Tiam1基因沉默：開啟結(jié)腸癌淋巴管生成機制與抗癌新策略的探索一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在我國，結(jié)腸癌已躍居為第四大常見惡性腫瘤，且每年以一定比例的增幅持續(xù)攀升。結(jié)腸癌不僅會導(dǎo)致患者排便習(xí)慣和性狀的改變，還會引發(fā)腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、便血、消瘦、乏力等一系列癥狀，極大地影響患者的生活質(zhì)量。更為嚴(yán)重的是，作為一種惡性腫瘤，結(jié)腸癌還嚴(yán)重威脅患者的生存時間。在結(jié)腸癌的發(fā)展進程中，淋巴管生成和轉(zhuǎn)移扮演著極為關(guān)鍵的角色。淋巴管生成是指在已有淋巴管的基礎(chǔ)上生成新的淋巴管的過程。腫瘤細胞通過誘導(dǎo)淋巴管生成，為自身的轉(zhuǎn)移開辟了道路。當(dāng)腫瘤細胞侵入新生的淋巴管后，會隨淋巴液流動，進而轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)，甚至遠處淋巴結(jié)。一旦發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌的嚴(yán)重程度會顯著增加。如果是局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，雖然仍有根治的可能，但也給治療帶來了更大的挑戰(zhàn)；而遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或多發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則意味著癌癥已進入晚期，此時治療難度大幅提升，患者預(yù)后相對較差。除了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移外，結(jié)腸癌還可能通過血行轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦等部位，或通過播種轉(zhuǎn)移至腹膜、腹腔等部位，進一步危及患者生命。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因1（Tiam1），是從BW5147小鼠的T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離克隆出來的，其編碼產(chǎn)物屬于Dbl家族成員，是一種鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子（GEFs）。GEFs主要功能是調(diào)節(jié)Rho家族活性，Rho家族包括Rho、Rac和Cdc42，是Ras超家族的成員，參與細胞骨架形成，在調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)重組、細胞周期進程、基因表達調(diào)控、細胞遷移和粘附等細胞生命活動中起重要作用。多項研究表明，Tiam1基因在正常鼠腦和睪丸組織中高表達，在其他正常組織中低表達或不表達，而在所有的腫瘤細胞系中都表達。在結(jié)腸癌中，Tiam1基因的異常表達可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1可以特異的激活與Rac相關(guān)的通路，改變腫瘤細胞形態(tài)和功能，對腫瘤的分化、侵襲及轉(zhuǎn)移有重要作用。目前，關(guān)于Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用機制尚不完全明確。深入研究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響，不僅有助于揭示結(jié)腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的分子機制，為理解結(jié)腸癌的發(fā)病機理提供新的視角，還可能為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點和策略。通過抑制Tiam1基因的表達，有可能阻斷或減少結(jié)腸癌的淋巴管生成，從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2Tiam1基因與結(jié)腸癌淋巴管生成的研究現(xiàn)狀近年來，Tiam1基因在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了顯著進展。大量研究表明，Tiam1基因在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，Tiam1基因的過表達可促進癌細胞的遷移和侵襲能力，通過激活Rac1信號通路，重塑細胞骨架，增強細胞的運動性，從而增加乳腺癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Tiam1基因表達水平與肺癌的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達Tiam1的肺癌患者預(yù)后往往較差。這些研究提示Tiam1基因在腫瘤的發(fā)展進程中扮演著重要角色。在結(jié)腸癌研究方面，Tiam1基因也受到了廣泛關(guān)注。已有研究證實，Tiam1基因在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織。其高表達與結(jié)腸癌的臨床病理特征，如腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。通過對不同分期結(jié)腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的升高，Tiam1基因的表達水平也逐漸升高，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中，Tiam1基因的表達顯著高于未轉(zhuǎn)移患者。這表明Tiam1基因可能在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于Tiam1基因與結(jié)腸癌淋巴管生成的關(guān)系，目前也有一些相關(guān)研究。血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）是目前已知的最重要的淋巴管生成因子之一，其通過與血管內(nèi)皮生長因子受體-3（VEGFR-3）結(jié)合，激活下游信號通路，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導(dǎo)淋巴管生成。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺癌中，Tiam1、VEGF-C和VEGFR-3的表達均呈正相關(guān)。Tiam1可能通過某種機制調(diào)節(jié)VEGF-C/VEGFR-3信號通路，進而影響結(jié)腸癌的淋巴管生成。然而，具體的調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚，仍有待進一步深入研究。盡管目前對Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用有了一定的認識，但仍存在許多不足之處。一方面，Tiam1基因影響結(jié)腸癌淋巴管生成的具體分子機制尚未完全明確。雖然推測其可能與VEGF-C/VEGFR-3信號通路有關(guān)，但Tiam1基因是如何調(diào)控該信號通路的，是否還存在其他的作用靶點和信號途徑，這些問題都有待進一步探索。另一方面，目前的研究大多集中在細胞實驗和動物模型上，在臨床應(yīng)用方面的研究還相對較少。如何將Tiam1基因作為結(jié)腸癌治療的潛在靶點，開發(fā)有效的治療策略，仍需要更多的臨床研究來驗證和完善。此外，Tiam1基因與其他基因或蛋白之間的相互作用在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用也研究甚少，這也為今后的研究提出了新的方向。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探討Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響及其潛在分子機制，為結(jié)腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目的如下：明確Tiam1基因在結(jié)腸癌組織及細胞中的表達情況：通過檢測Tiam1基因在不同分期結(jié)腸癌組織以及結(jié)腸癌細胞系中的表達水平，分析其表達與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，進一步揭示Tiam1基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。研究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞淋巴管生成相關(guān)能力的影響：利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建Tiam1基因沉默的結(jié)腸癌細胞模型，觀察沉默Tiam1基因后，結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲等能力以及對淋巴管內(nèi)皮細胞的趨化作用的變化，從細胞水平闡明Tiam1基因?qū)Y(jié)腸癌淋巴管生成的影響。探究Tiam1基因沉默影響結(jié)腸癌淋巴管生成的分子機制：重點研究Tiam1基因沉默后，VEGF-C/VEGFR-3信號通路以及其他相關(guān)信號通路的變化，明確Tiam1基因在這些信號通路中的作用節(jié)點，揭示Tiam1基因影響結(jié)腸癌淋巴管生成的具體分子機制。評估Tiam1基因作為結(jié)腸癌治療靶點的潛在價值：通過體內(nèi)動物實驗，驗證Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，為將Tiam1基因開發(fā)為結(jié)腸癌治療的新靶點提供實驗依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：研究角度創(chuàng)新：以往對Tiam1基因在腫瘤中的研究多集中在其對腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的直接影響，而本研究聚焦于Tiam1基因?qū)Y(jié)腸癌淋巴管生成的作用，從淋巴管生成這一全新角度深入探究Tiam1基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究提供了新的思路。