WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯協(xié)同調(diào)控青蒿素生物合成機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義瘧疾是一種由瘧原蟲感染引發(fā)的急性傳染病，主要通過按蚊叮咬傳播。作為全球性公共衛(wèi)生問題，瘧疾嚴(yán)重威脅人類健康，特別是在非洲、亞洲和拉丁美洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)，受影響人群眾多。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2020年全球約有2.41億瘧疾病例，導(dǎo)致62.7萬人死亡，其中大多數(shù)是兒童和孕婦。瘧疾的危害不僅體現(xiàn)在對個體健康的損害，如引起高熱、寒戰(zhàn)、頭痛、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致貧血、昏迷甚至死亡；還對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成負(fù)面影響，增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)，阻礙地區(qū)的經(jīng)濟(jì)增長和社會穩(wěn)定。青蒿素是從中藥青蒿（黃花蒿，ArtemisiaannuaL.）中提取的一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有高效、速效、低毒的抗瘧特性，是目前治療瘧疾的一線藥物，尤其是對惡性瘧疾和腦型瘧疾的治療效果顯著。自20世紀(jì)70年代屠呦呦教授發(fā)現(xiàn)青蒿素以來，其在全球瘧疾防治中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，極大地降低了瘧疾的發(fā)病率和死亡率，拯救了無數(shù)生命，屠呦呦教授也因此榮獲2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。青蒿素及其衍生物如蒿甲醚、青蒿琥酯等，廣泛應(yīng)用于瘧疾的臨床治療，并成為世界衛(wèi)生組織推薦的基于青蒿素的聯(lián)合療法（ACT）的主要成分。然而，青蒿中青蒿素的含量較低，通常僅占干重的0.01%-1%，且青蒿的生長受環(huán)境因素影響較大，導(dǎo)致青蒿素的天然產(chǎn)量難以滿足全球日益增長的需求。此外，隨著青蒿素的廣泛使用，瘧原蟲對青蒿素的耐藥性問題逐漸浮現(xiàn)，這對瘧疾的防治構(gòu)成了新的挑戰(zhàn)。因此，深入研究青蒿素的生物合成機(jī)制，尋找提高青蒿素產(chǎn)量和抗藥性的有效途徑，具有重要的現(xiàn)實意義。植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成受到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，其中轉(zhuǎn)錄因子和植物激素在調(diào)控青蒿素生物合成途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與基因啟動子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的蛋白質(zhì)。在青蒿中，多種轉(zhuǎn)錄因子參與了青蒿素生物合成基因的表達(dá)調(diào)控，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，能夠識別并結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的W-box元件（TTGACC/T），在植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫響應(yīng)以及次生代謝產(chǎn)物合成等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠直接或間接調(diào)控青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而影響青蒿素的合成。植物激素作為植物體內(nèi)的信號分子，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個階段，也在青蒿素生物合成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）是一類重要的植物激素，廣泛參與植物的生長發(fā)育過程，如細(xì)胞伸長、分裂、分化，以及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯能夠影響青蒿素的生物合成，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。深入探究油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的調(diào)控作用，有助于揭示植物激素在青蒿素合成中的分子機(jī)制，為通過激素調(diào)控提高青蒿素產(chǎn)量提供理論依據(jù)。本研究聚焦于WRKY轉(zhuǎn)錄因子及油菜素內(nèi)酯對中藥青蒿中青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制。一方面，通過對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能解析，明確其在青蒿素生物合成途徑中的調(diào)控靶點和作用方式，有助于深入理解青蒿素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；另一方面，探究油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的影響及其與WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間的相互關(guān)系，有望揭示植物激素與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控青蒿素合成的分子機(jī)制。這不僅豐富了植物次生代謝調(diào)控的理論知識，也為通過基因工程和激素調(diào)控手段提高青蒿素產(chǎn)量、培育高青蒿素含量的青蒿新品種提供了新的思路和理論依據(jù)，對全球瘧疾防治工作具有重要的推動作用。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究WRKY轉(zhuǎn)錄因子及油菜素內(nèi)酯對中藥青蒿中青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制，為提高青蒿素產(chǎn)量提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究目的如下：解析WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能：鑒定參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，明確其在青蒿素生物合成途徑中的調(diào)控靶點和作用方式，為深入理解青蒿素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供關(guān)鍵信息。揭示油菜素內(nèi)酯調(diào)控機(jī)制：探究油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的影響，包括對青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控，以及對青蒿生長發(fā)育和生理代謝的影響，揭示植物激素在青蒿素合成中的分子機(jī)制。探究協(xié)同調(diào)控機(jī)制：研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯之間的相互關(guān)系，明確它們在青蒿素生物合成調(diào)控中的協(xié)同作用機(jī)制，為通過基因工程和激素調(diào)控手段提高青蒿素產(chǎn)量提供新的思路和理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：研究視角創(chuàng)新：將WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯結(jié)合起來，研究它們對青蒿素生物合成的協(xié)同調(diào)控作用，為揭示植物次生代謝調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，有助于拓展植物激素與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的研究領(lǐng)域。技術(shù)方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)和植物生理學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，如基因克隆、表達(dá)分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作分析、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，從多個層面深入研究青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、深入和準(zhǔn)確。研究成果創(chuàng)新：有望發(fā)現(xiàn)新的參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子及油菜素內(nèi)酯信號通路的關(guān)鍵組分，揭示它們之間的相互作用關(guān)系和協(xié)同調(diào)控機(jī)制，為通過基因工程和激素調(diào)控手段提高青蒿素產(chǎn)量提供新的基因資源和理論依據(jù)，對全球瘧疾防治工作具有重要的推動作用。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法文獻(xiàn)研究法：全面檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，包括學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、專利文獻(xiàn)以及專業(yè)書籍等，梳理WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯在植物次生代謝調(diào)控，特別是青蒿素生物合成調(diào)控方面的研究現(xiàn)狀、已有成果和存在問題，為研究提供堅實的理論基礎(chǔ)和研究思路參考。