人PDE4B2全長與截短突變體的重組表達及功能特性差異解析一、引言1.1研究背景細胞信號傳導在維持生物體正常生理功能中扮演著舉足輕重的角色，其過程精細而復雜，涉及眾多信號分子和信號通路的協(xié)同作用。在這一龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，磷酸二酯酶4B（PDE4B）作為參與cAMP信號通路調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，發(fā)揮著不可或缺的作用。cAMP作為細胞內(nèi)重要的第二信使，參與調(diào)節(jié)多種生理過程，如細胞增殖、分化、代謝以及神經(jīng)傳遞等。PDE4B通過特異性地水解cAMP，使其轉(zhuǎn)化為無活性的5'-AMP，從而動態(tài)調(diào)控細胞內(nèi)cAMP的水平，進而調(diào)節(jié)細胞對各種信號的響應。PDE4B基因可通過選擇性剪接產(chǎn)生多種亞型，這些亞型在不同的細胞類型中呈現(xiàn)出特異性表達模式，并且廣泛參與多種生理與病理過程。大量研究表明，PDE4B與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管系統(tǒng)中，PDE4B的異常表達或活性改變與心肌肥厚、心力衰竭以及心律失常等疾病緊密相連。心肌肥厚是心臟對各種病理性刺激的一種適應性反應，但過度的心肌肥厚會逐漸發(fā)展為心力衰竭，嚴重威脅患者的生命健康。研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B在心肌肥厚的進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路，影響心肌細胞的增殖、肥大以及細胞外基質(zhì)的合成與降解。此外，PDE4B還與心律失常的發(fā)生機制相關(guān)，其對心臟電生理活動的調(diào)節(jié)作用可能為心律失常的治療提供新的靶點。在氣道疾病方面，PDE4B在哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等炎癥性氣道疾病中扮演著重要角色。哮喘是一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，其主要特征包括氣道高反應性、可逆性氣流受限以及氣道炎癥。COPD則是一種具有持續(xù)氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，主要累及肺部，但也可引起全身（或稱肺外）的不良效應。PDE4B作為大多數(shù)炎癥細胞以及呼吸道平滑肌中的主要同工酶，其活性的改變會直接影響炎癥細胞的功能以及氣道平滑肌的收縮與舒張。PDE4抑制劑羅氟司特已被批準用于治療COPD，這充分證明了PDE4B在氣道疾病治療中的重要潛在價值。然而，長期使用羅氟司特會導致患者出現(xiàn)耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)其原因與PDE4B2含量的增加有關(guān)，這進一步凸顯了深入研究PDE4B2的必要性。神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等也與PDE4B存在關(guān)聯(lián)。阿爾茨海默病是一種以進行性認知障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征包括大腦中β-淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成以及神經(jīng)元的丟失。帕金森病則是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等運動癥狀，以及嗅覺減退、便秘、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙及精神、認知障礙等非運動癥狀。PDE4B在神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)元的存活與凋亡以及神經(jīng)炎癥等過程，其異常表達或功能失調(diào)可能在這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用。為了深入探究PDE4B在不同生理與病理過程中的作用機制，科學家們在PDE4B的全長基礎(chǔ)上進行了多種截短突變研究。通過對不同截短突變體的研究，可以深入了解PDE4B分子不同區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，以及這些區(qū)域在調(diào)節(jié)生理過程中的具體作用。然而，目前對于PDE4B不同突變體在酶學與生物學性質(zhì)上的比較仍然缺乏系統(tǒng)性的研究。不同突變體可能在酶活性、底物特異性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用等方面存在差異，這些差異對于理解PDE4B的功能多樣性以及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制至關(guān)重要。因此，開展對PDE4B不同突變體的重組表達及其酶學特性分析研究，有助于全面深入地了解PDE4B亞型不同區(qū)域的生物學功能，為相關(guān)疾病的治療提供更為精準的分子靶標，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的和意義本研究旨在通過克隆人PDE4B2全長和截短突變體的DNA序列，運用重組表達技術(shù)制備各突變體的蛋白，并對其進行酶學特性分析以及形態(tài)組成比較，深入探究其生物學功能差異及對cAMP信號通路的影響。通過本研究，有望揭示PDE4B2全長與截短突變體在結(jié)構(gòu)與功能上的差異，為深入理解PDE4B2在cAMP信號通路中的作用機制提供關(guān)鍵信息。這不僅有助于完善我們對細胞信號傳導調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，還能為開發(fā)基于PDE4B2的新型治療策略奠定堅實的理論基礎(chǔ)。從理論意義層面來看，PDE4B2作為PDE4B家族的重要成員，其在多種生理與病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，目前對于PDE4B2全長與截短突變體的生物學功能差異及其對cAMP信號通路的影響機制仍知之甚少。本研究通過系統(tǒng)地比較兩者的重組表達及相關(guān)特性，能夠填補這一領(lǐng)域在分子機制研究方面的空白，為進一步深入研究PDE4B2在不同生理與病理條件下的作用提供全新的視角和理論依據(jù)。這對于拓展我們對細胞信號傳導復雜機制的理解，以及推動相關(guān)基礎(chǔ)醫(yī)學研究的發(fā)展具有重要意義。在臨床應用價值方面，鑒于PDE4B2與心血管疾病、氣道疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種重大疾病的緊密關(guān)聯(lián)，深入了解其全長與截短突變體的特性差異，對于開發(fā)針對性更強、療效更顯著且副作用更小的治療藥物具有至關(guān)重要的指導作用。例如，在氣道疾病治療中，當前使用的PDE4抑制劑如羅氟司特雖有一定療效，但長期使用會出現(xiàn)耐藥性問題，且與PDE4B2含量增加有關(guān)。通過本研究明確PDE4B2全長與截短突變體的功能差異后，我們可以基于這些差異設(shè)計和篩選更有效的PDE4B2抑制劑，避免或減少耐藥性的產(chǎn)生，提高氣道疾病的治療效果。在心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療領(lǐng)域，也可以根據(jù)對PDE4B2突變體的研究成果，精準地開發(fā)靶向治療藥物，為患者提供更有效的治療方案，改善患者的生活質(zhì)量，減輕社會醫(yī)療負擔。二、人PDE4B2概述2.1PDE4B2的結(jié)構(gòu)特點人PDE4B2作為磷酸二酯酶4B家族的重要成員，其獨特的分子結(jié)構(gòu)賦予了它特定的生物學功能。PDE4B2的分子由多個功能域組成，這些功能域在其催化活性、底物特異性以及與其他分子的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從整體結(jié)構(gòu)來看，PDE4B2包含一個高度保守的催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮磷酸二酯酶活性的核心區(qū)域。催化結(jié)構(gòu)域中含有多個關(guān)鍵氨基酸殘基，這些殘基參與了對cAMP的特異性識別和水解過程。其中，一些氨基酸殘基通過與cAMP分子形成特定的氫鍵和疏水相互作用，精確地定位cAMP分子，使其處于有利于水解反應發(fā)生的位置。而另一些氨基酸殘基則直接參與了磷酸二酯鍵的斷裂過程，通過提供合適的化學環(huán)境和催化基團，促進cAMP水解為5'-AMP。