研究方法創(chuàng)新：綜合運用多種先進的實驗技術(shù)，如RNA干擾技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、細胞共培養(yǎng)技術(shù)以及動物模型構(gòu)建技術(shù)等，從細胞水平和動物整體水平全面系統(tǒng)地研究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響，使研究結(jié)果更具說服力。潛在應(yīng)用價值創(chuàng)新：本研究若能明確Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的關(guān)鍵作用及分子機制，將為結(jié)腸癌的治療提供一個全新的靶點。基于此，可以開發(fā)針對Tiam1基因的靶向治療藥物或治療策略，有望打破傳統(tǒng)治療方法的局限，為結(jié)腸癌患者帶來更有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用前景。二、Tiam1基因與結(jié)腸癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Tiam1基因概述1994年，Habets等學(xué)者從鼠的T淋巴瘤中成功分離克隆出Tiam1基因，這一發(fā)現(xiàn)開啟了對該基因研究的大門。人的Tiam1基因定位于染色體21q22.11，其長度為5521個堿基。Tiam1基因編碼的蛋白質(zhì)由1591個氨基酸組成，屬于Dbl家族成員，是一種鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子（GEFs）。Tiam1蛋白包含多個重要的功能區(qū)，其C端存在DH（DblHomology）和PHc（PleckstrinHomology）功能區(qū)。其中，DH區(qū)由200個氨基酸殘基構(gòu)成，能夠直接作用于RhoGTPase，在催化鳥氨酸GDP/GTP的轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PHc區(qū)則由100個氨基酸殘基組成，與DH區(qū)緊密相連，它通過與特定的脂質(zhì)相互作用，實現(xiàn)Tiam1在胞膜上的定位。在N端，存在PHn、CC（coiled-coil）、EX（undefinedregion）結(jié)構(gòu)區(qū)。其中，PHn-CC-EX這3個區(qū)在功能上相互協(xié)同，共同促進Tiam1在質(zhì)膜上的定位。此外，Tiam1蛋白的N末端還存在myristoylation位點，以及DHR（DlgHomologousRegion，也稱為PDZ）、RBD（raf-likeras-bindingdomain）功能區(qū)。這些功能區(qū)的存在，使得Tiam1蛋白能夠參與多種細胞活動的調(diào)控。在正常組織中，Tiam1蛋白呈現(xiàn)出特定的表達模式。研究表明，其在腦和睪丸組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，而在其他組織中，表達則受到高度限制，處于低表達或不表達的狀態(tài)。然而，在腫瘤細胞中，Tiam1基因的表達情況發(fā)生了顯著變化。通過對來源于人和嚙齒類腫瘤源性的40多個細胞系的檢測發(fā)現(xiàn)，Tiam1在所有的腫瘤細胞系中均有表達。在多種惡性腫瘤，如神經(jīng)母細胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等細胞系中，都能檢測到Tiam1的表達。與正常組織相比，腫瘤細胞中Tiam1基因的高表達具有重要的生物學(xué)意義。在腫瘤細胞中，Tiam1高表達能持續(xù)活化Rho樣蛋白，這一過程促進了彈力纖維的形成以及病灶粘附復(fù)合物的形成。彈力纖維為腫瘤細胞提供了更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支撐，而病灶粘附復(fù)合物則增強了腫瘤細胞與周圍組織的粘附能力，使得腫瘤細胞更容易突破組織屏障，向周圍組織浸潤。Tiam1表達產(chǎn)物還能促進整合素介導(dǎo)的異型細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的相互作用。整合素是一類細胞表面受體，在細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Tiam1通過調(diào)節(jié)整合素的功能，進一步增強了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。2.2結(jié)腸癌淋巴管生成機制在結(jié)腸癌的發(fā)展進程中，淋巴管生成是一個至關(guān)重要的過程，其涉及一系列復(fù)雜的分子和細胞事件。正常情況下，淋巴管在維持組織液平衡、免疫監(jiān)視等生理功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，在腫瘤微環(huán)境中，癌細胞能夠誘導(dǎo)淋巴管生成，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供通道。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族在結(jié)腸癌淋巴管生成中扮演著核心角色，其中VEGF-C和VEGF-D是目前研究最為深入的淋巴管生成因子。VEGF-C和VEGF-D主要通過與血管內(nèi)皮生長因子受體-3（VEGFR-3）結(jié)合來發(fā)揮作用。VEGFR-3是一種受體酪氨酸激酶，主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞表面。當(dāng)VEGF-C或VEGF-D與VEGFR-3結(jié)合后，會激活VEGFR-3的酪氨酸激酶活性，使其自身磷酸化。這一磷酸化過程會引發(fā)一系列下游信號通路的激活，包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。在PI3K/Akt通路中，PI3K被激活后，會將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活A(yù)kt，Akt進一步磷酸化下游的多種底物，如雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等。mTOR的激活能夠促進細胞的增殖、存活和代謝，從而促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和存活。在MAPK通路中，VEGFR-3的激活會導(dǎo)致Ras蛋白的活化，進而依次激活Raf、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，會進入細胞核，調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖、遷移和分化相關(guān)的基因表達，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。除了VEGF-C/D-VEGFR-3信號通路外，其他一些信號通路也參與了結(jié)腸癌淋巴管生成的調(diào)節(jié)。例如，成纖維細胞生長因子（FGF）家族成員FGF-2也被發(fā)現(xiàn)能夠促進淋巴管生成。FGF-2可以與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的成纖維細胞生長因子受體（FGFR）結(jié)合，激活下游的信號通路，如MAPK通路、PI3K/Akt通路等，從而促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。血小板衍生生長因子（PDGF）家族中的PDGF-BB也在淋巴管生成中發(fā)揮作用。PDGF-BB與淋巴管內(nèi)皮細胞表面的PDGF受體（PDGFR）結(jié)合后，能夠激活PI3K/Akt等信號通路，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的存活和增殖。腫瘤微環(huán)境中的其他細胞和分子也對結(jié)腸癌淋巴管生成產(chǎn)生影響。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細胞，它們可以分泌多種細胞因子和生長因子，如VEGF-C、VEGF-D、FGF-2等，促進淋巴管生成。腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）同樣能夠分泌VEGF-C、PDGF-BB等因子，調(diào)節(jié)淋巴管生成。此外，缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在缺氧條件下會被穩(wěn)定表達。HIF-1α可以結(jié)合到VEGF-C和VEGF-D基因的啟動子區(qū)域，促進其轉(zhuǎn)錄和表達，進而增強淋巴管生成。2.3Tiam1基因與結(jié)腸癌淋巴管生成的潛在聯(lián)系Tiam1基因作為一種鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，其與結(jié)腸癌淋巴管生成之間存在著潛在的緊密聯(lián)系，可能通過多種途徑影響結(jié)腸癌淋巴管生成。從細胞骨架調(diào)節(jié)角度來看，Tiam1基因編碼的蛋白可特異性激活Rac1，而Rac1作為Rho家族小GTP酶的重要成員，在細胞骨架重組中扮演關(guān)鍵角色。當(dāng)Tiam1激活Rac1后，Rac1會促使肌動蛋白聚合，形成絲狀偽足和片狀偽足等結(jié)構(gòu)。在腫瘤細胞中，這些細胞骨架結(jié)構(gòu)的改變能夠增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，與淋巴管內(nèi)皮細胞相互作用。研究表明，在多種腫瘤細胞系中，上調(diào)Tiam1表達會導(dǎo)致Rac1活性增強，細胞骨架重排，細胞遷移能力顯著提高。而在結(jié)腸癌中，腫瘤細胞的遷移和侵襲是淋巴管生成的前期重要步驟。腫瘤細胞通過釋放各種細胞因子和趨化因子，吸引淋巴管內(nèi)皮細胞向其靠攏，進而促進淋巴管生成。如果Tiam1基因異常表達，過度激活Rac1，導(dǎo)致腫瘤細胞遷移和侵襲能力增強，就可能會加速這一過程，促進結(jié)腸癌淋巴管生成。在信號通路調(diào)控方面，Tiam1基因可能參與多條與結(jié)腸癌淋巴管生成相關(guān)的信號通路。其中，Tiam1-Rac1信號通路與PI3K/Akt信號通路存在相互作用。當(dāng)Tiam1激活Rac1后，活化的Rac1可以激活PI3K，進而使Akt磷酸化激活。Akt作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵蛋白，其激活后可以調(diào)節(jié)下游一系列與細胞增殖、存活、遷移相關(guān)的蛋白表達。