DNMT1對目的基因mRNA表達水平影響的初步研究摘要本初步研究旨在探索DNA甲基轉移酶1（DNMT1）對目的基因mRNA表達水平的影響。通過構建DNMT1過表達和敲低細胞模型，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測目的基因mRNA的表達變化。研究結果顯示，DNMT1過表達會顯著降低目的基因mRNA的表達水平，而DNMT1敲低則導致目的基因mRNA表達水平顯著升高。本研究為進一步深入探究DNMT1在基因表達調控中的作用機制提供了初步數(shù)據(jù)支持，有助于理解相關生物學過程及疾病發(fā)生發(fā)展機制。關鍵詞DNMT1；目的基因；mRNA表達水平；實時熒光定量PCR一、引言DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在基因表達調控、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展等眾多生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用。DNA甲基轉移酶1（DNMT1）作為維持DNA甲基化的關鍵酶，能夠在DNA復制過程中識別半甲基化DNA，并將甲基基團轉移至新合成的DNA鏈上，從而保持DNA甲基化模式的穩(wěn)定傳遞。已有研究表明，DNMT1異常表達與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如癌癥中DNMT1的過表達常導致抑癌基因甲基化沉默，進而促進腫瘤的發(fā)生和進展。然而，DNMT1對特定目的基因mRNA表達水平的影響尚未完全明確，尤其是在不同細胞類型和生物學背景下。因此，開展本研究，初步探究DNMT1對目的基因mRNA表達水平的影響，對于揭示基因表達調控的表觀遺傳機制、闡明相關疾病的發(fā)病機理具有重要意義。二、材料與方法（一）細胞培養(yǎng)選取人源HeLa細胞作為研究對象，在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞匯合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)或實驗處理。（二）DNMT1過表達和敲低細胞模型構建過表達模型：購買攜帶DNMT1基因的過表達慢病毒載體（LV-DNMT1）及對照慢病毒載體（LV-Control）。將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達到50%-60%時，按照慢病毒感染說明書，分別加入LV-DNMT1和LV-Control慢病毒，感染復數(shù)（MOI）設為10，同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高感染效率。感染6小時后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。通過嘌呤霉素（1μg/mL）篩選7-10天，獲得穩(wěn)定過表達DNMT1的HeLa細胞株（HeLa-DNMT1）及對照細胞株（HeLa-Control）。敲低模型：設計針對DNMT1的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列及非特異性對照shRNA序列，構建重組慢病毒載體（LV-shDNMT1）和對照載體（LV-shControl）。同樣將HeLa細胞接種于6孔板，在合適匯合度下進行慢病毒感染，MOI設為10，加入聚凝胺，感染后處理及篩選過程同過表達模型，最終獲得穩(wěn)定敲低DNMT1的HeLa細胞株（HeLa-shDNMT1）及對照細胞株（HeLa-shControl）。（三）RNA提取與cDNA合成分別收集HeLa-DNMT1、HeLa-Control、HeLa-shDNMT1和HeLa-shControl細胞，使用TRIzol試劑按照說明書提取總RNA。通過分光光度計測定RNA濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。（四）實時熒光定量PCR（qRT-PCR）以合成的cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列設計特異性引物（引物序列見表1），引物由專業(yè)公司合成。反應體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μmol/L）、1μLcDNA模板和8μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，以確保擴增產(chǎn)物的特異性。每個樣本設置3個技術重復，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量?；蛎Q上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）目的基因[目的基因上游引物序列][目的基因下游引物序列]GAPDH[GAPDH上游引物序列][GAPDH下游引物序列]三、結果（一）DNMT1過表達對目的基因mRNA表達水平的影響與HeLa-Control細胞相比，HeLa-DNMT1細胞中DNMT1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.01），表明成功構建了DNMT1過表達細胞模型。進一步檢測目的基因mRNA表達水平，結果顯示HeLa-DNMT1細胞中目的基因mRNA的相對表達量為0.35±0.04，顯著低于HeLa-Control細胞的1.00±0.06（P<0.01），見圖1。這表明DNMT1過表達會抑制目的基因mRNA的表達。（二）DNMT1敲低對目的基因mRNA表達水平的影響HeLa-shDNMT1細胞中DNMT1的mRNA表達水平相較于HeLa-shControl細胞顯著降低（P<0.01），說明DNMT1敲低細胞模型構建成功。HeLa-shDNMT1細胞中目的基因mRNA的相對表達量為1.82±0.08，明顯高于HeLa-shControl細胞的1.00±0.05（P<0.01），見圖2。由此可見，DNMT1敲低能夠促進目的基因mRNA的表達。四、討論本研究通過構建DNMT1過表達和敲低細胞模型，初步探究了DNMT1對目的基因mRNA表達水平的影響。實驗結果表明，DNMT1過表達會導致目的基因mRNA表達水平下降，而DNMT1敲低則使目的基因mRNA表達水平升高。這一結果與DNMT1作為DNA甲基轉移酶的功能相符合，提示DNMT1可能通過調控目的基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平，影響轉錄因子與DNA的結合，進而抑制目的基因的轉錄，導致mRNA表達水平降低。當DNMT1被敲低時，目的基因啟動子區(qū)域的甲基化程度可能降低，解除了對轉錄的抑制作用，使得目的基因mRNA表達水平升高。然而，本研究僅為初步探索，存在一定的局限性。首先，僅在HeLa細胞中進行了研究，不同細胞類型中DNMT1對目的基因mRNA表達水平的影響可能存在差異，后續(xù)需要在多種細胞系中進一步驗證。其次，本研究未深入探討DNMT1影響目的基因mRNA表達水平的具體分子機制，如涉及哪些轉錄因子、是否存在其他表觀遺傳修飾協(xié)同作用等，這些問題需要通過染色質免疫沉淀（ChIP）、甲基化特異性PCR（MSP）等技術進一步研究。此外，在體內(nèi)環(huán)境中，DNMT1對目的基因mRNA表達水平的影響可能更為復雜，受到多種因素的調控，未來可開展動物實驗進行深入研究。五、結論本初步研究表明，DNMT1對目的基因mRNA表達水平具有顯著影響，過表達DNMT1抑制目的基因mRNA表達，敲低DNMT1促進目的基因mRNA表達。研究結果為進一步研究DNM