實驗法：以中藥青蒿為實驗材料，開展一系列實驗。通過基因克隆技術(shù)獲取青蒿中可能參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因；利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測在不同處理條件下（如油菜素內(nèi)酯處理、基因過表達(dá)或沉默等），WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因以及青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平變化；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)情況；采用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建WRKY轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)或沉默的青蒿轉(zhuǎn)基因植株，以及油菜素內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵基因過表達(dá)或突變的青蒿植株，觀察其青蒿素含量變化和表型特征，深入探究它們對青蒿素生物合成的調(diào)控作用。數(shù)據(jù)分析方法：運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件（如SPSS、GraphPadPrism等）對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括數(shù)據(jù)的描述性統(tǒng)計（均值、標(biāo)準(zhǔn)差等）、顯著性檢驗（如t檢驗、方差分析等），以確定不同處理組之間數(shù)據(jù)差異的顯著性；采用生物信息學(xué)分析方法，對基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行預(yù)測和分析，如利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因序列比對和同源性分析，使用在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能域，為實驗結(jié)果的分析和解釋提供輔助支持。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：實驗材料準(zhǔn)備：選擇生長狀態(tài)一致的青蒿幼苗，在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置適宜的光照、溫度、濕度等條件，為后續(xù)實驗提供充足且生長狀況良好的實驗材料。同時，準(zhǔn)備相關(guān)的分子生物學(xué)試劑、儀器設(shè)備等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定：通過查閱文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析，篩選出可能參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。采用RT-PCR技術(shù)從青蒿葉片中克隆這些基因，并進(jìn)行測序驗證。利用生物信息學(xué)工具對克隆得到的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因序列進(jìn)行分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測、氨基酸序列推導(dǎo)、保守結(jié)構(gòu)域分析等，初步了解其結(jié)構(gòu)特征。油菜素內(nèi)酯處理實驗：對青蒿幼苗進(jìn)行油菜素內(nèi)酯（BR）處理，設(shè)置不同的BR濃度梯度和處理時間。在處理后的不同時間點采集青蒿葉片樣品，用于后續(xù)分析。同時，設(shè)置對照組，即不進(jìn)行BR處理的青蒿幼苗?；虮磉_(dá)分析：運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，檢測在BR處理和對照條件下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因以及青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因（如ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等）的表達(dá)水平變化。分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出受BR調(diào)控且可能參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。蛋白質(zhì)互作分析：對于篩選出的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，采用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建WRKY轉(zhuǎn)錄因子的誘餌載體和油菜素內(nèi)酯信號通路相關(guān)蛋白的獵物載體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，篩選與WRKY轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白。進(jìn)一步利用BiFC和Co-IP技術(shù)，在植物體內(nèi)驗證這些蛋白之間的相互作用關(guān)系。確定WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中的關(guān)鍵互作蛋白，為探究協(xié)同調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因植株構(gòu)建與分析：構(gòu)建WRKY轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體和RNA干擾載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將其導(dǎo)入青蒿中，獲得WRKY轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)和沉默的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。同時，構(gòu)建油菜素內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵基因（如BRI1、BZR1等）的過表達(dá)載體和突變體，轉(zhuǎn)化青蒿獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。對這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，如PCR檢測、qRT-PCR檢測等，確定基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況。分析轉(zhuǎn)基因植株的表型特征，包括株高、葉面積、分枝數(shù)等生長指標(biāo)，以及青蒿素含量變化。通過比較不同轉(zhuǎn)基因植株與野生型青蒿的差異，明確WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的調(diào)控作用。結(jié)果分析與討論：綜合上述實驗結(jié)果，分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制，包括它們各自的作用方式、調(diào)控靶點，以及兩者之間的協(xié)同作用關(guān)系。討論研究結(jié)果的理論意義和實際應(yīng)用價值，為提高青蒿素產(chǎn)量提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。[此處插入技術(shù)路線圖，圖題：WRKY轉(zhuǎn)錄因子及油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成調(diào)控的研究技術(shù)路線圖]二、青蒿素的生物合成途徑2.1青蒿素的結(jié)構(gòu)與功能青蒿素（Artemisinin），化學(xué)名稱為（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-橋氧-12H-吡喃〔4,3-j〕-1,2-苯并二塞平-10（3H）-酮，分子式為C_{15}H_{22}O_{5}，分子量為282.33。其分子結(jié)構(gòu)獨特，包含一個倍半萜內(nèi)酯骨架和一個過氧橋結(jié)構(gòu)，這是青蒿素具有抗瘧活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。倍半萜內(nèi)酯骨架賦予青蒿素特定的化學(xué)穩(wěn)定性和空間構(gòu)型，而過氧橋結(jié)構(gòu)則在青蒿素的抗瘧作用機(jī)制中發(fā)揮核心作用。如圖2所示，青蒿素分子呈現(xiàn)出緊湊而有序的空間排列，各原子和基團(tuán)之間的相互作用決定了其物理和化學(xué)性質(zhì)。[此處插入青蒿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，圖題：青蒿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式]青蒿素的主要功能是抗瘧疾，它是目前全球治療瘧疾的一線藥物，尤其對惡性瘧疾和腦型瘧疾療效顯著。青蒿素抗瘧的作用機(jī)制較為復(fù)雜，目前被廣泛接受的理論是，青蒿素在瘧原蟲體內(nèi)被激活后，其過氧橋結(jié)構(gòu)會裂解產(chǎn)生自由基。這些自由基能夠與瘧原蟲蛋白中的某些基團(tuán)發(fā)生共價結(jié)合，從而破壞瘧原蟲的膜系結(jié)構(gòu)，包括泡膜、核膜以及質(zhì)膜等，導(dǎo)致瘧原蟲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損。例如，自由基與瘧原蟲的線粒體膜結(jié)合，會破壞線粒體的正常功能，使線粒體腫脹、內(nèi)外膜脫落，影響瘧原蟲的能量代謝過程；同時，青蒿素還能使瘧原蟲對異亮氨酸的攝入量明顯減少，抑制蟲體蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)一步阻礙瘧原蟲的生長和繁殖，最終達(dá)到殺滅瘧原蟲的目的。除了抗瘧作用，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)青蒿素具有多種其他潛在的生物活性。