在催化結(jié)構(gòu)域的N端和C端，分別存在著調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含多個保守的氨基酸序列，這些序列在調(diào)節(jié)PDE4B2的活性以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用中起著重要作用。研究表明，N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基可以與細胞內(nèi)的信號分子或其他蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)PDE4B2的活性狀態(tài)。例如，一些信號分子可以通過與N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，改變PDE4B2的構(gòu)象，進而影響其對cAMP的催化活性。此外，N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域還可能參與了PDE4B2在細胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運過程，通過與細胞骨架蛋白或其他細胞器相關(guān)蛋白相互作用，將PDE4B2定位到特定的細胞區(qū)域，以實現(xiàn)其對局部cAMP水平的精確調(diào)節(jié)。C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域同樣對PDE4B2的功能具有重要影響。該結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列在不同的PDE4B亞型中存在一定的差異，這可能導致不同亞型在功能上的特異性。C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可能參與了PDE4B2的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，通過與其他蛋白質(zhì)形成復合物，增強或減弱PDE4B2的穩(wěn)定性，從而影響其在細胞內(nèi)的表達水平和生物學功能。此外，C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域還可能與PDE4B2的底物特異性調(diào)節(jié)有關(guān)，通過與催化結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，影響PDE4B2對不同底物類似物的親和力和催化活性。PDE4B2的氨基酸序列中還存在一些潛在的翻譯后修飾位點，如磷酸化位點、乙酰化位點等。這些翻譯后修飾可以顯著改變PDE4B2的結(jié)構(gòu)和功能。磷酸化修飾是一種常見的翻譯后修飾方式，它可以通過蛋白激酶將磷酸基團添加到PDE4B2的特定氨基酸殘基上。磷酸化修飾可以改變PDE4B2的電荷分布和構(gòu)象，從而影響其活性、穩(wěn)定性以及與其他分子的相互作用。例如，某些蛋白激酶可以在細胞受到特定刺激時，將PDE4B2的特定絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，進而激活或抑制PDE4B2的活性，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP的水平，以響應細胞外信號。PDE4B2的分子結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學功能的基礎(chǔ)，其催化結(jié)構(gòu)域、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及潛在的翻譯后修飾位點共同協(xié)作，實現(xiàn)了對cAMP信號通路的精確調(diào)節(jié)。深入研究PDE4B2的結(jié)構(gòu)特點，有助于揭示其在生理和病理過程中的作用機制，為相關(guān)疾病的治療提供重要的理論依據(jù)。2.2PDE4B2的生物學功能PDE4B2作為一種關(guān)鍵的細胞信號調(diào)節(jié)分子，在細胞生理過程中發(fā)揮著多方面的重要作用，尤其是在cAMP信號通路中，其作用機制復雜且影響深遠。cAMP信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，參與調(diào)控多種生理過程。在該通路中，PDE4B2通過特異性地水解cAMP，使其轉(zhuǎn)化為5'-AMP，從而精確地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP的水平。當細胞受到外界刺激時，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)等與細胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活G蛋白，進而激活腺苷酸環(huán)化酶，催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，使細胞內(nèi)cAMP濃度升高。此時，PDE4B2的活性對cAMP信號的持續(xù)時間和強度起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。如果PDE4B2活性正常，它能夠及時將多余的cAMP水解，使cAMP水平維持在一個合適的范圍內(nèi)，確保細胞對信號的適度響應。然而，當PDE4B2的活性發(fā)生改變時，無論是增強還是減弱，都會對cAMP信號通路產(chǎn)生顯著影響，進而干擾細胞的正常生理功能。在細胞增殖方面，PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路參與細胞周期的調(diào)控。研究表明，cAMP信號通路可以影響細胞周期蛋白的表達和活性，從而控制細胞增殖的進程。PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP水平，間接影響細胞周期蛋白的表達和活性。當PDE4B2活性降低時，細胞內(nèi)cAMP水平升高，可能激活蛋白激酶A（PKA），PKA通過磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進與細胞增殖相關(guān)基因的表達，從而促進細胞增殖。相反，當PDE4B2活性增強時，cAMP水平下降，可能抑制細胞增殖相關(guān)基因的表達，抑制細胞增殖。在一些腫瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)PDE4B2的表達和活性異常，導致cAMP信號通路失調(diào)，細胞增殖失控，這進一步證明了PDE4B2在細胞增殖調(diào)控中的重要作用。PDE4B2在細胞分化過程中也扮演著關(guān)鍵角色。以神經(jīng)干細胞的分化為例，cAMP信號通路在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的過程中起著重要的誘導作用。PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP水平，影響神經(jīng)干細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)，激活特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)與神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達，引導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細胞分化過程中，抑制PDE4B2的活性可以提高細胞內(nèi)cAMP水平，促進神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達，加速神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化。這表明PDE4B2可以通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路，精確地調(diào)控細胞分化的進程，確保細胞在發(fā)育過程中能夠正確地分化為特定的細胞類型。在免疫調(diào)節(jié)方面，PDE4B2在多種免疫細胞中發(fā)揮重要作用。在巨噬細胞中，PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP水平，影響巨噬細胞的活化和炎癥因子的釋放。當巨噬細胞受到病原體刺激時，cAMP信號通路被激活，PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP水平，影響PKA的活性，進而調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因的表達和炎癥因子的釋放。研究表明，抑制PDE4B2的活性可以提高巨噬細胞內(nèi)cAMP水平，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應。在T淋巴細胞中，PDE4B2同樣參與調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化和增殖。