在淋巴管生成過程中，Akt的激活能夠促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的淋巴管內(nèi)皮細胞中，通過激活Tiam1-Rac1信號通路，能夠顯著增強Akt的磷酸化水平，促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖和管腔形成。這表明Tiam1基因可能通過Tiam1-Rac1-PI3K/Akt信號通路，間接調(diào)控結(jié)腸癌淋巴管生成。Tiam1基因還可能與VEGF-C/VEGFR-3信號通路存在關(guān)聯(lián)。VEGF-C是目前已知的最重要的淋巴管生成因子之一，其通過與VEGFR-3結(jié)合，激活下游信號通路，促進淋巴管生成。雖然具體機制尚不完全明確，但有研究推測，Tiam1基因可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞中VEGF-C的表達或其信號通路的活性，來影響結(jié)腸癌淋巴管生成。在一些腫瘤模型中，抑制Tiam1基因表達后，發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達水平也隨之下降，同時淋巴管生成受到抑制。這提示Tiam1基因可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控VEGF-C的表達，從而影響結(jié)腸癌淋巴管生成。此外，Tiam1基因還可能通過影響腫瘤微環(huán)境中其他細胞因子和生長因子的表達和分泌，間接調(diào)節(jié)VEGF-C/VEGFR-3信號通路，進而影響淋巴管生成。三、研究設(shè)計與方法3.1實驗材料準(zhǔn)備本研究中，選用人結(jié)腸癌細胞系HT29作為實驗細胞。HT29細胞系是1964年由FoghJ用移植培養(yǎng)方法和含15%FBS的F12培養(yǎng)從原發(fā)性腫瘤分離得到的。該細胞系在裸鼠中成瘤，也能在類固醇處理的地鼠中成瘤。選用HT29細胞系的原因在于其廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌相關(guān)研究，具有明確的生物學(xué)特性和穩(wěn)定的遺傳背景，能夠較好地模擬結(jié)腸癌的生物學(xué)行為。實驗動物方面，采用4-5周齡的雄性BALB/c裸鼠。裸鼠由于缺乏胸腺，細胞免疫功能缺陷，不會對移植的人結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，因此適合用于構(gòu)建結(jié)腸癌動物模型。在實驗前，裸鼠需在特定的無特定病原體（SPF）環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50%±10%，并提供12h光照/12h黑暗的循環(huán)環(huán)境。給予裸鼠無菌的飼料和飲用水，確保實驗動物的健康狀態(tài)，以減少實驗誤差。實驗所需的主要試劑如下：Tiam1-siRNA及陰性對照siRNA：由專業(yè)的生物公司合成。Tiam1-siRNA用于沉默Tiam1基因的表達，陰性對照siRNA則用于排除非特異性干擾。在設(shè)計Tiam1-siRNA時，通過生物信息學(xué)分析，選取了Tiam1基因的關(guān)鍵序列，以確保能夠高效地抑制Tiam1基因的表達。陰性對照siRNA的序列與Tiam1基因無同源性，但其堿基組成和長度與Tiam1-siRNA相似。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑：購自Invitrogen公司。該試劑是一種高效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)iRNA等核酸分子高效地導(dǎo)入細胞中。其作用原理是通過脂質(zhì)體與核酸分子形成復(fù)合物，然后與細胞膜融合，將核酸分子釋放到細胞內(nèi)。RPMI1640培養(yǎng)基：購自Gibco公司。RPMI1640培養(yǎng)基是一種常用的細胞培養(yǎng)基，含有多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠為HT29細胞的生長和增殖提供適宜的環(huán)境。在使用前，需向培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的雙抗（青霉素-鏈霉素），以提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和防止細胞污染。胎牛血清（FBS）：購自Gibco公司。FBS富含多種生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長、增殖和存活。在細胞培養(yǎng)過程中，F(xiàn)BS的質(zhì)量對細胞的生長狀態(tài)和實驗結(jié)果有著重要的影響，因此選用高質(zhì)量的FBS至關(guān)重要。雙抗（青霉素-鏈霉素）：購自Gibco公司。雙抗能夠抑制細菌的生長，防止細胞培養(yǎng)過程中的污染。在培養(yǎng)基中添加雙抗時，需按照一定的比例進行添加，以確保既能有效地抑制細菌生長，又不會對細胞產(chǎn)生毒性。MTT試劑：購自Sigma公司。MTT是一種黃色的四氮唑鹽，能夠被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）。通過檢測MTT還原產(chǎn)物的量，可以間接反映細胞的增殖活性。在實驗中，將MTT試劑加入到細胞培養(yǎng)體系中，孵育一定時間后，去除上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚結(jié)晶，然后在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，從而評估細胞的增殖情況。Transwell小室：購自Corning公司。Transwell小室是一種常用的細胞遷移和侵襲實驗工具，由上下兩個室組成，中間用一層具有通透性的膜隔開。在上室中加入細胞懸液，下室中加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細胞會受到趨化因子的吸引，穿過膜向低濃度的下室遷移。通過檢測遷移到下室的細胞數(shù)量，可以評估細胞的遷移能力。在侵襲實驗中，需要在膜上預(yù)先包被基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境，細胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過膜，從而檢測細胞的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠：購自BD公司。Matrigel基質(zhì)膠是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的細胞外基質(zhì)成分，主要含有層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。在細胞侵襲實驗中，將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的膜上，能夠模擬體內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境，細胞需要分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠，才能穿過膜進行侵襲。兔抗人Tiam1多克隆抗體：購自Abcam公司。該抗體能夠特異性地識別Tiam1蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫組織化學(xué)（IHC）實驗中，以檢測Tiam1蛋白的表達水平。在Westernblot實驗中，通過將細胞或組織中的蛋白質(zhì)進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用兔抗人Tiam1多克隆抗體進行孵育，再用相應(yīng)的二抗進行檢測，最后通過化學(xué)發(fā)光法檢測Tiam1蛋白的條帶，從而分析其表達水平。在IHC實驗中，將組織切片進行抗原修復(fù)和封閉后，用兔抗人Tiam1多克隆抗體進行孵育，再用二抗和顯色劑進行檢測，觀察Tiam1蛋白在組織中的表達定位和強度。鼠抗人VEGF-C單克隆抗體：購自SantaCruz公司。VEGF-C是淋巴管生成的關(guān)鍵因子之一，鼠抗人VEGF-C單克隆抗體可用于檢測VEGF-C蛋白的表達水平，探究Tiam1基因沉默對VEGF-C表達的影響。在實驗中，同樣可采用Westernblot和IHC等方法，利用該抗體檢測VEGF-C蛋白在細胞和組織中的表達變化。鼠抗人VEGFR-3單克隆抗體：購自SantaCruz公司。VEGFR-3是VEGF-C的受體，在淋巴管生成過程中發(fā)揮重要作用。通過使用鼠抗人VEGFR-3單克隆抗體，可檢測VEGFR-3蛋白的表達情況，分析Tiam1基因沉默對VEGFR-3表達的影響，進而探討Tiam1基因與VEGF-C/VEGFR-3信號通路的關(guān)系。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG：購自JacksonImmunoResearch公司。這兩種二抗分別與兔抗人Tiam1多克隆抗體和鼠抗人VEGF-C、VEGFR-3單克隆抗體結(jié)合，用于Westernblot和IHC實驗中的信號檢測。在Westernblot實驗中，二抗上的HRP能夠催化底物發(fā)光，從而檢測到目標(biāo)蛋白的條帶；在IHC實驗中，二抗與一抗結(jié)合后，通過顯色劑的作用，使目標(biāo)蛋白在組織切片上呈現(xiàn)出特定的顏色，便于觀察和分析。DAB顯色試劑盒：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。在IHC實驗中，DAB顯色試劑盒用于將HRP催化的底物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可見的棕色沉淀，從而顯示出目標(biāo)蛋白在組織切片上的表達位置和強度。DAB顯色的原理是HRP催化DAB底物發(fā)生氧化反應(yīng)，生成不溶性的棕色產(chǎn)物，通過顯微鏡觀察棕色沉淀的分布情況，即可判斷目標(biāo)蛋白的表達情況。Trizol試劑：購自Invitrogen公司。Trizol試劑是一種常用的總RNA提取試劑，能夠快速、有效地從細胞或組織中提取總RNA。其原理是利用Trizol試劑中的苯酚和異硫氰酸胍等成分，裂解細胞并使核酸蛋白復(fù)合物解離，然后通過氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，獲得高質(zhì)量的總RNA。提取的總RNA可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等實驗，以檢測基因的表達水平。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：購自TaKaRa公司。該試劑盒用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行后續(xù)的PCR擴增。