摘要：本文通過優(yōu)化實驗步驟、精簡操作環(huán)節(jié)、巧用實驗裝置、可視實驗結(jié)果、創(chuàng)新數(shù)據(jù)分析等對PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定實驗進行優(yōu)化。實驗改進能更好地優(yōu)化課堂教學(xué)結(jié)構(gòu)，幫助學(xué)生建立科學(xué)探究的基本方法，提升實驗數(shù)據(jù)的分析能力，從而有效提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。關(guān)鍵詞：PCR;凝膠電泳；內(nèi)參照；人類SRY基因文章編號：1003-7586(2024)02-0062-03中圖分類號：G633.91文獻標(biāo)識碼：B“PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗是浙科版普通高中教科書《生物學(xué)·選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》(以下簡稱“教材”)第4章第1節(jié)內(nèi)容，本實驗是基于學(xué)生對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半用。實際教學(xué)中常因?qū)嶒灢襟E繁瑣、實驗耗時長、對教師操作要求高等原因，使得實驗“開展率”較低。為了突破教學(xué)難點，對本實驗進行改進和優(yōu)化，通過優(yōu)化實驗步驟、精簡操作環(huán)節(jié)、創(chuàng)新實驗裝置、可視實驗結(jié)果、巧用數(shù)據(jù)分析等，讓學(xué)生更好地體會生物學(xué)學(xué)科的實用性，在解決實際問題的過程中激發(fā)學(xué)生對生命科學(xué)的本活動包含“PCR擴增DNA片段”和“瓊脂糖凝膠電泳與鑒定”兩個實驗。在實際操作過程中存在以下問題：實驗耗時長，PCR擴增、制膠、電泳、染色和脫色等步驟至少需3h;實驗缺少對照導(dǎo)致結(jié)果不夠嚴(yán)謹(jǐn)；條帶大小判斷較主觀，對DNAMarker條帶利用不充分；靜置脫色較慢，實驗效率較低；凝膠背景模糊。同時，教材中實驗以驗證性實驗的形式呈現(xiàn)，留給學(xué)生主動思考和探究的內(nèi)容較少?；谝陨显颍瑢Ρ緦嶒炦M行改進和優(yōu)化，以提升實驗的可操作性和科學(xué)性。2實驗操作過程2.1實驗原理SRY基因是啟動男性睪丸發(fā)育的主要基因。人類SRY基因位于Y染色體短臂Yp11.3,僅含一個外顯子，無內(nèi)含子。本實驗選擇人類基因組為模板進行PCR擴增，2.2實驗器材PCR儀、無菌PCR管、移液槍、電泳儀、電泳槽、凝膠槽、離心機、EP管、細Marker5000、蛋白酶K緩沖液、TE緩沖液，引物如表1所示。2.3口腔上皮細胞基因組粗提取實驗前選取興趣小組男女生志愿者各一名，用生理鹽水漱口1min。將漱口水轉(zhuǎn)移至離心管中，13000轉(zhuǎn)離心1min,棄上清液。每個離心管內(nèi)分別加入200μL細胞裂解液和50μL蛋白酶K吹打混勻。13000轉(zhuǎn)離心1min,上清液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，加入400μL無菌水放人-20℃冰箱保存。實驗前隱去基因組性別標(biāo)記，用“甲”和“乙”代替。學(xué)生四人一組，每人取兩支無菌PCR管，分別用于擴增SRY和GAPDH基因片段，每人擴增模板需取自同一性別樣品。為方便結(jié)果對比，組內(nèi)兩人取“甲”為模板，另兩人取“乙”為模板。向無菌PCR管中依次加入模板、引物、Taq酶等試劑，最后將全班的PCR管放人PCR儀中，按圖1設(shè)定反應(yīng)程序進行擴增。2.5凝膠電泳及染色觀察制膠：稱取瓊脂粉1.0g,加到盛有100mL電泳緩沖液的三角瓶中。用封口膜封緊，微波爐加熱至充分溶解，倒入凝膠槽并立即插上膠梳。冷凝后輕拔膠梳，取出凝膠置于電泳槽內(nèi)，上樣孔靠近負(fù)極側(cè)，往電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使之剛好沒過凝膠。上樣：PCR擴增實驗完成后取出PCR反應(yīng)管，每管加入10μL上樣緩沖液，吹打混勻。每塊凝膠的第一個上樣孔內(nèi)加入20μLDNAMarker5000,其余上樣電泳：連接好電泳儀電極，蓋好電泳槽蓋，恒壓150V條件下電泳18min。染色：電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至濃度0.1%亞甲基藍染液中，染液沒過凝膠，染色8min。脫色：取出凝膠，加入75%酒精脫色1.5min;倒去酒精；加入蒸餾水放置搖床中脫色至出現(xiàn)藍色條帶，觀察并分析實驗結(jié)果，并在組內(nèi)、組間交流討論。3實驗改進與優(yōu)化3.1縮短實驗時間，提高實驗效率本實驗開出率較低，主要是因為實驗耗時較長。