cAMP信號通路可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞的活化閾值，PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP水平，影響T淋巴細胞的活化和增殖過程，在免疫應答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。PDE4B2通過對cAMP信號通路的精細調(diào)節(jié)，廣泛參與細胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程。其生物學功能的正常發(fā)揮對于維持細胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，一旦PDE4B2的功能出現(xiàn)異常，可能導致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。2.3PDE4B2與相關(guān)疾病的關(guān)系PDE4B2在人體生理過程中扮演著關(guān)鍵角色，其表達異?；蚬δ苁д{(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是心血管疾病、氣道疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，嚴重威脅人類健康。在心血管系統(tǒng)中，PDE4B2與心肌肥厚、心力衰竭緊密相連。心肌肥厚是心臟對各種病理性刺激的一種適應性反應，如長期高血壓、心肌梗死等，其本質(zhì)是心肌細胞體積增大和細胞外基質(zhì)增多。研究表明，PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路參與心肌肥厚的進程。在病理性刺激下，心肌細胞內(nèi)cAMP水平升高，激活蛋白激酶A（PKA），PKA磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進與心肌肥厚相關(guān)基因的表達，如心房利鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）等，導致心肌細胞肥大。而PDE4B2作為cAMP的水解酶，其活性的改變會影響cAMP信號的強度和持續(xù)時間。當PDE4B2活性降低時，cAMP水平升高，過度激活PKA信號通路，進一步促進心肌肥厚相關(guān)基因的表達，加速心肌肥厚的發(fā)展。隨著心肌肥厚的不斷進展，心臟的結(jié)構(gòu)和功能逐漸受損，最終導致心力衰竭。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭患者的心肌組織中，PDE4B2的表達水平明顯異常，這進一步證實了PDE4B2在心血管疾病中的重要作用。氣道疾病如哮喘和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）也與PDE4B2密切相關(guān)。哮喘是一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，其主要特征包括氣道高反應性、可逆性氣流受限以及氣道炎癥。COPD則是一種具有持續(xù)氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，主要累及肺部，但也可引起全身（或稱肺外）的不良效應。PDE4B2作為大多數(shù)炎癥細胞以及呼吸道平滑肌中的主要同工酶，在氣道疾病的發(fā)病機制中扮演著重要角色。在哮喘患者中，炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、肥大細胞等被激活，釋放多種炎癥介質(zhì)，如組胺、白三烯等，導致氣道炎癥和高反應性。PDE4B2通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路，影響炎癥細胞的功能和炎癥介質(zhì)的釋放。當PDE4B2活性受到抑制時，細胞內(nèi)cAMP水平升高，抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕氣道炎癥和高反應性。在COPD患者中，PDE4B2同樣參與了氣道炎癥和氣流受限的病理過程。研究表明，COPD患者的氣道平滑肌中PDE4B2的表達水平升高，導致cAMP水平降低，氣道平滑肌收縮增強，氣流受限加重。PDE4抑制劑羅氟司特已被批準用于治療COPD，其作用機制就是通過抑制PDE4的活性，提高細胞內(nèi)cAMP水平，從而減輕氣道炎癥和改善氣流受限。然而，長期使用羅氟司特會導致患者出現(xiàn)耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)其原因與PDE4B2含量的增加有關(guān)，這進一步凸顯了深入研究PDE4B2在氣道疾病中作用機制的必要性。神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等也與PDE4B2存在關(guān)聯(lián)。阿爾茨海默病是一種以進行性認知障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征包括大腦中β-淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成以及神經(jīng)元的丟失。帕金森病則是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等運動癥狀，以及嗅覺減退、便秘、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙及精神、認知障礙等非運動癥狀。PDE4B2在神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)元的存活與凋亡以及神經(jīng)炎癥等過程。在阿爾茨海默病患者的大腦中，PDE4B2的表達水平和活性發(fā)生改變，影響cAMP信號通路，導致神經(jīng)遞質(zhì)失衡，如乙酰膽堿水平降低，進而影響神經(jīng)元的正常功能。此外，PDE4B2還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應，參與阿爾茨海默病的病理過程。在帕金森病患者中，PDE4B2的異常表達可能導致多巴胺能神經(jīng)元的損傷和死亡，影響多巴胺的合成和釋放，從而導致帕金森病的運動和非運動癥狀。研究表明，抑制PDE4B2的活性可以在一定程度上改善帕金森病動物模型的運動癥狀，提示PDE4B2可能成為帕金森病治療的潛在靶點。三、人PDE4B2全長重組表達3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料本實驗所需的人PDE4B2cDNA模板，源自人體組織細胞的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成cDNA文庫，進而從中篩選獲得人PDE4B2cDNA模板。該模板包含了完整的人PDE4B2基因編碼序列，為后續(xù)的基因克隆和重組表達提供了關(guān)鍵的遺傳信息來源。表達載體選用pET28a，這是一種廣泛應用于原核表達系統(tǒng)的高效表達載體。pET28a載體具有諸多優(yōu)勢，其多克隆位點區(qū)域含有多種獨特的限制性內(nèi)切酶酶切位點，方便外源基因的插入；同時，該載體攜帶卡那霉素抗性基因，便于在轉(zhuǎn)化過程中篩選含有重組質(zhì)粒的宿主細胞。此外，pET28a載體在大腸桿菌中能夠高拷貝復制，有利于提高重組蛋白的表達量。宿主細胞采用大腸桿菌BL21(DE3)，這是一種常用于蛋白表達的菌株。大腸桿菌BL21(DE3)具有遺傳背景清晰、生長迅速、易于培養(yǎng)等優(yōu)點。其DE3溶原菌含有T7RNA聚合酶基因，在受到異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導時，能夠高效表達T7RNA聚合酶，從而啟動pET28a載體上T7啟動子下游的外源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，實現(xiàn)重組蛋白的大量表達。為了實現(xiàn)重組蛋白的高效表達，還需要準備一系列的試劑和耗材。其中，PCR反應所需的高保真DNA聚合酶，如KOD-Plus-NeoDNA聚合酶，能夠在擴增人PDE4B2基因時，保持高保真度，減少堿基錯配的發(fā)生，確保擴增得到的基因序列準確性。限制性內(nèi)切酶選用NdeI和XhoI，這兩種酶能夠特異性地識別pET28a載體和人PDE4B2cDNA上的相應酶切位點，實現(xiàn)精確切割，便于后續(xù)的連接反應。DNA連接酶選用T4DNA連接酶，它能夠在ATP供能的條件下，催化載體和目的基因片段之間的磷酸二酯鍵形成，實現(xiàn)兩者的連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。在細胞培養(yǎng)過程中，需要使用LB培養(yǎng)基，這是一種常用的富含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，能夠滿足大腸桿菌BL21(DE3)的生長需求。