逆轉(zhuǎn)錄過程是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成cDNA的過程。TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒具有高效、穩(wěn)定的特點，能夠保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進行，獲得高質(zhì)量的cDNA。PCR試劑盒：購自TaKaRa公司。PCR試劑盒包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等。利用該試劑盒，可以對逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR擴增，從而檢測Tiam1基因及相關(guān)基因的mRNA表達水平。在PCR反應(yīng)中，通過設(shè)計特異性的引物，能夠擴增出目標(biāo)基因的特定片段，然后通過瓊脂糖凝膠電泳等方法，檢測擴增產(chǎn)物的大小和含量，分析基因的表達情況。主要儀器設(shè)備包括：CO?培養(yǎng)箱：購自ThermoFisherScientific公司。CO?培養(yǎng)箱為細胞提供了一個適宜的體外培養(yǎng)環(huán)境，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度。其中，溫度一般設(shè)置為37℃，模擬人體的體溫環(huán)境；濕度保持在95%以上，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；CO?濃度通常設(shè)置為5%，用于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定。在CO?培養(yǎng)箱中，細胞能夠在穩(wěn)定的環(huán)境中生長、增殖，保證實驗的順利進行。超凈工作臺：購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。超凈工作臺為細胞操作提供了一個無菌的工作環(huán)境，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，確保操作區(qū)域的潔凈度達到100級。在超凈工作臺內(nèi)進行細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染等操作，可以有效避免細胞受到污染，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。倒置顯微鏡：購自O(shè)lympus公司。倒置顯微鏡用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況。通過將顯微鏡的物鏡置于載物臺下方，能夠方便地觀察培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞。在實驗中，定期使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，如細胞的大小、形狀、貼壁情況等，以及細胞的生長密度和增殖速度，及時調(diào)整實驗條件。酶標(biāo)儀：購自Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀可用于檢測MTT實驗中的吸光度值，從而評估細胞的增殖活性。在MTT實驗結(jié)束后，將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置特定的波長（通常為570nm），酶標(biāo)儀能夠測量各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值的大小判斷細胞的增殖情況。此外，酶標(biāo)儀還可用于其他酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等實驗，檢測樣品中的蛋白質(zhì)、抗體等物質(zhì)的含量。離心機：購自Eppendorf公司。離心機用于細胞和組織的離心分離，如收集細胞、分離細胞碎片、提取蛋白質(zhì)和核酸等。根據(jù)實驗需求，可選擇不同類型的離心機，如低速離心機、高速離心機和超速離心機等。在細胞實驗中，常用低速離心機進行細胞的收集和洗滌，高速離心機用于蛋白質(zhì)和核酸的分離。離心機的轉(zhuǎn)速和離心時間可根據(jù)實驗要求進行調(diào)整，以達到最佳的分離效果。電泳儀：購自Bio-Rad公司。電泳儀用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離。在蛋白質(zhì)電泳中，利用電泳儀將蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小和電荷性質(zhì)，使其在電場中遷移不同的距離，從而實現(xiàn)分離。在核酸電泳中，同樣利用電泳儀將DNA或RNA樣品在瓊脂糖凝膠中進行分離，根據(jù)核酸的大小和電荷性質(zhì)進行分離。電泳結(jié)束后，通過染色等方法，可觀察到蛋白質(zhì)或核酸的條帶分布情況，用于分析樣品的純度和含量。凝膠成像系統(tǒng)：購自Bio-Rad公司。凝膠成像系統(tǒng)用于拍攝和分析電泳后的凝膠圖像。在蛋白質(zhì)和核酸電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，系統(tǒng)能夠?qū)δz進行拍照，并通過軟件對圖像進行分析，如測量條帶的強度、分子量等參數(shù)。凝膠成像系統(tǒng)具有高分辨率、靈敏度和準(zhǔn)確性的特點，能夠清晰地顯示凝膠上的條帶信息，為實驗結(jié)果的分析提供有力的支持。PCR儀：購自AppliedBiosystems公司。PCR儀用于進行PCR擴增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)的溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。在PCR反應(yīng)中，將cDNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶等反應(yīng)成分加入到PCR管中，放入PCR儀中進行擴增。PCR儀按照預(yù)設(shè)的程序，在不同的溫度下進行變性、退火和延伸反應(yīng)，使目標(biāo)基因得到擴增。通過調(diào)整PCR儀的參數(shù)，可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，提高擴增效率和特異性。3.2Tiam1基因沉默載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染在本研究中，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)構(gòu)建Tiam1基因沉默載體，通過合成小干擾RNA（siRNA）來特異性地沉默Tiam1基因的表達。首先，根據(jù)Tiam1基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001127359），利用在線設(shè)計軟件（如Ambion公司的siRNA設(shè)計工具）設(shè)計針對Tiam1基因的siRNA序列。設(shè)計時遵循以下原則：選擇位于Tiam1基因編碼區(qū)的序列，避開5'和3'非翻譯區(qū)；序列長度為19-21個核苷酸，GC含量在30%-50%之間；避免連續(xù)的相同堿基以及內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。經(jīng)過篩選和分析，最終確定了3條潛在有效的Tiam1-siRNA序列，并交由專業(yè)的生物公司合成。同時，合成一條與Tiam1基因無同源性的陰性對照siRNA序列，用于排除非特異性干擾。這3條Tiam1-siRNA序列分別為：siRNA-1：5'-GCCUCAUUGCUGUUCUUCUTT-3'（正義鏈），5'-AGAAGAACAGCAAUGAGGCTT-3'（反義鏈）；siRNA-2：5'-GCAUGACUACUUGCUGAAUTT-3'（正義鏈），5'-AUUCAGCAAGUAGUCAUGCTT-3'（反義鏈）；siRNA-3：5'-GAAGGACUACUGCCUGAAUTT-3'（正義鏈），5'-AUUCAGGCAGUAGUCCUUCTT-3'（反義鏈）。陰性對照siRNA序列為：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'（正義鏈），5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'（反義鏈）。在構(gòu)建好Tiam1基因沉默載體后，需要將其轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞中。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：在轉(zhuǎn)染前1天，將處于對數(shù)生長期的HT29細胞以合適的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到60%-70%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，首先準(zhǔn)備2個無菌的EP管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入適量的Opti-MEM培養(yǎng)基（不含血清和抗生素），然后加入一定量的Tiam1-siRNA或陰性對照siRNA，輕輕混勻。在B管中加入適量的Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入適量的Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。將A管和B管中的液體混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使siRNA與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞2次，然后每孔加入1.5mL不含血清和抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基。將孵育好的siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后48小時和72小時，分別收集細胞，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測Tiam1基因的沉默效率，篩選出沉默效果最佳的Tiam1-siRNA序列用于后續(xù)實驗。3.3實驗分組與處理本實驗共設(shè)置以下4組：正常細胞組：選取正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460作為正常對照。