抗原修復(fù)方法及注意事項(xiàng)

檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法(強(qiáng)烈推薦)

1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修

復(fù)，其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法，使得免疫組化結(jié)果更加可靠

2.儀器設(shè)備：市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑18cm

為好)；1000-1500W電爐一臺；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。3.所需試劑：0.01M

檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.14.操作步驟：

(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馀水中待用。

⑵取一定量pH=6.0檸濠酸鹽緩沖液(800-1500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰;

將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖

液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計(jì)時(shí)，1-2分鐘后，

壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，

先用蒸儲水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2某3,)。(3)

按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意事項(xiàng)：

(1)加熱時(shí)間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源

的總時(shí)間控制在5-8分鐘為好，時(shí)間過長可能會使染色背景加深。(2)必須使用不

銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導(dǎo)致拒片。

⑶高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。(4)為防止組織脫

落,玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lyine(

(5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸椽酸緩沖液不能反

復(fù)使用。EDTA抗原熱修復(fù)法

1.適用范圍：適用于部分中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修

復(fù)。2.儀器設(shè)備：電磁爐、不銹鋼鍋和耐高溫塑料染色架。3.所需試劑：EDTA抗

原修復(fù)液，PH9.04.操作步驟：

(1)抗原修復(fù)液的配制：根據(jù)所需工作液的量，取邁新公司產(chǎn)品MVS-0098

適量，按1:50的比例稀釋。

(2)取500ml抗原修復(fù)工作液于1000ml不銹鋼鍋中，直接在電磁爐上加熱

至沸騰后，調(diào)低電磁爐功率使鍋內(nèi)修復(fù)液保持微沸狀態(tài)。將組織切片置于耐高溫

染色架上，再將染色架緩慢放入不銹鋼鍋中(注意：若快速將染色架丟進(jìn)緩沖液

中，往往會導(dǎo)致瞬時(shí)的激烈沸騰現(xiàn)象而造成組織脫落)，之后加蓋繼續(xù)加熱20分

鐘。再將不銹鋼鍋從電磁爐上移開，室溫下自然冷卻至室溫后取出切片，蒸溜水

洗1次3分鐘，PBS洗2次、每次3分鐘。之后進(jìn)行免疫組化染色。5.注意事項(xiàng)：

(1)由于修復(fù)液蒸發(fā)量無法估計(jì)，所以修復(fù)液不能重復(fù)使用。(2)工作液的量

必須保證切片始終能浸泡在液體內(nèi)。

(3)為了防止加熱過程組織脫片，須采用Poly-L-Lyine處理載玻片。⑷抗原修

復(fù)后一定要等工作液冷卻后，才能將切片從工作液中取出。檸檬酸緩沖液微波抗

原修復(fù)法

1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修

復(fù)，其效果比高溫高壓修復(fù)差但比直接水煮好。2.儀器設(shè)備：微波爐(700-800W)。

3.所需試劑:0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.1

4.操作步驟：

(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸饋水中待用。

⑵取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(緩沖液量不得<500ml)于微波盒中，微波加

熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入己沸騰的

緩沖液中，中高檔或中檔繼續(xù)微波處理15-20分鐘；取出微波盒冷卻至室溫，從

緩沖液中取出玻片，先用蒸儲水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每

次3分鐘(2某3)。(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意事項(xiàng)：

(1)微波時(shí)間長短的控制很重要，從組織切片放入沸騰的緩沖液到微波結(jié)束

的總時(shí)間控制在15-20分鐘為好。

(2)必須使用耐高溫塑料切片架，不能使用不銹鋼或銅架。

(3)微波過程中，如果緩沖液蒸發(fā)而量減少，無法浸泡到組織片，應(yīng)該適當(dāng)

加上一些蒸福水，以保證組織片都能浸泡在緩沖液中，繼續(xù)微波。

(4)微波結(jié)束后必須等緩沖液冷卻后，才能把切片取出。

(5)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lyine(Devil緩沖

液的量(>500ml),必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)

使用。檸檬酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)法

1.適用范圍：適合于中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，

其效果比高壓修復(fù)法差。

2.儀器設(shè)備：電爐(600W)、燒杯(1000ml)等。

3.所需試劑：0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.1)o4.操作步驟：

(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸飾水中待用。

⑵取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液于燒杯中，放在電爐上加熱直至沸騰;

將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，繼

續(xù)煮20分鐘；燒杯離開火源冷卻至室溫，才能從緩沖液中取出玻片，先用蒸播

水沖洗兩次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2某3')。⑶按有關(guān)

試劑盒的操作步既執(zhí)行。5.注意事項(xiàng)：

(1)必須使用不銹綱或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防pH值改變

而導(dǎo)致掉片⑵煮好后必須等緩沖液冷卻后，方能將切片取出。

(3)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lyine(

(4)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反

復(fù)使用。影響抗原熱修復(fù)的關(guān)鍵因素

免疫組織化學(xué)染色中最關(guān)鍵的步驟莫過于抗原的修復(fù)了，而絕大多數(shù)常用

抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，可以這樣說，抗原熱修復(fù)是免疫組化的關(guān)鍵技

術(shù)，會直接影響到最終的染色結(jié)果。

1、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系

組織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具

體過程如示：上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋

連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這

兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：

抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度(T)某加熱時(shí)間(t)也就是說當(dāng)我們修復(fù)

時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就會越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)則

修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)

系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表一中也可以清楚地看出。如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，

免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露出的部分抗原決定簇，而不是組織

所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)

果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要

2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系

固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，

所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對溫

度的耐受也會相應(yīng)增高，這可能就是我們對固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理

論基礎(chǔ)。這就提醒我們在做回顧性研究時(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新

鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高

修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。3、不同pH值抗原修復(fù)液對

染色結(jié)果的影響

抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。pH

值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。

A—穩(wěn)定型，pH值對染色結(jié)果的影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。

B-V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-6染色結(jié)果較差，如ER、

Ki-67等。C—上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。

D-下降型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體

只是個(gè)別的現(xiàn)象，如M0C31。

一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值（約pH8.0~9.0）,A、B、C三者

都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值的修復(fù)液，如

lmMEDTA,pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使

用PH6.0的枸椽酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)

際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高

pH值的修第液來代替目前廣為使用的pH6.0枸椽酸緩沖液.為此，木公司已經(jīng)

推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0的

修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸椽酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免

疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。4、抗原熱修復(fù)

的手段

目前抗原熱修復(fù)所