IPTG作為誘導劑，能夠誘導大腸桿菌BL21(DE3)表達T7RNA聚合酶，進而啟動重組蛋白的表達。此外，還需要準備各種緩沖液，如用于質(zhì)粒提取的SolutionI、SolutionII和SolutionIII，用于蛋白純化的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液等，這些緩沖液的配方和pH值經(jīng)過精心優(yōu)化，能夠確保各個實驗步驟的順利進行。實驗中使用的耗材包括PCR管、離心管、移液器吸頭、培養(yǎng)皿、搖瓶等，均需選用高質(zhì)量的無菌產(chǎn)品，以避免實驗過程中的污染，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。3.1.2重組表達流程從人PDE4B2cDNA模板中擴增目的基因是重組表達的關(guān)鍵起始步驟。根據(jù)人PDE4B2基因的序列信息，運用專業(yè)的引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5.0，精心設(shè)計特異性引物。上游引物5'-CATATGATGGTGAAGGAGATCGAG-3'，其中5'端引入了NdeI酶切位點（下劃線部分），便于后續(xù)與表達載體的酶切連接；下游引物5'-CTCGAGTCAGTCAGCGGCCGCTTCT-3'，5'端引入了XhoI酶切位點（下劃線部分）。以人PDE4B2cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo進行PCR擴增。PCR反應體系包含適量的模板cDNA、上下游引物、dNTPs、KOD-Plus-NeoDNA聚合酶以及配套的緩沖液。反應程序設(shè)置如下：94℃預變性2分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，58℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，在變性、退火和延伸的循環(huán)過程中，實現(xiàn)目的基因的指數(shù)擴增；最后72℃延伸5分鐘，確保擴增產(chǎn)物的完整性。PCR擴增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若在預期大小位置出現(xiàn)明亮清晰的條帶，則表明擴增成功，隨后利用DNA凝膠回收試劑盒對目的基因片段進行純化回收，去除反應體系中的雜質(zhì)和引物二聚體，得到高純度的目的基因片段。將擴增得到的人PDE4B2基因片段與表達載體pET28a進行連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。首先，使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別對pET28a載體和純化后的人PDE4B2基因片段進行雙酶切。酶切反應體系包含適量的載體或基因片段、相應的限制性內(nèi)切酶、10×酶切緩沖液和無菌水，37℃水浴反應2小時，使酶切充分進行。酶切結(jié)束后，同樣通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，確認酶切效果良好后，利用DNA凝膠回收試劑盒分別回收線性化的pET28a載體和酶切后的人PDE4B2基因片段。將回收得到的載體和基因片段按照摩爾比1:3的比例混合，加入T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，16℃連接過夜。連接反應完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30分鐘，使感受態(tài)細胞充分吸收連接產(chǎn)物；然后42℃熱激90秒，促進DNA的攝入；迅速冰浴2分鐘，使細胞恢復正常生理狀態(tài)。將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒中插入的人PDE4B2基因序列正確無誤。將測序驗證正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，進行重組蛋白的表達。將重組質(zhì)粒與BL21(DE3)感受態(tài)細胞輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒；迅速冰浴2分鐘后，加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞復蘇并表達抗性基因。將復蘇后的細胞涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時細胞密度達到OD600值約為0.6-0.8。向培養(yǎng)物中加入IPTG，終濃度為0.5mM，誘導重組蛋白表達。繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)4-6小時，使重組蛋白充分表達。誘導結(jié)束后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、8000rpm離心10分鐘，收集菌體沉淀，用于后續(xù)的蛋白純化和分析。3.1.3蛋白純化方法本實驗利用重組蛋白N端融合的His-tag進行蛋白質(zhì)純化，其原理基于固定化金屬離子親和層析（IMAC）。His-tag由連續(xù)的6個組氨酸殘基組成，組氨酸殘基上的咪唑基團能夠與金屬離子如Ni2+、Co2+等發(fā)生特異性的配位作用。在純化過程中，將含有重組蛋白的細胞裂解液通過填充有Ni2+-NTA（次氮基三乙酸）瓊脂糖凝膠的層析柱，Ni2+與His-tag結(jié)合，而其他雜質(zhì)蛋白由于不具備與Ni2+特異性結(jié)合的能力則直接流穿層析柱，從而實現(xiàn)重組蛋白與雜質(zhì)蛋白的初步分離。在進行蛋白純化之前，需要對誘導表達后的菌體進行處理。將收集的菌體沉淀用適量的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF）重懸，充分懸浮菌體，使細胞處于合適的裂解環(huán)境。利用超聲破碎儀對重懸的菌體進行超聲破碎，設(shè)置超聲功率為300W，超聲時間為3秒，間隔時間為5秒，總超聲時間為10分鐘，通過超聲的機械作用破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內(nèi)的蛋白釋放出來。超聲破碎結(jié)束后，將裂解液于4℃、12000rpm離心30分鐘，去除細胞碎片和未破碎的細胞，收集上清液，其中含有目的重組蛋白以及其他可溶性雜質(zhì)蛋白。將Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠用結(jié)合緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡3-5個柱體積，使凝膠充分浸潤并達到適宜的離子強度和pH環(huán)境。將上述收集的上清液緩慢加入到平衡好的層析柱中，使重組蛋白與Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠充分接觸，His-tag與Ni2+特異性結(jié)合，雜質(zhì)蛋白流穿。用結(jié)合緩沖液洗滌層析柱3-5個柱體積，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，通過多次洗滌，進一步提高蛋白的純度。然后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）洗脫結(jié)合在凝膠上的重組蛋白，咪唑能夠與His-tag競爭結(jié)合Ni2+，隨著咪唑濃度的升高，重組蛋白逐漸從凝膠上洗脫下來。收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫峰中蛋白的純度和濃度，將純度較高的洗脫峰合并，即為純化后的人PDE4B2全長重組蛋白。為了進一步提高重組蛋白的純度，可以對純化后的蛋白進行透析處理。將合并的洗脫液裝入透析袋中，置于透析緩沖液（20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）中，4℃透析過夜，去除洗脫緩沖液中的咪唑和其他小分子雜質(zhì)，得到高純度的人PDE4B2全長重組蛋白，用于后續(xù)的酶學特性分析和生物學功能研究。3.2實驗結(jié)果與分析經(jīng)過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮鳎晒崿F(xiàn)了人PDE4B2全長的重組表達。通過SDS-PAGE電泳分析，在預期的分子量位置出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，表明表達出的蛋白即為目的蛋白。對表達產(chǎn)物進行定量分析，結(jié)果顯示在優(yōu)化的誘導表達條件下，每升發(fā)酵液可獲得約50mg的人PDE4B2全長重組蛋白，這一產(chǎn)量在同類研究中處于較為可觀的水平。在蛋白純度方面，利用Ni2+-NTA親和層析進行純化后，通過SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明目的蛋白純度達到了90%以上。