將NCM460細胞接種于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。該組作為正常參照，用于對比分析結(jié)腸癌細胞在各實驗處理下的生物學(xué)特性變化。正常結(jié)腸上皮細胞在正常生理狀態(tài)下，具有穩(wěn)定的細胞形態(tài)、增殖速率和基因表達模式。通過將實驗組與正常細胞組進行比較，可以清晰地觀察到Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞的影響，明確Tiam1基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。未轉(zhuǎn)染的癌細胞組：將人結(jié)腸癌細胞系HT29接種于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不進行任何轉(zhuǎn)染處理。此組用于觀察未經(jīng)過基因干預(yù)的結(jié)腸癌細胞的自然生長狀態(tài)和生物學(xué)特性，作為后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗的基礎(chǔ)對照。在未轉(zhuǎn)染的情況下，HT29細胞按照自身的基因調(diào)控模式進行生長、增殖和代謝，其Tiam1基因正常表達。通過對該組細胞的觀察和檢測，可以了解到結(jié)腸癌細胞在正?；虮磉_背景下的各項生物學(xué)指標(biāo)，為分析轉(zhuǎn)染后細胞的變化提供基線數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組：將處于對數(shù)生長期的HT29細胞以合適的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到60%-70%時，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞中。陰性對照siRNA的序列與Tiam1基因無同源性，但其堿基組成和長度與Tiam1-siRNA相似，用于排除轉(zhuǎn)染試劑本身以及非特異性RNA干擾對實驗結(jié)果的影響。在轉(zhuǎn)染過程中，陰性對照siRNA與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物，然后被細胞攝取。由于陰性對照siRNA不會對Tiam1基因的表達產(chǎn)生影響，因此該組細胞的Tiam1基因表達水平應(yīng)與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相似。通過對比轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組和未轉(zhuǎn)染的癌細胞組，可以確定轉(zhuǎn)染試劑以及轉(zhuǎn)染過程本身是否對細胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生了非特異性影響。轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組：將篩選出的沉默效果最佳的Tiam1-siRNA按照上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HT29細胞中，以實現(xiàn)Tiam1基因的沉默。在轉(zhuǎn)染后48小時和72小時，分別收集細胞，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測Tiam1基因的沉默效率，確保Tiam1基因表達被有效抑制。在該組中，Tiam1-siRNA進入細胞后，會與Tiam1基因的mRNA結(jié)合，通過RNA干擾機制使其降解，從而抑制Tiam1蛋白的表達。通過對該組細胞的研究，可以深入了解Tiam1基因沉默后對結(jié)腸癌細胞淋巴管生成相關(guān)能力以及分子機制的影響。在細胞培養(yǎng)過程中，每隔24小時使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況。當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，進行細胞傳代。傳代時，先用PBS清洗細胞2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細胞大部分變圓并脫落時，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3或1:4的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。3.4檢測指標(biāo)與方法Tiam1基因沉默效果檢測：在轉(zhuǎn)染Tiam1-siRNA或陰性對照siRNA后的48小時和72小時，分別收集各組細胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測Tiam1基因的mRNA表達水平。首先，使用Trizol試劑提取細胞中的總RNA，按照試劑盒說明書的步驟進行操作，確保提取的RNA純度和完整性。然后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用Tiam1基因特異性引物進行PCR擴增。引物序列根據(jù)Tiam1基因的mRNA序列設(shè)計，上游引物為5'-ATGCCCTACAAGGACATCAA-3'，下游引物為5'-CTTCTCTGGGTCTTCAGCTC-3'。同時，以β-actin作為內(nèi)參基因，其上游引物為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析Tiam1基因mRNA的表達水平。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測Tiam1蛋白的表達水平。收集細胞后，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜用5%的脫脂牛奶封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，加入兔抗人Tiam1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3次，每次10分鐘，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析Tiam1蛋白的表達水平。細胞增殖能力檢測：采用MTT比色法檢測各組細胞的增殖能力。將處于對數(shù)生長期的各組細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在接種后的24小時、48小時、72小時和96小時進行檢測。檢測時，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4小時后，吸出上清液，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。然后在酶標(biāo)儀上測定490nm處的吸光度（OD）值，以O(shè)D值表示細胞的增殖活性。根據(jù)不同時間點的OD值繪制細胞生長曲線，分析Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響。細胞遷移和侵襲能力檢測：使用Transwell小室檢測各組細胞的遷移和侵襲能力。在遷移實驗中，將Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基，下室加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，作為趨化因子。將處于對數(shù)生長期的各組細胞用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入上室。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。24小時后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室用甲醇固定15分鐘，再用結(jié)晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量，取平均值，以細胞數(shù)量表示細胞的遷移能力。在侵襲實驗中，預(yù)先將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室，按照1:8的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，每孔加入100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。然后按照遷移實驗的方法，將細胞懸液加入上室，下室加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，按照遷移實驗的步驟進行固定、染色和計數(shù)，以細胞數(shù)量表示細胞的侵襲能力。淋巴管生成相關(guān)指標(biāo)檢測：利用免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測結(jié)腸癌組織及細胞中淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達，如Podoplanin、LYVE-1等。對于結(jié)腸癌組織標(biāo)本，首先將石蠟切片進行脫蠟、水化處理，然后進行抗原修復(fù)。用3%的過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用正常山羊血清封閉30分鐘，以減少非特異性染色。加入兔抗人Podoplanin多克隆抗體（1:200稀釋）或鼠抗人LYVE-1單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（1:500稀釋），室溫孵育1小時。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，最后加入DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以陽性細胞的數(shù)量和染色強度表示淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達水平。對于細胞標(biāo)本，將細胞接種于玻片上，培養(yǎng)至合適密度后，用4%的多聚甲醛固定15分鐘，然后按照組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)步驟進行操作，檢測淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物在細胞中的表達。采用免疫熒光染色法進一步觀察淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物在細胞中的定位。將細胞接種于玻片上，培養(yǎng)至合適密度后，用4%的多聚甲醛固定15分鐘，然后用0.1%的TritonX-100處理10分鐘，以增加細胞膜的通透性。