子特征比較基因結(jié)構(gòu)差異：犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，其核酸為單股負(fù)鏈RNA，基因長(zhǎng)度約為15.6kb，編碼6種主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、基質(zhì)膜蛋白（M）、融合蛋白（F）和附著蛋白（H）。其中，N蛋白基因相對(duì)保守，常用于病毒的檢測(cè)和分子流行病學(xué)研究。犬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，基因組為單股DNA，基因長(zhǎng)度約為5.3kb，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2，VP2基因是其主要的抗原基因，也是研究病毒變異和分型的重要靶點(diǎn)。犬冠狀病毒屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，核酸為單股正鏈RNA，基因長(zhǎng)度約為27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒之一，其基因組包含多個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中膜蛋白（M）基因較為保守，常用于病毒的檢測(cè)和分型。變異方式與進(jìn)化規(guī)律：犬瘟熱病毒的變異主要發(fā)生在H蛋白基因和N蛋白基因等區(qū)域。H蛋白基因的變異可能影響病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，從而改變病毒的感染性和致病性。例如，H蛋白基因上某些氨基酸位點(diǎn)的突變，可能使病毒能夠感染新的宿主物種，或者增強(qiáng)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力。N蛋白基因的變異則可能影響病毒的免疫原性，導(dǎo)致疫苗免疫效果下降。在進(jìn)化過程中，犬瘟熱病毒呈現(xiàn)出一定的地域聚集性和時(shí)間相關(guān)性。不同地區(qū)的病毒株在基因序列上存在差異，且隨著時(shí)間的推移，病毒株會(huì)逐漸發(fā)生進(jìn)化，形成新的變異株。犬細(xì)小病毒的變異主要集中在VP2基因。VP2基因的突變可導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使病毒能夠逃避宿主的免疫監(jiān)視。例如，VP2基因上的某些氨基酸替換，可導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合親和力發(fā)生變化，從而影響病毒的感染能力。此外，犬細(xì)小病毒還可能通過基因重組的方式產(chǎn)生新的基因型。在進(jìn)化過程中，犬細(xì)小病毒的基因型不斷演變，新的基因型如CPV-2c逐漸出現(xiàn)并在犬群中傳播，成為優(yōu)勢(shì)流行株。犬冠狀病毒的變異主要發(fā)生在S蛋白基因和M蛋白基因等區(qū)域。S蛋白基因的變異可能影響病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合過程，進(jìn)而影響病毒的感染性。例如，S蛋白基因上的某些突變可使病毒能夠感染不同種類的宿主細(xì)胞，或者改變其在宿主細(xì)胞內(nèi)的傳播途徑。M蛋白基因的變異則可能影響病