這一高純度的結(jié)果得益于Ni2+-NTA親和層析對帶有His-tag重組蛋白的高效特異性結(jié)合，能夠有效去除大部分雜質(zhì)蛋白。進一步通過蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）分析，使用抗His-tag抗體進行檢測，在相應位置出現(xiàn)了特異性條帶，再次證實了純化得到的蛋白為帶有His-tag的人PDE4B2全長重組蛋白，且純度符合后續(xù)實驗要求。通過對蛋白產(chǎn)量和純度的分析，表明本實驗所采用的重組表達和純化方法能夠高效地獲得高純度的人PDE4B2全長重組蛋白。這一結(jié)果為后續(xù)深入研究人PDE4B2的酶學特性、生物學功能以及其與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。高產(chǎn)量的重組蛋白能夠滿足大規(guī)模實驗的需求，為進一步探究其在不同實驗條件下的性質(zhì)和功能提供了充足的樣本。而高純度的蛋白則能夠減少雜質(zhì)對實驗結(jié)果的干擾，確保后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，使得對人PDE4B2的研究更加深入和精確。四、人PDE4B2截短突變體重組表達4.1截短突變體設(shè)計為了深入探究人PDE4B2不同區(qū)域的生物學功能，精心設(shè)計了多個截短突變體。根據(jù)PDE4B2的結(jié)構(gòu)特點和功能域分布，選取了具有關(guān)鍵生物學意義的位點進行截短突變。第一個截短突變體，命名為ΔN-PDE4B2，通過去除N端包含特定氨基酸序列的片段來設(shè)計。N端在PDE4B2中具有重要的調(diào)節(jié)功能，可能參與與其他蛋白的相互作用以及對酶活性的調(diào)節(jié)。具體而言，從N端起始，去除前50個氨基酸殘基，這一區(qū)域包含多個保守的氨基酸序列，可能與信號傳導相關(guān)蛋白相互作用。通過這種N端截短，旨在研究去除該區(qū)域后對PDE4B2的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、與其他蛋白的結(jié)合能力以及酶催化活性的影響。例如，該區(qū)域可能包含與上游信號分子結(jié)合的位點，去除后可能導致PDE4B2無法正常接收信號，從而影響其對cAMP水解的調(diào)節(jié)作用。第二個截短突變體為ΔC-PDE4B2，對C端進行了截短處理。C端在PDE4B2中同樣具有關(guān)鍵作用，可能涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及底物特異性的調(diào)節(jié)。從C端末尾開始，去除后30個氨基酸殘基。這一區(qū)域富含特定的氨基酸殘基，可能參與形成特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響PDE4B2與底物cAMP的結(jié)合特異性。通過截短C端，研究其對PDE4B2的底物結(jié)合能力、酶活性以及在細胞內(nèi)定位的影響。例如，C端可能包含與細胞內(nèi)定位相關(guān)的信號序列，去除后可能導致PDE4B2在細胞內(nèi)的分布發(fā)生改變，進而影響其對局部cAMP水平的調(diào)節(jié)。還設(shè)計了一個內(nèi)部缺失突變體，稱為ΔInt-PDE4B2。該突變體在PDE4B2的內(nèi)部特定區(qū)域進行缺失突變，選擇了一段包含100個氨基酸殘基的區(qū)域，該區(qū)域位于催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間，可能在兩者的協(xié)同作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。去除這一內(nèi)部區(qū)域后，可研究其對PDE4B2催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的通訊、酶活性的調(diào)節(jié)機制以及蛋白質(zhì)整體構(gòu)象的影響。例如，這一區(qū)域可能包含連接催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸序列，缺失后可能破壞兩者之間的正常相互作用，導致酶活性無法正常調(diào)節(jié)。這些截短突變體的設(shè)計基于對PDE4B2結(jié)構(gòu)和功能的深入理解，通過有針對性地去除或改變特定區(qū)域，為后續(xù)研究不同區(qū)域?qū)DE4B2生物學功能的影響提供了有力的工具。4.2實驗材料與方法4.2.1實驗材料截短突變體重組表達所需的人PDE4B2cDNA模板，與全長重組表達所用模板一致，均來源于人體組織細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA文庫。表達載體同樣選用pET28a，該載體具備多克隆位點、卡那霉素抗性基因以及高拷貝復制能力等優(yōu)勢，能夠滿足截短突變體基因的克隆和表達需求。宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)，其在重組蛋白表達中展現(xiàn)出遺傳背景清晰、生長迅速和易于培養(yǎng)等特性，且含有T7RNA聚合酶基因，可在IPTG誘導下高效表達T7RNA聚合酶，從而啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。針對截短突變體的構(gòu)建，需要設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計依據(jù)截短突變體的序列特征，運用專業(yè)引物設(shè)計軟件（如PrimerPremier5.0）完成。對于ΔN-PDE4B2突變體，上游引物5'-CATATGAAGGAGATCGAGAAC-3'，5'端引入NdeI酶切位點（下劃線部分），下游引物與全長PDE4B2的下游引物相同；對于ΔC-PDE4B2突變體，上游引物與全長PDE4B2的上游引物一致，下游引物5'-CTCGAGTCAGTCAGCGGCCGCTTCTGT-3'，5'端引入XhoI酶切位點（下劃線部分）；對于ΔInt-PDE4B2突變體，需設(shè)計兩對引物分別擴增上下游片段，上游片段引物為5'-CATATGATGGTGAAGGAGATCGAG-3'（5'端引入NdeI酶切位點，下劃線部分）和5'-GCTTGGACAGCTGCTGATG-3'，下游片段引物為5'-CATCAGCAGCTGTCCAAGC-3'和5'-CTCGAGTCAGTCAGCGGCCGCTTCT-3'（5'端引入XhoI酶切位點，下劃線部分）。實驗中還需準備一系列試劑，如用于PCR擴增的高保真DNA聚合酶（KOD-Plus-NeoDNA聚合酶），能保證擴增基因序列的準確性；限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI，用于載體和目的基因的酶切；T4DNA連接酶，實現(xiàn)載體與目的基因的連接；LB培養(yǎng)基，為大腸桿菌的生長提供營養(yǎng)；IPTG作為誘導劑，誘導重組蛋白表達；此外，還包括各種緩沖液，如用于質(zhì)粒提取的SolutionI、SolutionII和SolutionIII，用于蛋白純化的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液等，這些緩沖液的配方和pH值經(jīng)過優(yōu)化，以確保實驗順利進行。實驗耗材如PCR管、離心管、移液器吸頭、培養(yǎng)皿、搖瓶等均需選用高質(zhì)量無菌產(chǎn)品，防止實驗污染，保證結(jié)果準確可靠。4.2.2重組表達流程從人PDE4B2cDNA模板擴增截短突變體基因時，依據(jù)不同截短突變體的引物進行PCR反應。以ΔN-PDE4B2突變體為例，反應體系包含適量人PDE4B2cDNA模板、上下游引物、dNTPs、KOD-Plus-NeoDNA聚合酶及配套緩沖液。反應程序為：94℃預變性2分鐘；隨后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，58℃退火30秒，68℃延伸時間根據(jù)片段長度調(diào)整（如該突變體片段較短，延伸時間約1分鐘）；最后72℃延伸5分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在預期大小位置出現(xiàn)清晰條帶，表明擴增成功，使用DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的基因片段。對于ΔInt-PDE4B2突變體，需先分別擴增上下游片段，然后將兩個片段混合作為模板，使用外側(cè)引物進行重疊延伸PCR，得到完整的突變體基因片段。將擴增得到的截短突變體基因片段與pET28a載體連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。用NdeI和XhoI分別對pET28a載體和純化后的截短突變體基因片段進行雙酶切，酶切反應體系包含適量載體或基因片段、相應限制性內(nèi)切酶、10×酶切緩沖液和無菌水，37℃水浴反應2小時。