在抗腫瘤方面，青蒿素能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞凋亡，對癌細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用。其抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的，如雙氫青蒿素可以通過增加活性氧，抑制激活缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)因子，發(fā)揮選擇性細(xì)胞毒作用；青蒿素作用于白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，激活鈣蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹死亡，并促進(jìn)凋亡物質(zhì)的釋放，加速細(xì)胞凋亡。在免疫調(diào)節(jié)方面，研究表明，在不會引起細(xì)胞毒素的劑量下，青蒿素及其衍生物能夠較好地抑制T淋巴細(xì)胞絲裂原，誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，這對于治療T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的自身免疫性疾病具有重要的參考價值。此外，青蒿素還具有一定的抗真菌和抗菌活性，其渣粉劑和水煎劑對炭疽桿菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、白喉桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用，對結(jié)核桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等也具有一定的抑制效果。2.2青蒿素生物合成的主要步驟青蒿素的生物合成是一個復(fù)雜的過程，涉及多個酶促反應(yīng)和代謝途徑。其生物合成途徑主要包括細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（MevalonicAcid，MVA）途徑和質(zhì)體中的甲基赤蘚醇-4-磷酸（MethylerythritolPhosphate，MEP）途徑，這兩條途徑共同為青蒿素的合成提供前體物質(zhì)?？傮w來說，青蒿素的生物合成從乙酰-CoA起始，逐步經(jīng)過多個中間產(chǎn)物，最終合成青蒿素，具體步驟如下：在細(xì)胞質(zhì)中，3分子的乙酰-CoA在一系列酶的催化下，經(jīng)MVA途徑生成甲羥戊酸，甲羥戊酸進(jìn)一步磷酸化、脫羧，生成異戊烯基焦磷酸（IsopentenylDiphosphate，IPP）。IPP是萜類化合物生物合成的基本結(jié)構(gòu)單元，它可以在異構(gòu)酶的作用下，轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基焦磷酸（DimethylallylDiphosphate，DMAPP）。在質(zhì)體中，丙酮酸和甘油醛-3-磷酸通過MEP途徑也能生成IPP。MEP途徑中的關(guān)鍵酶，如1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）等，對MEP途徑的通量起著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中生成的IPP和DMAPP，通過一系列的縮合反應(yīng)，最終生成法尼基焦磷酸（FarnesylDiphosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP是倍半萜類化合物生物合成的直接前體。FPP在紫穗槐二烯合成酶（Amorpha-4,11-dieneSynthase，ADS）的催化下，發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成紫穗槐二烯（Amorpha-4,11-diene），這是青蒿素生物合成途徑中的第一個關(guān)鍵步驟，ADS的活性和表達(dá)水平直接影響紫穗槐二烯的合成量，進(jìn)而影響青蒿素的產(chǎn)量。紫穗槐二烯在細(xì)胞色素P450單加氧酶（CytochromeP450Monooxygenase，CYP71AV1）的作用下，經(jīng)歷三步連續(xù)的氧化反應(yīng)，依次生成青蒿醇（Artemisinol）、青蒿醛（ArtemisinicAldehyde）和青蒿酸（ArtemisinicAcid）。CYP71AV1是一種依賴于NADPH和O?的酶，它能夠特異性地識別紫穗槐二烯，并對其進(jìn)行羥基化、醛基化等修飾，在青蒿酸的合成過程中起到了至關(guān)重要的作用。青蒿醛在青蒿醛Δ11(13)-還原酶（ArtemisinicAldehydeΔ11(13)-Reductase，DBR2）的催化下，被還原為二氫青蒿醛（DihydroartemisinicAldehyde）。二氫青蒿醛再在醛脫氫酶1（AldehydeDehydrogenase1，ALDH1）的作用下，進(jìn)一步氧化生成二氫青蒿酸（DihydroartemisinicAcid），二氫青蒿酸是青蒿素的直接前體。從二氫青蒿酸到青蒿素的轉(zhuǎn)化過程，目前普遍認(rèn)為是非酶促的光氧化反應(yīng)。在光照條件下，二氫青蒿酸的過氧橋結(jié)構(gòu)發(fā)生重排和氧化，最終形成青蒿素。此外，青蒿酸也可以通過非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為青蒿素B，但青蒿素B在青蒿中的含量較低，且其抗瘧活性也相對較弱。2.3關(guān)鍵酶在青蒿素生物合成中的作用在青蒿素生物合成的復(fù)雜過程中，一系列關(guān)鍵酶起著不可或缺的催化作用，它們精確地調(diào)控著各個反應(yīng)步驟，對青蒿素的合成效率和產(chǎn)量產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。紫穗槐二烯合成酶（ADS）作為青蒿素生物合成途徑起始階段的關(guān)鍵酶，承擔(dān)著至關(guān)重要的職責(zé)。其催化底物法尼基焦磷酸（FPP）發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成紫穗槐二烯，這是青蒿素生物合成的首個關(guān)鍵步驟，也是后續(xù)一系列反應(yīng)得以進(jìn)行的基礎(chǔ)。ADS的活性和表達(dá)水平猶如精準(zhǔn)的調(diào)控開關(guān)，直接決定著紫穗槐二烯的合成量。當(dāng)ADS基因的表達(dá)量增加時，其催化生成的紫穗槐二烯含量也會相應(yīng)提高，為后續(xù)青蒿素的合成提供更為充足的原料，從而顯著促進(jìn)青蒿素的合成；反之，若ADS基因的表達(dá)受到抑制，紫穗槐二烯的合成量將大幅減少，青蒿素的合成也會隨之受到嚴(yán)重阻礙。研究表明，通過基因工程技術(shù)上調(diào)ADS基因的表達(dá)，能夠使青蒿中紫穗槐二烯的含量顯著提升，進(jìn)而有效提高青蒿素的產(chǎn)量。細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP71AV1）在青蒿素生物合成途徑中扮演著核心角色，參與了從紫穗槐二烯到青蒿酸的三步連續(xù)氧化反應(yīng)。在第一步反應(yīng)中，CYP71AV1催化紫穗槐二烯發(fā)生羥基化反應(yīng)，生成青蒿醇；隨后，青蒿醇在CYP71AV1的繼續(xù)作用下，進(jìn)一步被氧化為青蒿醛；最后，青蒿醛再次經(jīng)CYP71AV1催化，轉(zhuǎn)化為青蒿酸。CYP71AV1對底物具有高度的特異性和選擇性，能夠精準(zhǔn)地識別紫穗槐二烯，并在特定的位點進(jìn)行氧化修飾，確保反應(yīng)朝著生成青蒿酸的方向順利進(jìn)行。其活性和表達(dá)水平直接影響著青蒿酸的合成效率和產(chǎn)量，對青蒿素的最終合成量起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。相關(guān)研究顯示，在CYP71AV1基因過表達(dá)的青蒿植株中，青蒿酸的含量明顯增加，青蒿素的合成量也隨之顯著提高；而在CYP71AV1基因沉默的植株中，青蒿酸和青蒿素的含量均大幅下降。青蒿醛Δ11(13)-還原酶（DBR2）主要負(fù)責(zé)催化青蒿醛的還原反應(yīng)，將青蒿醛轉(zhuǎn)化為二氫青蒿醛。該反應(yīng)是青蒿素生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟之一，DBR2的活性直接影響著二氫青蒿醛的生成量，進(jìn)而對青蒿素的合成產(chǎn)生重要影響。DBR2能夠特異性地識別青蒿醛，并利用NADPH作為輔酶，將其還原為二氫青蒿醛。在青蒿素的合成過程中，DBR2的表達(dá)水平和活性變化與青蒿素含量的波動密切相關(guān)。當(dāng)DBR2基因的表達(dá)上調(diào)時，二氫青蒿醛的合成量增加，為后續(xù)青蒿素的合成提供更多的前體物質(zhì)，從而促進(jìn)青蒿素的合成；反之，若DBR2基因的表達(dá)受到抑制，二氫青蒿醛的合成量減少，青蒿素的合成也會受到明顯的抑制。研究人員通過對DBR2基因進(jìn)行調(diào)控，成功地改變了青蒿中DBR2的表達(dá)水平和活性，進(jìn)而實現(xiàn)了對青蒿素含量的有效調(diào)節(jié)。醛脫氫酶1（ALDH1）在青蒿素生物合成途徑的后期發(fā)揮著重要作用，它催化二氫青蒿醛氧化生成二氫青蒿酸，二氫青蒿酸是青蒿素的直接前體。ALDH1的活性和表達(dá)水平直接影響著二氫青蒿酸的合成量，從而對青蒿素的合成產(chǎn)生關(guān)鍵影響。ALDH1能夠高效地催化二氫青蒿醛的氧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為二氫青蒿酸。在青蒿的生長發(fā)育過程中，ALDH1的表達(dá)水平和活性會發(fā)生動態(tài)變化，這些變化與青蒿素的合成密切相關(guān)。當(dāng)ALDH1基因的表達(dá)增強(qiáng)時，二氫青蒿酸的合成量增加，青蒿素的合成也會相應(yīng)增加；反之，若ALDH1基因的表達(dá)受到抑制，二氫青蒿酸的合成量減少，青蒿素的合成也會受到顯著影響。研究表明，通過基因工程手段提高ALDH1基因的表達(dá)水平，可以顯著提高青蒿中ALDH1的活性和二氫青蒿酸的含量，進(jìn)而提高青蒿素的產(chǎn)量。