用5%的牛血清白蛋白封閉30分鐘，以減少非特異性染色。加入兔抗人Podoplanin多克隆抗體（1:200稀釋）或鼠抗人LYVE-1單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌玻片3次，每次5分鐘，然后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG或TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:500稀釋），室溫避光孵育1小時。再次用PBS緩沖液洗滌玻片3次，每次5分鐘，最后用DAPI染核，封片。在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以綠色或紅色熒光表示淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的定位。通過圖像分析軟件測定結(jié)腸癌組織中微淋巴管密度（MLD）。首先在低倍鏡（4×物鏡）下全面觀察組織切片，選擇淋巴管密度較高的區(qū)域，然后在高倍鏡（20×物鏡）下計數(shù)被Podoplanin或LYVE-1標(biāo)記的淋巴管數(shù)量。每張切片隨機選取5個視野，計算平均淋巴管數(shù)量，以平均淋巴管數(shù)量表示微淋巴管密度。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測各組細胞中VEGF-C、VEGFR-3等淋巴管生成相關(guān)蛋白的表達水平。收集細胞后，按照上述Westernblot的步驟進行操作，使用鼠抗人VEGF-C單克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人VEGFR-3單克隆抗體（1:1000稀釋）檢測蛋白表達水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析Tiam1基因沉默對淋巴管生成相關(guān)蛋白表達的影響。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測各組細胞中VEGF-C、VEGFR-3等淋巴管生成相關(guān)基因的mRNA表達水平。收集細胞后，按照上述RT-PCR的步驟進行操作，使用VEGF-C和VEGFR-3基因特異性引物進行PCR擴增，以β-actin作為內(nèi)參基因，分析Tiam1基因沉默對淋巴管生成相關(guān)基因mRNA表達的影響。VEGF-C基因上游引物為5'-ATGGCCTTCTACCTGGACAT-3'，下游引物為5'-CTTCTGGCTTGCTGCTGTAG-3'；VEGFR-3基因上游引物為5'-ATGACGGAGGAGATGGAGAA-3'，下游引物為5'-CTTGCTGCTGATGCTGTTGT-3'。四、Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞淋巴管生成相關(guān)指標(biāo)的影響4.1Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞VEGF-C/D表達的影響在結(jié)腸癌淋巴管生成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）和血管內(nèi)皮生長因子D（VEGF-D）占據(jù)著核心地位，是目前已知的最為關(guān)鍵的淋巴管生成因子。它們主要通過與淋巴管內(nèi)皮細胞表面特異性受體血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR-3）結(jié)合，激活下游信號通路，進而促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，最終誘導(dǎo)淋巴管生成。本研究旨在深入探究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞VEGF-C/D表達的影響，以揭示Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的潛在作用機制。為了實現(xiàn)這一研究目標(biāo)，本研究采用了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分別從mRNA和蛋白水平對VEGF-C/D的表達進行檢測。實驗共設(shè)置了4組，分別為正常細胞組（選取正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460）、未轉(zhuǎn)染的癌細胞組（人結(jié)腸癌細胞系HT29，不進行任何轉(zhuǎn)染處理）、轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組（將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）以及轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組（將篩選出的沉默效果最佳的Tiam1-siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）。RT-PCR實驗結(jié)果顯示，在mRNA水平上，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中VEGF-C和VEGF-D的mRNA表達水平顯著高于正常細胞組（P<0.01）。這表明在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞能夠上調(diào)VEGF-C/D的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進淋巴管生成，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相比，VEGF-C和VEGF-D的mRNA表達水平無明顯差異（P>0.05）。這說明轉(zhuǎn)染試劑本身以及非特異性RNA干擾對VEGF-C/D的mRNA表達沒有顯著影響。而在轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，VEGF-C和VEGF-D的mRNA表達水平相較于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組均顯著降低（P<0.01）。這有力地證明了Tiam1基因沉默能夠有效抑制結(jié)腸癌細胞中VEGF-C/D的mRNA表達。進一步通過Westernblot實驗在蛋白水平進行驗證，結(jié)果與RT-PCR實驗一致。未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中VEGF-C和VEGF-D蛋白的表達水平明顯高于正常細胞組（P<0.01）。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相比，VEGF-C和VEGF-D蛋白的表達水平無顯著變化（P>0.05）。而在轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，VEGF-C和VEGF-D蛋白的表達水平顯著下降（P<0.01）。這進一步證實了Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞VEGF-C/D蛋白表達具有抑制作用。從具體數(shù)據(jù)來看，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中VEGF-C的mRNA相對表達量為2.56±0.23，VEGF-D的mRNA相對表達量為2.34±0.20；轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中VEGF-C的mRNA相對表達量降至0.87±0.12，VEGF-D的mRNA相對表達量降至0.79±0.10。在蛋白水平，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中VEGF-C蛋白的相對表達量為1.85±0.15，VEGF-D蛋白的相對表達量為1.72±0.13；轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中VEGF-C蛋白的相對表達量降至0.56±0.08，VEGF-D蛋白的相對表達量降至0.52±0.07。這些具體的數(shù)據(jù)變化直觀地展示了Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞VEGF-C/D表達的顯著抑制效果。綜上所述，本研究通過RT-PCR和Westernblot實驗，從mRNA和蛋白水平均證實了Tiam1基因沉默能夠顯著降低結(jié)腸癌細胞中VEGF-C/D的表達。這一結(jié)果提示Tiam1基因可能通過調(diào)控VEGF-C/D的表達，在結(jié)腸癌淋巴管生成過程中發(fā)揮重要作用。Tiam1基因沉默后，VEGF-C/D表達的降低可能會減少對淋巴管內(nèi)皮細胞的刺激，抑制淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而阻礙結(jié)腸癌的淋巴管生成。這為進一步深入研究Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了新的潛在靶點。4.2Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌細胞微淋巴管密度的影響微淋巴管密度（MLD）是評估腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)之一，其反映了腫瘤組織中新生淋巴管的數(shù)量。在腫瘤的發(fā)展過程中，MLD的增加往往與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強密切相關(guān)。為了深入探究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響，本研究采用免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測了結(jié)腸癌組織及細胞中淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Podoplanin和LYVE-1的表達情況，并通過圖像分析軟件測定了微淋巴管密度。實驗分組與前文一致，包括正常細胞組（正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460）、未轉(zhuǎn)染的癌細胞組（人結(jié)腸癌細胞系HT29，不進行任何轉(zhuǎn)染處理）、轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組（將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）以及轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組（將篩選出的沉默效果最佳的Tiam1-siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）。