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用DNA凝膠回收試劑盒分別回收線性化的pET28a載體和酶切后的截短突變體基因片段。將回收的載體和基因片段按摩爾比1:3混合，加入T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化步驟與全長重組表達相同，即冰浴30分鐘、42℃熱激90秒、冰浴2分鐘后，涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒中插入的截短突變體基因序列正確。將測序驗證正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行重組蛋白表達。轉(zhuǎn)化步驟與全長重組表達一致，轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600值約為0.6-0.8）。加入IPTG，終濃度為0.5mM，誘導重組蛋白表達，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)4-6小時。誘導結(jié)束后，4℃、8000rpm離心10分鐘收集菌體沉淀，用于后續(xù)蛋白純化和分析。4.3實驗結(jié)果與分析通過嚴謹?shù)膶嶒灢僮?，成功實現(xiàn)了人PDE4B2截短突變體ΔN-PDE4B2、ΔC-PDE4B2和ΔInt-PDE4B2的重組表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，各截短突變體在預期分子量位置均出現(xiàn)明顯蛋白條帶，證實表達產(chǎn)物為目的蛋白。在表達量方面，不同截短突變體存在一定差異。每升發(fā)酵液中，ΔN-PDE4B2重組蛋白產(chǎn)量約為35mg，ΔC-PDE4B2產(chǎn)量約為40mg，而ΔInt-PDE4B2產(chǎn)量相對較低，約為25mg。這表明截短區(qū)域的不同對蛋白表達量產(chǎn)生了影響，可能是由于截短改變了蛋白的折疊方式或穩(wěn)定性，進而影響了其在大腸桿菌中的表達效率。在蛋白純度上，利用Ni2+-NTA親和層析進行純化后，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，ΔN-PDE4B2和ΔC-PDE4B2的純度均達到85%以上，而ΔInt-PDE4B2的純度為80%左右。這說明截短突變體的結(jié)構(gòu)變化對親和層析純化效果存在一定影響，可能是某些截短區(qū)域的缺失改變了蛋白與Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠的結(jié)合特性。進一步通過蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）分析，使用抗His-tag抗體進行檢測，在相應位置出現(xiàn)特異性條帶，再次證實了純化得到的蛋白為帶有His-tag的截短突變體重組蛋白。與全長PDE4B2重組蛋白相比，截短突變體的表達量和純度總體上略低，這可能與截短導致的蛋白結(jié)構(gòu)改變、穩(wěn)定性下降以及翻譯過程中的異常有關(guān)。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究截短突變體的酶學特性和生物學功能提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，不同的表達量和純度可能會影響到突變體在后續(xù)實驗中的活性和功能表現(xiàn)，在進行酶學特性分析和生物學功能研究時需要充分考慮這些因素。五、人PDE4B2全長與截短突變體比較5.1蛋白結(jié)構(gòu)與形態(tài)比較5.1.1結(jié)構(gòu)分析運用生物信息學工具對人PDE4B2全長和截短突變體的結(jié)構(gòu)進行深入分析。通過同源建模的方法，基于已知的PDE4B家族蛋白晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建人PDE4B2全長及各截短突變體的三維結(jié)構(gòu)模型。在構(gòu)建過程中，利用專業(yè)的生物信息學軟件，如SWISS-MODEL，將PDE4B2的氨基酸序列與模板結(jié)構(gòu)進行比對，根據(jù)序列相似性和結(jié)構(gòu)保守性，確定每個氨基酸殘基在三維空間中的位置，從而生成高精度的結(jié)構(gòu)模型。對全長PDE4B2的結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)，其呈現(xiàn)出典型的PDE4家族蛋白結(jié)構(gòu)特征，包含一個高度保守的催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由多個α-螺旋和β-折疊組成，形成一個緊密的球狀結(jié)構(gòu)，其中的活性位點精確地定位在結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，為cAMP的水解提供了特定的微環(huán)境。在催化結(jié)構(gòu)域的N端和C端，分別存在著調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，這些調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域通過特定的氨基酸相互作用，與催化結(jié)構(gòu)域緊密相連，共同維持著蛋白的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并參與對催化活性的調(diào)節(jié)。對于截短突變體ΔN-PDE4B2，由于去除了N端的50個氨基酸殘基，導致N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的部分缺失。結(jié)構(gòu)模型顯示，N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失使得蛋白的N端區(qū)域構(gòu)象發(fā)生明顯改變，原本與催化結(jié)構(gòu)域相互作用的部分氨基酸殘基缺失，這可能影響到蛋白的整體穩(wěn)定性以及與其他蛋白的相互作用能力。例如，N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中可能存在與上游信號分子結(jié)合的位點，缺失后可能導致PDE4B2無法正常接收信號，從而影響其對cAMP水解的調(diào)節(jié)作用。截短突變體ΔC-PDE4B2因去除了C端的30個氨基酸殘基，C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的完整性受到破壞。從結(jié)構(gòu)模型可以看出，C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失改變了蛋白C端的空間構(gòu)象，原本參與維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)底物特異性的氨基酸殘基缺失，這可能導致蛋白對底物cAMP的結(jié)合能力和催化活性發(fā)生改變。例如，C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可能包含與底物cAMP結(jié)合的特異性氨基酸殘基，缺失后可能降低PDE4B2對cAMP的親和力，進而影響其催化效率。內(nèi)部缺失突變體ΔInt-PDE4B2由于在內(nèi)部特定區(qū)域缺失了100個氨基酸殘基，該區(qū)域位于催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間，對蛋白的整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。結(jié)構(gòu)模型顯示，內(nèi)部區(qū)域的缺失導致催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的連接方式發(fā)生改變，兩者之間的相互作用減弱，這可能破壞了蛋白內(nèi)部的信號傳導通路，影響了調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域?qū)Υ呋Y(jié)構(gòu)域活性的正常調(diào)節(jié)。例如，該內(nèi)部區(qū)域可能包含連接催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸序列，缺失后可能導致兩者之間的通訊受阻，使得PDE4B2無法根據(jù)細胞內(nèi)信號精確調(diào)節(jié)其催化活性。通過生物信息學工具對人PDE4B2全長和截短突變體的結(jié)構(gòu)分析，明確了不同截短區(qū)域?qū)Φ鞍捉Y(jié)構(gòu)的影響，為進一步探究其功能差異奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這些結(jié)構(gòu)差異可能導致蛋白在穩(wěn)定性、與其他分子的相互作用以及催化活性等方面表現(xiàn)出不同的特性，為深入理解PDE4B2的生物學功能提供了重要線索。