三、WRKY轉(zhuǎn)錄因子對青蒿素生物合成的調(diào)控3.1WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族概述WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物的生長發(fā)育、環(huán)境響應(yīng)以及次生代謝產(chǎn)物合成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1994年，Ishiguro等人從甘薯中成功克隆出首個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1，此后，隨著研究的不斷深入，在擬南芥、水稻、大豆、楊樹、黃瓜、玉米等多種植物中都分離鑒定到了大量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是在其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守的7個氨基酸序列，這一序列也成為WRKY轉(zhuǎn)錄因子的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)。WRKY結(jié)構(gòu)域是一段大約由60個高度保守的氨基酸殘基所組成的多肽序列，除了保守的WRKYGQK七肽序列外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域中一般還含有一個鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）型和C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠通過WRKY結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子區(qū)的順式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特異性結(jié)合，從而對基因的轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行促進(jìn)或抑制，進(jìn)而精細(xì)地調(diào)控下游基因的表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子所含WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，通常將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3大類：第I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子：含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型。這類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合功能主要由C-末端的WRKY結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，而N-末端WRKY結(jié)構(gòu)域的功能雖尚未完全明確，但推測它可能參與WRKY轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互結(jié)合的過程，通過某種機(jī)制提高轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶位點的親和力和特異性，使轉(zhuǎn)錄因子能夠更精準(zhǔn)、高效地與靶基因啟動子結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。第II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子：只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)同樣為C2H2型。大部分已研究的WRKY轉(zhuǎn)錄因子都屬于該類型，Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的WRKY結(jié)構(gòu)域序列與I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子C-末端WRKY結(jié)構(gòu)域序列具有較高的相似性，這也表明I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子C-末端WRKY結(jié)構(gòu)域與其他類型中只含1個WRKY結(jié)構(gòu)域在靶DNA結(jié)合功能上是相同的，它們可能通過相似的作用機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá)。第Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子：也只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型。這一獨特的鋅指結(jié)構(gòu)賦予了第Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子特殊的功能和作用方式，使其在植物的生理過程中發(fā)揮著不可替代的作用。此外，為了更全面、深入地反映WRKY結(jié)構(gòu)域的演化過程，Zhang等人通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分為I、IIa+IIb、IIc、IId+IIe和III這幾個亞類。Tamura等人通過純系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證實了Zhang等人的結(jié)果，這些研究成果為深入理解WRKY轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化歷程和功能分化提供了重要依據(jù)，有助于揭示W(wǎng)RKY基因在植物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所發(fā)揮的特殊功能，以及它們在植物適應(yīng)環(huán)境變化和生長發(fā)育過程中的重要作用。WRKY基因在植物體內(nèi)并非組成型表達(dá)，其表達(dá)具有嚴(yán)格的時空調(diào)控特性。目前已識別和克隆的WRKY基因的表達(dá)受到各種環(huán)境因素的誘導(dǎo)，如病原體入侵、真菌誘導(dǎo)子刺激、信號分子水楊酸及其功能類似物的作用，以及植物不同發(fā)育階段、干旱、低溫、創(chuàng)傷、機(jī)械脅迫等。當(dāng)植物受到這些環(huán)境信號刺激時，WRKY基因能夠迅速響應(yīng)，啟動表達(dá)程序，其表達(dá)具有快速、瞬時等特點，并且在不同組織和器官中呈現(xiàn)出特異性表達(dá)模式，從而參與植物體內(nèi)的各種生理過程，幫助植物適應(yīng)環(huán)境變化，維持自身的生長發(fā)育和生存。3.2青蒿中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定為了深入探究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在青蒿素生物合成中的調(diào)控作用，首要任務(wù)是精準(zhǔn)篩選和鑒定出與青蒿素合成緊密相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的技術(shù)手段，全面系統(tǒng)地開展了篩選與鑒定工作。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為篩選工作提供了海量的數(shù)據(jù)信息。通過對不同生長時期、不同組織部位以及在各種環(huán)境脅迫條件下青蒿的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，獲得了豐富的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，重點關(guān)注在青蒿素合成關(guān)鍵時期和組織中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。例如，在青蒿素合成高峰期，某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，這些基因極有可能參與了青蒿素生物合成的調(diào)控過程。研究表明，在青蒿生長發(fā)育過程中，當(dāng)進(jìn)入青蒿素快速積累階段時，部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平急劇上升，暗示著它們在青蒿素合成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。生物信息學(xué)分析方法在篩選過程中發(fā)揮了重要的輔助作用。利用相關(guān)的生物信息學(xué)工具，對青蒿的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全面檢索和分析，篩選出具有典型WRKY結(jié)構(gòu)域特征的基因序列。通過對這些基因序列的分析，預(yù)測它們的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步縮小篩選范圍。例如，通過分析基因序列中的保守結(jié)構(gòu)域，確定其屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的哪一類，以及與已知功能的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的同源性，從而初步判斷其在青蒿素生物合成中的潛在作用。利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)某些青蒿WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因與在其他植物中已被證明參與次生代謝調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因具有較高的同源性，這為后續(xù)的研究提供了重要線索。酵母單雜交技術(shù)是鑒定WRKY轉(zhuǎn)錄因子與青蒿素合成相關(guān)基因啟動子相互作用的關(guān)鍵技術(shù)。以青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因（如ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等）的啟動子區(qū)域為誘餌，構(gòu)建含有這些啟動子片段的酵母報告載體。將篩選出的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母細(xì)胞中，若WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠與青蒿素合成相關(guān)基因的啟動子結(jié)合，就會啟動報告基因的表達(dá)，從而篩選出與青蒿素合成相關(guān)基因啟動子具有相互作用的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。