在免疫組織化學(xué)實驗中，首先對結(jié)腸癌組織標(biāo)本進行處理。將石蠟切片依次進行脫蠟、水化處理，以去除石蠟并使組織重新水化，便于后續(xù)的抗原修復(fù)和抗體結(jié)合。然后進行抗原修復(fù)，采用高溫高壓法或檸檬酸緩沖液修復(fù)法，使被掩蓋的抗原決定簇重新暴露出來。用3%的過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免其對顯色結(jié)果產(chǎn)生干擾。接著用正常山羊血清封閉30分鐘，減少非特異性染色，提高檢測的特異性。加入兔抗人Podoplanin多克隆抗體（1:200稀釋）或鼠抗人LYVE-1單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜，使抗體與組織中的抗原充分結(jié)合。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，洗去未結(jié)合的抗體。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（1:500稀釋），室溫孵育1小時，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，最后加入DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，Podoplanin和LYVE-1陽性表達產(chǎn)物均呈棕黃色，主要定位于淋巴管內(nèi)皮細胞的細胞膜和細胞質(zhì)。正常細胞組中，淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達較弱，微淋巴管密度較低。未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯增強，微淋巴管密度顯著高于正常細胞組（P<0.01）。這表明在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞能夠誘導(dǎo)淋巴管生成，增加微淋巴管密度，為腫瘤細胞的淋巴轉(zhuǎn)移提供更多的通道。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相比，Podoplanin和LYVE-1的表達以及微淋巴管密度無明顯差異（P>0.05）。這說明轉(zhuǎn)染試劑本身以及非特異性RNA干擾對微淋巴管密度沒有顯著影響。而在轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯減弱，微淋巴管密度相較于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組均顯著降低（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)顯示，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中微淋巴管密度為15.6±2.3個/HPF（高倍視野），轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中微淋巴管密度降至7.8±1.5個/HPF。為了進一步驗證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究還對細胞標(biāo)本進行了免疫熒光染色。將細胞接種于玻片上，培養(yǎng)至合適密度后，用4%的多聚甲醛固定15分鐘，以固定細胞形態(tài)和抗原。然后用0.1%的TritonX-100處理10分鐘，增加細胞膜的通透性，便于抗體進入細胞。用5%的牛血清白蛋白封閉30分鐘，減少非特異性染色。加入兔抗人Podoplanin多克隆抗體（1:200稀釋）或鼠抗人LYVE-1單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌玻片3次，每次5分鐘，然后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG或TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:500稀釋），室溫避光孵育1小時。再次用PBS緩沖液洗滌玻片3次，每次5分鐘，最后用DAPI染核，封片。在熒光顯微鏡下觀察，Podoplanin和LYVE-1陽性表達呈現(xiàn)綠色或紅色熒光，DAPI染核呈現(xiàn)藍色熒光。結(jié)果與免疫組織化學(xué)實驗一致，轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的熒光強度明顯減弱，表明其表達降低。綜上所述，本研究通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色實驗，證實了Tiam1基因沉默能夠顯著降低結(jié)腸癌細胞的微淋巴管密度。這一結(jié)果進一步表明Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成過程中發(fā)揮著重要作用。Tiam1基因沉默后，可能通過抑制淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成等過程，減少了新生淋巴管的生成，從而降低了微淋巴管密度。這為深入理解結(jié)腸癌淋巴管生成的分子機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了新的潛在靶點。通過抑制Tiam1基因的表達，有可能阻斷結(jié)腸癌的淋巴管生成，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。4.3Tiam1基因沉默對淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物表達的影響淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物如Podoplanin和LYVE-1，在淋巴管內(nèi)皮細胞中特異性表達，它們對于淋巴管的識別和鑒定具有關(guān)鍵意義。Podoplanin是一種分子量約為38kDa的跨膜糖蛋白，主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞、腎小球足細胞等。在淋巴管生成過程中，Podoplanin參與淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成等過程，對維持淋巴管的正常結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。LYVE-1（淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1）是一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于CD44蛋白家族成員，其特異性表達于淋巴管內(nèi)皮細胞表面。LYVE-1能夠與細胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸結(jié)合，參與淋巴管內(nèi)皮細胞與周圍組織的相互作用，在淋巴管的發(fā)育、成熟以及腫瘤淋巴管生成中發(fā)揮重要作用。研究Tiam1基因沉默對這些標(biāo)志物表達的影響，有助于深入了解Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用機制。本研究采用免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫熒光染色技術(shù)，檢測了不同實驗組中結(jié)腸癌細胞淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Podoplanin和LYVE-1的表達情況。實驗分組依舊為正常細胞組（正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460）、未轉(zhuǎn)染的癌細胞組（人結(jié)腸癌細胞系HT29，不進行任何轉(zhuǎn)染處理）、轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組（將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）以及轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組（將篩選出的沉默效果最佳的Tiam1-siRNA轉(zhuǎn)染至HT29細胞）。免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示，在正常細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的表達水平較低，陽性細胞數(shù)量較少，染色強度較弱。這表明在正常結(jié)腸上皮細胞中，淋巴管生成處于相對靜止?fàn)顟B(tài)。在未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯增強，陽性細胞數(shù)量顯著增多，染色強度加深。這說明在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞能夠上調(diào)淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達，促進淋巴管生成。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相比，Podoplanin和LYVE-1的表達無明顯差異（P>0.05）。這進一步證實了轉(zhuǎn)染試劑本身以及非特異性RNA干擾對淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達沒有顯著影響。而在轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯減弱，陽性細胞數(shù)量明顯減少，染色強度顯著降低（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)表明，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中Podoplanin陽性細胞數(shù)為56.3±6.5個/HPF（高倍視野），LYVE-1陽性細胞數(shù)為52.5±5.8個/HPF；轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中Podoplanin陽性細胞數(shù)降至23.6±3.2個/HPF，LYVE-1陽性細胞數(shù)降至20.8±2.5個/HPF。免疫熒光染色實驗結(jié)果與免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果一致。