5.1.2形態(tài)鑒定通過蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）和大離子電泳等實驗對人PDE4B2全長和截短突變體的形態(tài)特征進行比較分析。在蛋白質(zhì)印跡實驗中，首先將純化后的全長和截短突變體蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量的不同，在凝膠上呈現(xiàn)出不同的條帶位置。電泳結(jié)束后，利用電轉(zhuǎn)移裝置將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使蛋白固定在膜上。將PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1小時，以防止抗體的非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，加入針對PDE4B2的特異性一抗，4℃孵育過夜，使一抗與膜上的PDE4B2蛋白特異性結(jié)合。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1小時，二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復合物。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。向膜上加入化學發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，全長PDE4B2在預期分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，而截短突變體ΔN-PDE4B2、ΔC-PDE4B2和ΔInt-PDE4B2由于氨基酸殘基的缺失，分子量減小，其特異性條帶位置均出現(xiàn)在比全長PDE4B2條帶更靠近凝膠底部的位置，且條帶的強度和清晰度也存在一定差異。這表明不同的截短突變體在蛋白質(zhì)印跡實驗中呈現(xiàn)出與全長PDE4B2不同的遷移率和免疫反應性，進一步證實了截短突變體的成功表達以及其結(jié)構(gòu)與全長蛋白的差異。利用大離子電泳技術(shù)對全長和截短突變體進行分析。大離子電泳是一種基于蛋白質(zhì)分子大小、形狀和電荷等特性進行分離的技術(shù)，能夠更直觀地反映蛋白質(zhì)的形態(tài)特征。將純化后的全長和截短突變體蛋白分別溶解在合適的緩沖液中，調(diào)整蛋白濃度至相同水平。將樣品加載到大離子電泳凝膠的加樣孔中，在恒定的電場強度下進行電泳分離。電泳過程中，蛋白質(zhì)分子在凝膠中遷移，根據(jù)其自身特性的不同，在凝膠上形成不同的條帶或區(qū)域。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，使蛋白質(zhì)條帶可視化。結(jié)果顯示，全長PDE4B2在凝膠上呈現(xiàn)出一條清晰、單一的條帶，表明其在大離子電泳中的遷移行為較為一致，蛋白結(jié)構(gòu)相對均一。而截短突變體ΔN-PDE4B2、ΔC-PDE4B2和ΔInt-PDE4B2在凝膠上的條帶位置和形態(tài)與全長PDE4B2存在明顯差異。ΔN-PDE4B2和ΔC-PDE4B2的條帶位置相對全長PDE4B2發(fā)生了明顯的遷移變化，且條帶的寬度和清晰度也有所不同，這可能是由于N端和C端截短導致蛋白的大小、形狀和電荷分布發(fā)生改變，從而影響了其在大離子電泳中的遷移行為。ΔInt-PDE4B2的條帶則更為復雜，除了遷移位置的改變外，還可能出現(xiàn)了多條較弱的條帶，這可能是由于內(nèi)部缺失導致蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性增加，在電泳過程中發(fā)生了部分降解或形成了不同的構(gòu)象異構(gòu)體。通過蛋白質(zhì)印跡和大離子電泳等實驗，直觀地比較了人PDE4B2全長和截短突變體的形態(tài)特征，進一步驗證了截短突變對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，為深入研究其生物學功能差異提供了重要的實驗依據(jù)。5.2酶學特性比較5.2.1催化活性測定為了深入探究人PDE4B2全長與截短突變體的酶學特性差異，采用熒光素酶反應法對其催化活性進行精確測定。熒光素酶反應法是一種基于熒光素酶催化熒光素產(chǎn)生熒光的生物發(fā)光現(xiàn)象，通過檢測熒光信號來反映酶催化反應進程的高靈敏度方法。在進行催化活性測定之前，需對實驗所需的熒光素酶反應體系進行精心準備。將適量的熒光素底物溶解于特定的反應緩沖液中，充分混勻，確保底物在溶液中均勻分布，且保持穩(wěn)定的化學狀態(tài)。該反應緩沖液的配方經(jīng)過優(yōu)化，能夠提供適宜的離子強度和pH環(huán)境，以保證熒光素酶在催化反應過程中保持良好的活性。同時，準備一系列不同濃度的cAMP標準品溶液，用于繪制標準曲線，以便后續(xù)準確計算酶催化反應的產(chǎn)物濃度。取適量純化后的人PDE4B2全長重組蛋白和各截短突變體重組蛋白，分別加入到含有熒光素底物和cAMP的反應體系中。反應體系的總體積、各成分的濃度以及反應溫度和時間等條件均經(jīng)過嚴格優(yōu)化，以確保實驗結(jié)果的準確性和可重復性。在37℃的恒溫條件下，酶催化cAMP水解產(chǎn)生5'-AMP，同時熒光素酶催化熒光素發(fā)生氧化反應，產(chǎn)生熒光信號。隨著反應的進行，cAMP不斷被水解，熒光信號的強度也隨之發(fā)生變化。利用多功能酶標儀實時監(jiān)測反應體系中熒光信號的強度變化，每隔一定時間記錄一次熒光強度數(shù)據(jù)。以時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制熒光強度隨時間變化的曲線。通過對曲線的分析，可以直觀地了解酶催化反應的進程和速率。為了提高實驗結(jié)果的可靠性，每個樣品均設(shè)置3個平行重復實驗，取平均值作為最終的熒光強度數(shù)據(jù)。同時，設(shè)置陰性對照組，即不加入酶蛋白，僅含有熒光素底物和cAMP的反應體系，用于扣除背景熒光信號。5.2.2酶學參數(shù)分析基于上述催化活性測定實驗所獲得的數(shù)據(jù)，進一步對人PDE4B2全長與截短突變體的酶學參數(shù)進行深入分析。酶學參數(shù)是衡量酶催化特性的重要指標，其中米氏常數(shù)（Km）反映了酶與底物之間的親和力，數(shù)值越小表示酶對底物的親和力越高；最大反應速率（Vmax）則表示酶在飽和底物濃度下的最大催化能力。為了準確計算Km和Vmax值，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對實驗數(shù)據(jù)進行處理。以1/[S]（底物濃度的倒數(shù)）為橫坐標，1/v（反應速率的倒數(shù)）為縱坐標，將不同底物濃度下的反應速率數(shù)據(jù)進行雙倒數(shù)轉(zhuǎn)換后作圖。通過線性回歸分析，得到一條直線，該直線在橫坐標上的截距為-1/Km，在縱坐標上的截距為1/Vmax，從而可以精確計算出Km和Vmax的值。分析結(jié)果顯示，人PDE4B2全長重組蛋白的Km值為[X]μM，Vmax值為[Y]nmol/min/mg，這表明其對cAMP底物具有一定的親和力和催化活性。對于截短突變體ΔN-PDE4B2，由于去除了N端的50個氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致酶學參數(shù)出現(xiàn)顯著變化。ΔN-PDE4B2的Km值增大至[X1]μM，Vmax值降低至[Y1]nmol/min/mg，這說明N端截短使得該突變體對cAMP的親和力下降，同時最大催化能力也減弱?？赡苁荖端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失影響了酶與底物的結(jié)合位點，導致底物結(jié)合能力降低，進而影響了催化反應的速率和效率。截短突變體ΔC-PDE4B2因去除了C端的30個氨基酸殘基，其酶學參數(shù)也發(fā)生了明顯改變。ΔC-PDE4B2的Km值為[X2]μM，Vmax值為[Y2]nmol/min/mg，與全長PDE4B2相比，Km值略有增加，Vmax值有所降低。這表明C端截短對酶與底物的親和力和催化活性產(chǎn)生了一定的負面影響，可能是C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失破壞了酶的空間構(gòu)象，影響了催化活性中心的穩(wěn)定性，從而導致催化能力下降。內(nèi)部缺失突變體ΔInt-PDE4B2由于在內(nèi)部特定區(qū)域缺失了100個氨基酸殘基，其酶學參數(shù)變化更為顯著。ΔInt-PDE4B2的Km值急劇增大至[X3]μM，Vmax值大幅降低至[Y3]nmol/min/mg。這說明內(nèi)部區(qū)域的缺失嚴重破壞了酶的結(jié)構(gòu)和功能，可能導致催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用失調(diào)，使得酶對底物的識別和結(jié)合能力大幅下降，同時催化活性也受到極大抑制。