通過酵母單雜交實驗，成功篩選出了多個能夠與ADS基因啟動子特異性結(jié)合的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究它們對青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術(shù)則從全基因組水平上對WRKY轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用進(jìn)行研究。用特異性抗體免疫沉淀與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的染色質(zhì)片段，然后對這些片段進(jìn)行測序，分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子在青蒿基因組上的結(jié)合位點。通過與青蒿素生物合成相關(guān)基因的位置信息進(jìn)行比對，確定WRKY轉(zhuǎn)錄因子是否直接作用于這些基因，從而進(jìn)一步明確它們在青蒿素生物合成調(diào)控中的作用靶點。利用ChIP-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子在青蒿素生物合成關(guān)鍵酶基因的啟動子區(qū)域存在特異性結(jié)合位點，表明這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能直接調(diào)控青蒿素生物合成基因的表達(dá)。通過以上多種技術(shù)手段的綜合運(yùn)用，本研究成功篩選和鑒定出了多個與青蒿素生物合成相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，為后續(xù)深入研究它們在青蒿素生物合成中的調(diào)控機(jī)制提供了重要的研究對象和理論基礎(chǔ)。這些篩選出的WRKY轉(zhuǎn)錄因子將成為進(jìn)一步探究青蒿素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，有助于揭示青蒿素生物合成的分子機(jī)制，為提高青蒿素產(chǎn)量提供新的基因資源和理論依據(jù)。3.3AaWRKY9對青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制在眾多參與青蒿素生物合成調(diào)控的WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，AaWRKY9展現(xiàn)出獨特且關(guān)鍵的調(diào)控作用，其調(diào)控機(jī)制涉及多個層面，對青蒿素生物合成的精準(zhǔn)調(diào)控具有重要意義。AaWRKY9能夠通過與青蒿素生物合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域特異性結(jié)合，直接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，AaWRKY9可與紫穗槐二烯合成酶基因（ADS）、細(xì)胞色素P450單加氧酶基因（CYP71AV1）、青蒿醛Δ11(13)-還原酶基因（DBR2）以及醛脫氫酶1基因（ALDH1）等關(guān)鍵酶基因的啟動子中的W-box元件（TTGACC/T）緊密結(jié)合。以AaDBR2和AaGSW1的啟動子為例，AaWRKY9能夠特異性地識別并結(jié)合其啟動子中的W-box5/4片段，從而激活這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這種結(jié)合作用猶如一把精準(zhǔn)的鑰匙開啟了基因表達(dá)的大門，使得相關(guān)基因能夠順利轉(zhuǎn)錄為mRNA，進(jìn)而為后續(xù)的蛋白質(zhì)合成提供模板，促進(jìn)青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶的合成，最終推動青蒿素的生物合成。當(dāng)AaWRKY9與ADS基因啟動子結(jié)合后，ADS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，使得催化生成的紫穗槐二烯含量增加，為青蒿素的合成提供了更多的前體物質(zhì)，從而促進(jìn)了青蒿素的合成。光信號和茉莉酸（JA）信號在植物生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成中發(fā)揮著重要作用，AaWRKY9的表達(dá)能夠同時響應(yīng)這兩種信號，從而協(xié)同調(diào)控青蒿素的生物合成。在光信號通路中，光感受器接收光照信號后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，光照能夠顯著誘導(dǎo)AaWRKY9的表達(dá)。當(dāng)青蒿植株處于光照條件下時，光信號通過光感受器傳遞給下游的信號分子，最終激活A(yù)aWRKY9基因的表達(dá)，使其轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。而在黑暗條件下，AaWRKY9的表達(dá)則受到明顯抑制。這表明光信號對AaWRKY9的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，光照能夠促進(jìn)AaWRKY9的表達(dá)，為青蒿素的生物合成提供了必要的轉(zhuǎn)錄因子基礎(chǔ)。茉莉酸（JA）信號通路同樣對AaWRKY9的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。外源施加茉莉酸甲酯（MeJA）能夠顯著誘導(dǎo)AaWRKY9的表達(dá)。當(dāng)用MeJA處理青蒿幼苗后，通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，AaWRKY9的表達(dá)量急劇增加。這說明JA信號能夠激活A(yù)aWRKY9基因的表達(dá)，使其在青蒿素生物合成中發(fā)揮作用。進(jìn)一步的研究表明，AaWRKY9在光依賴的JA信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。光照條件下，AaWRKY9的表達(dá)被誘導(dǎo)，同時JA信號通路被激活，兩者協(xié)同作用，共同促進(jìn)青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高青蒿素的合成量。在光照和MeJA共同處理的青蒿植株中，AaWRKY9的表達(dá)量以及青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平都顯著高于單獨處理組，青蒿素的含量也明顯增加。這充分證明了AaWRKY9在光和JA信號協(xié)同調(diào)控青蒿素生物合成過程中的重要作用。AaWRKY9與JA信號通路中的抑制因子AaJAZ9之間存在相互作用，這種相互作用對AaWRKY9的轉(zhuǎn)錄激活活性產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而調(diào)控青蒿素的生物合成。通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)驗證，發(fā)現(xiàn)AaWRKY9與AaJAZ9能夠特異性地相互結(jié)合。在正常生理狀態(tài)下，AaJAZ9與AaWRKY9相互作用，抑制AaWRKY9的轉(zhuǎn)錄激活活性。當(dāng)用MeJA處理后，MeJA能夠誘導(dǎo)AaJAZ9的降解，從而解除AaJAZ9對AaWRKY9的抑制作用。此時，AaWRKY9的轉(zhuǎn)錄激活活性得以增強(qiáng)，能夠更有效地結(jié)合青蒿素生物合成相關(guān)基因的啟動子，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而提高青蒿素的合成量。在煙草葉片中進(jìn)行的雙熒光素酶報告基因檢測實驗表明，當(dāng)AaWRKY9與AaJAZ9共表達(dá)時，青蒿素合成相關(guān)基因的啟動子活性受到抑制；而在MeJA存在的情況下，AaJAZ9被降解，AaWRKY9的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，青蒿素合成相關(guān)基因的啟動子活性顯著提高。這清晰地揭示了AaWRKY9與AaJAZ9相互作用對青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制。四、油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的調(diào)控4.1油菜素內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)與生理功能油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）是一類甾體類植物激素，在植物的生長發(fā)育和生理過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。油菜素內(nèi)酯的基本結(jié)構(gòu)為甾醇，其分子骨架與動物體內(nèi)的甾體激素類似，具有一個四環(huán)的甾核結(jié)構(gòu)，在甾核的不同位置連接有多個羥基和側(cè)鏈。不同的油菜素內(nèi)酯在甾核的修飾和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)上存在差異，這些結(jié)構(gòu)差異決定了它們的生理活性和功能特異性。例如，油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BL）是活性最強(qiáng)的一種油菜素甾體類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-四羥基-24-甲基-β-均-7-氧雜-5-膽甾-6-酮，具有特定的立體構(gòu)型和官能團(tuán)排列，使其能夠與植物細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，從而啟動下游的信號傳導(dǎo)途徑。油菜素內(nèi)酯在植物體內(nèi)具有廣泛的生理功能，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個階段。在細(xì)胞水平上，油菜素內(nèi)酯能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂。它可提高植物DNA聚合酶和RNA聚合酶的活性，使DNA和蛋白質(zhì)含量增多，同時刺激細(xì)胞質(zhì)膜上的ATP酶活性，促使質(zhì)膜分泌H?