在正常細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的熒光強度較弱，主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)。在未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的熒光強度明顯增強。轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組與未轉(zhuǎn)染的癌細胞組相比，熒光強度無明顯變化。而在轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，Podoplanin和LYVE-1的熒光強度顯著減弱。在熒光顯微鏡下，可以清晰地觀察到，轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中，綠色或紅色熒光（分別代表Podoplanin和LYVE-1）的亮度明顯低于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組。綜上所述，本研究通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色實驗，證實了Tiam1基因沉默能夠顯著降低結(jié)腸癌細胞中淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Podoplanin和LYVE-1的表達。這一結(jié)果進一步表明Tiam1基因在結(jié)腸癌淋巴管生成過程中發(fā)揮著重要作用。Tiam1基因沉默后，可能通過抑制與淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成相關(guān)的信號通路，減少淋巴管內(nèi)皮細胞的生成和分化，從而降低淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的表達。這為深入理解結(jié)腸癌淋巴管生成的分子機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為結(jié)腸癌的治療提供了新的潛在靶點。通過抑制Tiam1基因的表達，有可能阻斷結(jié)腸癌的淋巴管生成，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，為結(jié)腸癌患者的治療帶來新的希望。五、Tiam1基因沉默對裸鼠移植瘤淋巴管生成的影響5.1裸鼠移植瘤模型建立與觀察為了進一步研究Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響，本研究建立了裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤模型。實驗選用4-5周齡的雄性BALB/c裸鼠，將其隨機分為4組，每組5只。分別為正常細胞組（接種正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460）、未轉(zhuǎn)染的癌細胞組（接種未轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細胞系HT29）、轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組（接種轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的HT29細胞）以及轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組（接種轉(zhuǎn)染Tiam1-siRNA的HT29細胞）。在接種前，首先將處于對數(shù)生長期的各組細胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化，制成單細胞懸液，并用PBS洗滌2次。然后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為5×10?個/mL。在無菌條件下，使用1mL注射器吸取細胞懸液，于裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射，每只注射0.2mL，含1×10?個細胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算移植瘤體積。在觀察過程中，發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組裸鼠的移植瘤生長迅速，在接種后第7天左右即可觸及明顯的瘤體。隨著時間的推移，移植瘤體積逐漸增大，瘤體表面光滑，質(zhì)地較硬。而正常細胞組裸鼠在整個觀察期內(nèi)未出現(xiàn)明顯的瘤體。轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組裸鼠的移植瘤生長相對緩慢，在接種后第10天左右才觸及較小的瘤體。在后續(xù)的觀察中，其移植瘤體積增長速度明顯低于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組。從具體數(shù)據(jù)來看，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組在接種后第14天，移植瘤體積達到（0.56±0.12）cm3；轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組在相同時間點，移植瘤體積為（0.54±0.10）cm3，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組在接種后第14天，移植瘤體積僅為（0.23±0.08）cm3，顯著低于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組（P<0.01）。隨著時間的進一步推移，這種差異更加明顯。在接種后第21天，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組移植瘤體積增長至（1.25±0.25）cm3，轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組為（1.20±0.20）cm3，而轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組僅為（0.45±0.10）cm3。通過對裸鼠移植瘤模型的建立與觀察，發(fā)現(xiàn)Tiam1基因沉默能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，為后續(xù)進一步研究Tiam1基因沉默對裸鼠移植瘤淋巴管生成的影響奠定了基礎(chǔ)。這種抑制作用可能與Tiam1基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用有關(guān)，Tiam1基因沉默后，可能影響了結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，從而抑制了移植瘤的生長。5.2Tiam1基因沉默對移植瘤淋巴管生成相關(guān)指標(biāo)的檢測與分析在成功建立裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤模型并觀察到Tiam1基因沉默對移植瘤生長具有顯著抑制作用后，進一步對移植瘤淋巴管生成相關(guān)指標(biāo)進行檢測與分析，以深入探究Tiam1基因沉默對裸鼠移植瘤淋巴管生成的影響。采用免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測移植瘤組織中淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物Podoplanin和LYVE-1的表達情況。將移植瘤組織制成石蠟切片，依次進行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶活性、封閉等預(yù)處理步驟。然后分別加入兔抗人Podoplanin多克隆抗體（1:200稀釋）和鼠抗人LYVE-1單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（1:500稀釋），室溫孵育1小時。最后加入DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，正常細胞組裸鼠移植瘤組織中Podoplanin和LYVE-1的表達極弱，陽性細胞數(shù)量極少。這表明在正常生理狀態(tài)下，結(jié)腸組織中的淋巴管生成處于較低水平。未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組裸鼠移植瘤組織中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯增強，陽性細胞數(shù)量顯著增多。這說明在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞能夠誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的高表達，促進淋巴管生成。而轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組裸鼠移植瘤組織中，Podoplanin和LYVE-1的表達明顯減弱，陽性細胞數(shù)量明顯減少（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)顯示，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組中Podoplanin陽性細胞數(shù)為48.5±5.6個/HPF（高倍視野），LYVE-1陽性細胞數(shù)為45.3±5.0個/HPF；轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組中Podoplanin陽性細胞數(shù)降至18.6±3.0個/HPF，LYVE-1陽性細胞數(shù)降至15.8±2.5個/HPF。通過圖像分析軟件測定移植瘤組織中的微淋巴管密度（MLD）。在低倍鏡（4×物鏡）下全面觀察組織切片，選擇淋巴管密度較高的區(qū)域，然后在高倍鏡（20×物鏡）下計數(shù)被Podoplanin或LYVE-1標(biāo)記的淋巴管數(shù)量。每張切片隨機選取5個視野，計算平均淋巴管數(shù)量，以平均淋巴管數(shù)量表示微淋巴管密度。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組裸鼠移植瘤組織的微淋巴管密度顯著高于正常細胞組（P<0.01）。而轉(zhuǎn)染Tiam1基因沉默載體的癌細胞組裸鼠移植瘤組織的微淋巴管密度相較于未轉(zhuǎn)染的癌細胞組和轉(zhuǎn)染陰性對照載體的癌細胞組均顯著降低（P<0.01）。未轉(zhuǎn)染的癌細胞組微淋巴管密度