浙科版新版教材選擇擴增酵母菌的某基因片段，其長度長達841bp,整個實驗流程下來至少需4個課時，課程bp和554bp。變性、退火、延伸時長均從1min縮短至30s,預(yù)熱和終延伸時長縮短至3min。興趣小組在預(yù)實驗時對比30輪和33輪循環(huán)擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)無明顯差異，故循環(huán)減少至30輪。以上改進從整體上縮短了實驗時間，同時也提升了實驗的可3.2引入內(nèi)參照，確保實驗科學(xué)性對照原則是中學(xué)生物學(xué)實驗設(shè)計中最常用的原則，引入對照組能使實驗更為科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。實驗前，教師布置相關(guān)問題：為何還要同時擴增GAPDH基因片段?能否僅根據(jù)SRY基因片段進行性別判定?學(xué)生討論得知人為操作因素會影響實驗結(jié)果，不能僅參照SRY基因片段，所以引入內(nèi)參照對實驗來說至關(guān)重要。本次實驗引入GAPDH基因作為內(nèi)參照，GAPDH基因男女性均有，為管家基因(Housekeeping),等分子生物學(xué)相關(guān)實驗的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參照。實驗中每個學(xué)生都完成兩個PCR反應(yīng)體系，從某小組實驗結(jié)果(見圖2A)明顯能看出“A1號”和“A4號”為“男性”樣品；“A2號”和“A3號”為“女性”樣品，該小組成員都擴增出GAPDH基因片段，說3.3合并樣品上樣，增強實驗現(xiàn)象預(yù)實驗中學(xué)生常因移液槍使用不夠熟悉，易將上樣孔戳穿導(dǎo)致樣品外溢，再次上樣時發(fā)現(xiàn)上樣孔“不夠用”,重新制膠又需較長時間。如果SRY和GAPDH基因擴增產(chǎn)物上樣到不同泳道，則會導(dǎo)致實驗現(xiàn)象不夠直觀。針對以上問題，教師提問：能否將不同基因片段合并混勻后加入到同一上樣孔中?電泳時不同基因片段是否會相互干擾?學(xué)生根據(jù)所學(xué)知識討論得出：影響電泳的主要因素是基因片段長度、形狀和所帶電荷數(shù)，不同基因片段混合后電泳不會相互影響，電泳是分離基因片段的常用方法。本次改進既節(jié)約上樣孔，又使得實驗現(xiàn)象更直觀，能直接對同一泳道中兩個條帶進行觀察比較(見圖2B)。3.4建構(gòu)數(shù)學(xué)模型，表征實驗結(jié)果觀察條帶時，學(xué)生主要通過比對臨近Marker條帶的大小，粗略估算出條帶長度。教師提問：①如果DNA條帶位于兩條Marker條帶中間，如何準(zhǔn)確計算其長度?②實驗中有8個Marker條帶，多數(shù)學(xué)生僅用到兩條條帶，其他條帶是否蘊含有重要信息?③已知DNA片段長度的對數(shù)值與電泳遷移距離呈負(fù)相關(guān)，能否利用構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的方法準(zhǔn)確計算片段長度?在分析討論以上問題后，組內(nèi)學(xué)生測量上樣孔與各Marker條帶的距離，即遷移距離，計算全班的數(shù)值平均值計入表2。運用Excel軟件對Marker遷移距離和片段長度的對數(shù)值進行散點圖繪制，選中“散點”并添加“趨勢線”獲得如圖3所示曲線。結(jié)果顯示R2值達到0.9939,說明趨勢線與數(shù)據(jù)的擬合度較好。將目的條帶遷移距離代入公式換算，得出片段長度分別約為250bp和549bp,與實際長度239bp和554bp較為接近。以上改進既克服了片段估算的盲目性，使實驗更加嚴(yán)謹(jǐn)，又提升了學(xué)生構(gòu)建數(shù)學(xué)模型的能力。3.5巧用實驗器材，提升實驗效果因儀器設(shè)備限制，鼓勵學(xué)生充分利用現(xiàn)有設(shè)備提升實驗效果。如在觀察染色結(jié)果時，凝膠中殘留亞甲基藍且凝膠厚度不均導(dǎo)致背景較深，從而影響觀察和拍照效果。學(xué)生提議將凝膠放置于更為平整的臺燈面上方，手動調(diào)整臺燈亮度，使得條帶更為清晰干凈(見圖4)。脫色處理時，教材建議將凝膠放入蒸餾水中靜置脫色。預(yù)實驗時對比靜置脫色和搖床轉(zhuǎn)動脫色的效果，結(jié)果顯示搖床中脫色使得條帶更加清晰，并且可通過調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速和溫度提升脫色效率。4實驗小結(jié)通過優(yōu)化和改進實驗步驟，有效解決了教材中實驗操作耗時長、實驗現(xiàn)象不明顯、實驗結(jié)果不理想等問題，避免了因?qū)嶒灢怀晒Χ档蛯W(xué)生學(xué)習(xí)積極性的情況。根據(jù)實驗情況及時調(diào)整實驗步驟，如“口腔上皮細胞基因組粗提取”實驗可在課前完成，將基因組凍存于-20℃冰箱，PCR擴增和凝膠電泳及觀察可在“連堂課”完成，其中PCR擴增時長約45min。