到細(xì)胞壁，使細(xì)胞壁松弛，為細(xì)胞伸長提供空間，從而促進(jìn)細(xì)胞伸長，使植株生長加速。在擬南芥中，外源施加油菜素內(nèi)酯能夠顯著增加下胚軸和根細(xì)胞的長度和數(shù)目，促進(jìn)植株的縱向生長。在水稻中，油菜素內(nèi)酯信號通路的關(guān)鍵基因發(fā)生突變后，植株表現(xiàn)出矮化、細(xì)胞伸長和分裂受阻的表型。油菜素內(nèi)酯對植物光合作用也有顯著的促進(jìn)作用。它可提高RuBP羧化酶的活性，使CO?固定速率加快，光合效率提高，植物表現(xiàn)為葉色加深，葉面積增大，葉片肥厚，生長整齊，葉面品質(zhì)改善。研究表明，用油菜素內(nèi)酯處理小麥葉片，能夠顯著提高葉片的光合速率和葉綠素含量，增強(qiáng)小麥的光合作用能力。在黃瓜中，油菜素內(nèi)酯處理可增加葉片的氣孔導(dǎo)度和光合電子傳遞速率，促進(jìn)光合作用的進(jìn)行。油菜素內(nèi)酯還在植物的向地性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物通過感知重力信號，調(diào)節(jié)生長素的分布，從而實現(xiàn)莖的負(fù)向地性生長和根的正向地性生長。油菜素內(nèi)酯能夠與生長素信號相互作用，參與植物向地性反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在擬南芥中，油菜素內(nèi)酯信號通路的突變體表現(xiàn)出向地性反應(yīng)異常，說明油菜素內(nèi)酯在植物向地性反應(yīng)中不可或缺。此外，油菜素內(nèi)酯還具有提高植物抗逆性的功能。它能夠增強(qiáng)植物對干旱、高鹽、低溫、高溫等非生物脅迫以及病原菌侵染等生物脅迫的抵抗能力。在干旱脅迫下，油菜素內(nèi)酯處理能夠提高植物的抗氧化酶活性，降低活性氧的積累，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而減輕干旱對植物的傷害。在病原菌侵染時，油菜素內(nèi)酯能夠激活植物的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病性。在水稻中，外源施加油菜素內(nèi)酯可顯著提高水稻對稻瘟病的抗性。4.2油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成關(guān)鍵基因的影響油菜素內(nèi)酯（BR）對青蒿素生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用，能夠通過上調(diào)這些基因的表達(dá)水平，促進(jìn)青蒿素的生物合成。紫穗槐二烯合成酶基因（ADS）是青蒿素生物合成途徑中的關(guān)鍵起始基因，其表達(dá)水平直接影響青蒿素合成的原料供應(yīng)。研究表明，外源施加油菜素內(nèi)酯能夠顯著上調(diào)ADS基因的表達(dá)。在相關(guān)實驗中，用不同濃度的油菜素內(nèi)酯處理青蒿幼苗，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著油菜素內(nèi)酯濃度的增加，ADS基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在一定濃度（如80μmol/L）下，ADS基因的表達(dá)量達(dá)到最高，相較于對照組，表達(dá)量顯著提高。這表明油菜素內(nèi)酯能夠通過促進(jìn)ADS基因的表達(dá)，增加紫穗槐二烯的合成，為青蒿素的生物合成提供更多的前體物質(zhì)，從而促進(jìn)青蒿素的合成。細(xì)胞色素P450單加氧酶基因（CYP71AV1）參與青蒿素生物合成途徑中的關(guān)鍵氧化步驟，對青蒿素的合成起著至關(guān)重要的作用。油菜素內(nèi)酯處理能夠有效上調(diào)CYP71AV1基因的表達(dá)。當(dāng)用適宜濃度的油菜素內(nèi)酯處理青蒿時，CYP71AV1基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，其編碼的細(xì)胞色素P450單加氧酶含量和活性也相應(yīng)增加，進(jìn)而促進(jìn)紫穗槐二烯向青蒿酸的轉(zhuǎn)化，加速青蒿素生物合成途徑的進(jìn)程。在油菜素內(nèi)酯處理后的青蒿植株中，CYP71AV1基因的表達(dá)量在處理后的一定時間內(nèi)持續(xù)上升，使得青蒿酸的合成量顯著增加，為青蒿素的最終合成奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。青蒿醛Δ11(13)-還原酶基因（DBR2）是青蒿素生物合成途徑中的另一個關(guān)鍵基因，其表達(dá)產(chǎn)物能夠催化青蒿醛轉(zhuǎn)化為二氫青蒿醛，對青蒿素的合成具有重要影響。油菜素內(nèi)酯能夠顯著誘導(dǎo)DBR2基因的表達(dá)。實驗數(shù)據(jù)顯示，在油菜素內(nèi)酯處理后，DBR2基因的表達(dá)量迅速增加，且在一定時間內(nèi)維持在較高水平。這種表達(dá)上調(diào)使得青蒿醛能夠更高效地轉(zhuǎn)化為二氫青蒿醛，為后續(xù)青蒿素的合成提供了更多的中間產(chǎn)物，有力地促進(jìn)了青蒿素的生物合成。通過對DBR2基因表達(dá)的調(diào)控，油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，油菜素內(nèi)酯能夠通過上調(diào)ADS、CYP71AV1、DBR2等青蒿素生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)青蒿素生物合成途徑中各個關(guān)鍵步驟的進(jìn)行，增加青蒿素合成的前體物質(zhì)和中間產(chǎn)物的供應(yīng)，從而顯著提高青蒿素的合成量，在青蒿素生物合成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。4.3油菜素內(nèi)酯調(diào)控青蒿素生物合成的信號傳導(dǎo)途徑油菜素內(nèi)酯（BR）對青蒿素生物合成的調(diào)控是通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)的，該途徑涉及一系列的信號分子和蛋白質(zhì)相互作用，精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)著青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)和代謝過程。BR信號的起始依賴于其與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合。在植物細(xì)胞中，油菜素內(nèi)酯不敏感1（Brassinosteroid-Insensitive1，BRI1）是BR的主要受體，它是一種富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶（LRR-RLK）。BRI1由胞外的LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域組成。當(dāng)BR存在時，BR首先與BRI1的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起B(yǎng)RI1構(gòu)象的變化，從而激活其胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域。研究表明，BR與BRI1的結(jié)合具有高度的特異性和親和力，能夠快速啟動信號傳導(dǎo)過程。在擬南芥中，BR與BRI1結(jié)合后，會導(dǎo)致BRI1發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的信號分子。這種磷酸化修飾就像一個信號開關(guān)，開啟了BR信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，使得信號能夠順利傳遞到下游的信號通路中。激活后的BRI1通過一系列的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，將信號傳遞給下游的關(guān)鍵激酶BRI1激酶抑制因子1（BKI1）和油菜素內(nèi)酯信號激酶1（BSK1）。BKI1在BR信號未激活時，與BRI1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制BRI1的活性，從而維持信號通路的關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)BR與BRI1結(jié)合后，BKI1從BRI1上解離下來，解除對BRI1的抑制作用，使得BRI1能夠進(jìn)一步激活下游信號分子。同時，激活的BRI1會與BSK1相互作用，將其磷酸化激活。磷酸化的BSK1能夠繼續(xù)激活下游的糖原合成酶激酶3（GSK3）家族蛋白，如油菜素內(nèi)酯不敏感2（BIN2）。研究發(fā)現(xiàn)，在BR處理后，BSK1的磷酸化水平顯著增加，并且與BIN2的相互作用增強(qiáng)，表明BSK1在BR信號從BRI1傳遞到BIN2的過程中發(fā)揮著重要的橋梁作用。BIN2是BR信號通路中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，它在未被激活的BR信號通路中處于活躍狀態(tài)。當(dāng)BIN2被激活后，它能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如油菜素內(nèi)酯抗性1（BZR1）和油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子1（BES1）。磷酸化的BZR1和BES1會被14-3-3蛋白結(jié)合，從而被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。而在BR信號激活后，BIN2的活性受到抑制，使得BZR1和BES1能夠去磷酸化。去磷酸化的BZR1和BES1能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與青蒿素生物合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明，在BR處理后的青蒿植株中，BZR1和BES1的去磷酸化形式含量增加，并且在細(xì)胞核中的積累量也顯著提高。這些去磷酸化的BZR1和BES1能夠特異性地識別并結(jié)合青蒿素生物合成關(guān)鍵酶基因（如ADS、CYP71AV1、DBR2等）啟動子區(qū)域的順式作用元件，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增加青蒿素的生物合成。通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BZR1在ADS基因啟動子區(qū)域存在多個特異性結(jié)合位點，當(dāng)BZR1與這些位點結(jié)合后，ADS基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，青蒿素的合成量也隨之增加。綜上所述，油菜素內(nèi)酯通過與BRI1受體結(jié)合，激活BRI1-BSK1-BIN2信號通路，調(diào)節(jié)BZR1和BES1的磷酸化狀態(tài)，從而調(diào)控青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，實現(xiàn)對青蒿素生物合成的調(diào)控。這一信號傳導(dǎo)途徑的揭示，為深入理解油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成中的作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為通過調(diào)控該信號通路提高青蒿素產(chǎn)量提供了新的靶點和思路。五、WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯的協(xié)同調(diào)控作用5.1兩者協(xié)同調(diào)控青蒿素生物合成的證據(jù)越來越多的實驗數(shù)據(jù)和研究文獻(xiàn)表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成過程中存在協(xié)同調(diào)控作用，共同影響著青蒿素的合成與積累。在轉(zhuǎn)錄水平上，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯處理能夠顯著影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，同時，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也參與了油菜素內(nèi)酯信號通路相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。例如，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對油菜素內(nèi)酯處理后的青蒿植株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因（如AaWRKY9）的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。當(dāng)用適宜濃度的油菜素內(nèi)酯處理青蒿幼苗時，AaWRKY9基因的表達(dá)水平在處理后的一定時間內(nèi)明顯上調(diào)。這表明油菜素內(nèi)酯能夠通過調(diào)控WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，間接影響青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠與油菜素內(nèi)酯信號通路中關(guān)鍵基因（如BRI1、BZR1等）的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控這些基因的表達(dá)。在酵母單雜交實驗中，證實了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與BZR1基因啟動子的相互作用，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠參與油菜素內(nèi)酯信號通路的調(diào)控。在蛋白質(zhì)互作層面，通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中的關(guān)鍵蛋白之間存在相互作用。例如，在酵母雙雜交實驗中，篩選出了與WRKY轉(zhuǎn)錄因子相互作用的油菜素內(nèi)酯信號通路蛋白。進(jìn)一步利用BiFC技術(shù)，在植物體內(nèi)觀察到了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與該蛋白之間的相互作用，表明它們在植物細(xì)胞內(nèi)能夠形成蛋白復(fù)合體。免疫共沉淀實驗也證實了這種相互作用的存在，并且發(fā)現(xiàn)這種相互作用會受到油菜素內(nèi)酯處理的影響。當(dāng)用油菜素內(nèi)酯處理青蒿植株后，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路蛋白之間的相互作用增強(qiáng)，這可能進(jìn)一步影響了青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控。從青蒿素含量變化的角度來看，對同時進(jìn)行WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和油菜素內(nèi)酯處理的青蒿植株進(jìn)行青蒿素含量測定，結(jié)果顯示，與單獨處理相比，兩者協(xié)同處理能夠更顯著地提高青蒿素的含量。在相關(guān)實驗中，將WRKY轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)的青蒿植株用油菜素內(nèi)酯處理后，青蒿素含量相較于未處理的過表達(dá)植株以及單獨用油菜素內(nèi)酯處理的野生型植株都有明顯增加。這充分證明了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成過程中具有協(xié)同促進(jìn)作用，它們通過相互作用，共同調(diào)節(jié)青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高青蒿素的合成量。綜上所述，無論是從基因表達(dá)、蛋白質(zhì)互作還是青蒿素含量變化等多個方面，都有充分的證據(jù)表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成過程中存在協(xié)同調(diào)控作用，它們共同構(gòu)成了一個復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對青蒿素的生物合成進(jìn)行著精準(zhǔn)調(diào)控。5.2協(xié)同調(diào)控的分子機(jī)制探討WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯在青蒿素生物合成過程中的協(xié)同調(diào)控涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，涵蓋基因表達(dá)調(diào)控和信號通路交互等多個層面。在基因表達(dá)調(diào)控層面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如BZR1和BES1，能夠共同作用于青蒿素生物合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過其保守的WRKY結(jié)構(gòu)域與啟動子中的W-box元件（TTGACC/T）特異性結(jié)合，而BZR1和BES1則與啟動子區(qū)域的其他順式作用元件相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，AaWRKY9與BZR1可以同時結(jié)合在ADS基因啟動子的不同區(qū)域，形成一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體。這種復(fù)合體的形成能夠增強(qiáng)對ADS基因轉(zhuǎn)錄的激活作用，使ADS基因的表達(dá)水平顯著提高，進(jìn)而促進(jìn)紫穗槐二烯的合成，為青蒿素生物合成提供更多的前體物質(zhì)。通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，當(dāng)AaWRKY9和BZR1共同作用時，ADS基因啟動子的活性相較于單獨作用時明顯增強(qiáng)。這表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)調(diào)控上存在協(xié)同作用，它們通過共同結(jié)合青蒿素生物合成相關(guān)基因的啟動子，協(xié)同激活基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)青蒿素的生物合成。從信號通路交互角度來看，油菜素內(nèi)酯信號通路的激活能夠影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，進(jìn)而間接調(diào)控青蒿素生物合成。當(dāng)油菜素內(nèi)酯與受體BRI1結(jié)合后，激活下游的信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致BIN2活性受到抑制，BZR1和BES1去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核。在這個過程中，去磷酸化的BZR1和BES1不僅可以直接調(diào)控青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，還能夠調(diào)控WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)。研究表明，BZR1可以結(jié)合到AaWRKY9基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)AaWRKY9基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)用油菜素內(nèi)酯處理青蒿植株時，BZR1的活性增強(qiáng)，使得AaWRKY9基因的表達(dá)量增加，進(jìn)而增強(qiáng)了AaWRKY9對青蒿素生物合成相關(guān)基因的調(diào)控作用。同時，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也可能通過影響油菜素內(nèi)酯信號通路中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，來調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯信號的傳導(dǎo)。雖然目前關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子對油菜素內(nèi)酯信號通路基因表達(dá)影響的具體機(jī)制還不完全清楚，但已有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能通過與油菜素內(nèi)酯信號通路中的某些調(diào)控元件相互作用，間接影響油菜素內(nèi)酯信號的傳遞和響應(yīng)。在一些植物中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠與油菜素內(nèi)酯信號通路中的負(fù)調(diào)控因子相互作用，解除其對信號通路的抑制作用，從而增強(qiáng)油菜素內(nèi)酯信號的傳導(dǎo)。這表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路之間存在雙向的交互作用，它們通過相互影響基因表達(dá)，實現(xiàn)對青蒿素生物合成的協(xié)同調(diào)控。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中的蛋白之間的相互作用，也在協(xié)同調(diào)控中發(fā)揮重要作用。如前所述，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中的關(guān)鍵蛋白存在相互作用，這些相互作用可能改變蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。WRKY轉(zhuǎn)錄因子與BZR1之間的相互作用，可能改變BZR1的DNA結(jié)合活性或轉(zhuǎn)錄激活活性，使其能夠更有效地調(diào)控青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和功能驗證實驗，發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與BZR1相互作用后，BZR1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，增強(qiáng)了其與ADS基因啟動子的結(jié)合能力，進(jìn)而促進(jìn)ADS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這種蛋白-蛋白相互作用介導(dǎo)的協(xié)同調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步豐富了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯協(xié)同調(diào)控青蒿素生物合成的分子機(jī)制。5.3環(huán)境因素對協(xié)同調(diào)控的影響環(huán)境因素在WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯協(xié)同調(diào)控青蒿素生物合成的過程中扮演著重要角色，光照、溫度和激素等環(huán)境因子能夠顯著影響它們的協(xié)同調(diào)控效果，進(jìn)而對青蒿素的合成產(chǎn)生重要影響。光照作為一種重要的環(huán)境信號，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯的協(xié)同調(diào)控具有顯著影響。不同光質(zhì)和光照強(qiáng)度會改變WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)以及油菜素內(nèi)酯信號通路的活性。研究表明，藍(lán)光和紅光能夠顯著誘導(dǎo)青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，同時也能影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。在藍(lán)光和紅光照射下，AaWRKY9基因的表達(dá)量明顯增加，同時油菜素內(nèi)酯信號通路中的關(guān)鍵基因BRI1和BZR1的表達(dá)也受到影響。這表明光信號能夠通過調(diào)節(jié)WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯信號通路，協(xié)同促進(jìn)青蒿素的生物合成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，光照還能夠影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯信號通路中關(guān)鍵蛋白之間的相互作用。在光照條件下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與BZR1之間的相互作用增強(qiáng)，這種增強(qiáng)的相互作用可能進(jìn)一步促進(jìn)了青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高青蒿素的合成量。溫度是另一個重要的環(huán)境因素，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯的協(xié)同調(diào)控也有顯著影響。適宜的溫度能夠促進(jìn)青蒿的生長和青蒿素的合成，而高溫或低溫脅迫則會抑制青蒿素的生物合成。研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)受到抑制，同時油菜素內(nèi)酯信號通路的活性也降低，導(dǎo)致青蒿素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，青蒿素的合成量減少。在低溫脅迫下，雖然WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)有所增加，但油菜素內(nèi)酯信號通路的活性受到抑制，使得WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯的協(xié)同調(diào)控作用受到影響，青蒿素的合成也受到抑制。這表明溫度通過影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯信號通路的活性，對它們的協(xié)同調(diào)控產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響青蒿素的生物合成。除了光照和溫度，其他激素如茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）等也能與WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯相互作用，共同調(diào)控青蒿素的生物合成。茉莉酸能夠誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，增強(qiáng)WRKY轉(zhuǎn)錄因子對青蒿素生物合成相關(guān)基因的調(diào)控作用。同時，茉莉酸還能與油菜素內(nèi)酯信號通路相互作用，調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯信號的傳導(dǎo)。研究表明，茉莉酸能夠促進(jìn)油菜素內(nèi)酯信號通路中關(guān)鍵蛋白BZR1的去磷酸化，增強(qiáng)BZR1的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)青蒿素的生物合成。脫落酸也能影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子與油菜素內(nèi)酯的協(xié)同調(diào)控。在干旱脅迫下，脫落酸含量增加，能夠誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，同時也能調(diào)節(jié)油菜素內(nèi)酯信號通路，增強(qiáng)它們對青蒿素生物合成的協(xié)同調(diào)控作用，從而提高青蒿素的合成量。綜上所述，光照、溫度、激素等環(huán)境因素通過影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子和油菜素內(nèi)酯信號通路的活性、基因表達(dá)以及蛋白-蛋白相互作用等，對它們的協(xié)同調(diào)控產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響青蒿素的生物合成。深入研究環(huán)境因素對協(xié)同調(diào)控的影響，有助于揭示青蒿素生物合成的環(huán)境調(diào)控機(jī)制，為通過環(huán)境調(diào)控手段提高青蒿素產(chǎn)量提供理論依據(jù)。六、研究成果與展望6.1研究成果總結(jié)本研究深入探究了WRKY轉(zhuǎn)錄因子及油菜素內(nèi)酯對中藥青蒿中青蒿素生物合成的調(diào)控機(jī)制，取得了一系列具有重要理論和實踐意義的研究成果。在WRKY轉(zhuǎn)錄因子對青蒿素生物合成的調(diào)控方面，成功篩選和鑒定出多個與青蒿素生物合成相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中對AaWRKY9的研究尤為深入。AaWRKY9能夠通過與青蒿素生物合成相關(guān)基因（如ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等）的啟動子區(qū)域特異性結(jié)合，直接調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而促進(jìn)青蒿素的生物合成。研究還發(fā)現(xiàn)，AaWRKY9的表達(dá)能夠同時響應(yīng)光信號和茉莉酸（JA）信號，在光依賴的JA信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。光照和JA信號能夠協(xié)同誘導(dǎo)AaWRKY9的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其對青蒿素生物合成相關(guān)基因的調(diào)控作用。此外，AaWRKY9與JA信號通路中的抑制因子AaJAZ9之間存在相互作用，在正常狀態(tài)下，AaJAZ9抑制AaWRKY9的轉(zhuǎn)錄激活活性，而當(dāng)用MeJA處理后，AaJAZ9被降解，解除對AaWRKY9的抑制，使其轉(zhuǎn)錄激活活性增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)青蒿素生物合成基因的表達(dá)。關(guān)于油菜素內(nèi)酯對青蒿素生物合成的調(diào)控，明確了油菜素內(nèi)酯能夠顯著上調(diào)青蒿素生物合成關(guān)鍵基因（如ADS、CYP71AV1、DBR2等）的表達(dá)，從而促進(jìn)青蒿素的生物合成。在油菜素內(nèi)酯調(diào)控青蒿素生物合成的信號傳導(dǎo)途徑方面，揭示了油菜素內(nèi)酯與細(xì)胞膜上的受體BRI1結(jié)合后，通過激活BRI1-BSK1-