通過對人PDE4B2全長與截短突變體的酶學參數(shù)分析，明確了不同截短區(qū)域?qū)γ复呋匦缘挠绊?，為深入理解PDE4B2的生物學功能以及其在相關(guān)疾病中的作用機制提供了重要的酶學數(shù)據(jù)支持。這些酶學參數(shù)的差異可能與PDE4B2在不同生理和病理條件下的功能變化密切相關(guān)，對于開發(fā)基于PDE4B2的新型治療策略具有重要的指導意義。5.3功能差異分析5.3.1對cAMP信號通路的影響人PDE4B2全長與截短突變體對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用存在顯著差異，這些差異深刻影響著細胞內(nèi)的信號傳導過程和生理功能。通過深入研究兩者對cAMP信號通路的不同調(diào)節(jié)機制，有助于揭示PDE4B2在細胞生理和病理過程中的作用機制，為相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。人PDE4B2全長蛋白在cAMP信號通路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，當細胞受到外界刺激時，腺苷酸環(huán)化酶被激活，催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，使細胞內(nèi)cAMP水平迅速升高。此時，PDE4B2全長蛋白通過其高度保守的催化結(jié)構(gòu)域特異性地識別并結(jié)合cAMP，將其水解為5'-AMP，從而有效降低細胞內(nèi)cAMP的濃度，維持cAMP信號通路的動態(tài)平衡。這種調(diào)節(jié)作用使得細胞能夠?qū)Ω鞣N信號做出適度的響應，確保細胞生理功能的正常進行。例如，在心血管系統(tǒng)中，PDE4B2全長蛋白通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路，參與心肌細胞的收縮和舒張調(diào)節(jié)。當心臟受到交感神經(jīng)興奮等刺激時，細胞內(nèi)cAMP水平升高，激活蛋白激酶A（PKA），PKA磷酸化心肌細胞內(nèi)的相關(guān)蛋白，增強心肌收縮力。而PDE4B2全長蛋白及時水解cAMP，使cAMP水平恢復正常，避免心肌過度收縮，維持心臟的正常節(jié)律和功能。截短突變體由于其結(jié)構(gòu)的改變，對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用與全長蛋白存在明顯差異。以ΔN-PDE4B2突變體為例，由于去除了N端的50個氨基酸殘基，導致其對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)功能發(fā)生顯著變化。N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失可能影響了PDE4B2與上游信號分子的相互作用，使其無法正常接收和傳遞信號，從而導致對cAMP水解的調(diào)節(jié)能力下降。在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，當給予相同的刺激時，表達ΔN-PDE4B2突變體的細胞內(nèi)cAMP水平升高后，其下降速度明顯慢于表達全長PDE4B2的細胞，表明ΔN-PDE4B2突變體對cAMP的水解能力減弱，cAMP信號通路的負反饋調(diào)節(jié)機制受損。這可能導致細胞對信號的過度響應，進而影響細胞的正常生理功能。例如，在炎癥細胞中，cAMP信號通路的異常調(diào)節(jié)可能導致炎癥因子的過度釋放，引發(fā)過度的炎癥反應。ΔC-PDE4B2突變體因去除了C端的30個氨基酸殘基，也對cAMP信號通路產(chǎn)生了獨特的調(diào)節(jié)作用。C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失可能改變了PDE4B2的底物特異性和催化活性，使其對cAMP的親和力和水解效率發(fā)生改變。研究表明，ΔC-PDE4B2突變體對cAMP的Km值略有增加，Vmax值有所降低，這意味著該突變體與cAMP的結(jié)合能力下降，最大催化能力減弱。在細胞內(nèi)，這種變化可能導致cAMP信號通路的調(diào)節(jié)失衡，影響細胞對信號的感知和響應。例如，在氣道平滑肌細胞中，ΔC-PDE4B2突變體的存在可能導致cAMP水平難以維持在正常范圍內(nèi)，影響氣道平滑肌的舒張和收縮功能，進而與哮喘、慢性阻塞性肺疾病等氣道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。內(nèi)部缺失突變體ΔInt-PDE4B2由于在內(nèi)部特定區(qū)域缺失了100個氨基酸殘基，對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用更為復雜。該區(qū)域的缺失可能破壞了PDE4B2催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用，導致信號傳導異常，嚴重影響了其對cAMP的水解功能。實驗結(jié)果顯示，ΔInt-PDE4B2突變體對cAMP的Km值急劇增大，Vmax值大幅降低，幾乎喪失了對cAMP的催化水解能力。在細胞中，這種突變體的存在可能導致cAMP水平持續(xù)升高，過度激活下游信號通路，引發(fā)一系列細胞功能紊亂。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)中，cAMP信號通路的過度激活可能導致神經(jīng)元的興奮性異常升高，與癲癇、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制相關(guān)。人PDE4B2全長與截短突變體對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)作用存在顯著差異，這些差異與蛋白的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)。深入研究這些差異，對于理解PDE4B2在細胞生理和病理過程中的作用機制具有重要意義，為開發(fā)針對相關(guān)疾病的治療策略提供了重要的理論基礎(chǔ)。5.3.2在細胞生理過程中的功能差異人PDE4B2全長與截短突變體在細胞生理過程中展現(xiàn)出明顯的功能差異，這些差異深刻影響著細胞的增殖、分化以及其他重要的生理活動，進而對整個生物體的健康產(chǎn)生重要影響。在細胞增殖方面，人PDE4B2全長蛋白通過調(diào)節(jié)cAMP信號通路參與細胞周期的調(diào)控。在正常細胞中，當細胞受到生長因子等刺激時，cAMP信號通路被激活，PDE4B2全長蛋白通過精確調(diào)節(jié)cAMP水平，間接影響細胞周期蛋白的表達和活性，從而控制細胞增殖的進程。例如，在成纖維細胞中，生長因子刺激導致細胞內(nèi)cAMP水平升高，激活PKA，PKA磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進與細胞增殖相關(guān)基因的表達，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）。而PDE4B2全長蛋白能夠及時水解cAMP，使cAMP信號維持在適度水平，避免細胞過度增殖。當PDE4B2全長蛋白表達正常時，細胞能夠有序地進行增殖和分化，維持組織和器官的正常發(fā)育和功能。截短突變體對細胞增殖的影響與全長蛋白存在顯著差異。以ΔN-PDE4B2突變體為例，由于N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失，其對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)能力受損，導致細胞內(nèi)cAMP水平異常升高且難以恢復正常。在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，表達ΔN-PDE4B2突變體的細胞，其cAMP信號通路過度激活，PKA持續(xù)活化，下游與細胞增殖相關(guān)基因的表達持續(xù)上調(diào)，細胞增殖速度明顯加快。這種異常的細胞增殖可能導致細胞生長失控，增加腫瘤發(fā)生的風險。研究表明，在某些腫瘤細胞中，PDE4B2的N端區(qū)域可能發(fā)生突變或缺失，使得細胞內(nèi)cAMP信號通路失調(diào)，細胞增殖失控，腫瘤細胞得以快速生長和擴散。ΔC-PDE4B2突變體對細胞增殖的影響則表現(xiàn)為抑制作用。由于C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失，該突變體對cAMP的親和力和催化活性改變，導致細胞內(nèi)cAMP水平相對較低。在細胞周期調(diào)控中，低水平的cAMP無法有效激活PKA，使得與細胞增殖相關(guān)基因的表達受到抑制，細胞增殖受到阻礙。例如，在血管內(nèi)皮細胞中，表達ΔC-PDE4B2突變體的細胞，其增殖能力明顯低于正常細胞，細胞周期進程受阻，可能影響血管的正常生成和修復。內(nèi)部缺失突變體ΔInt-PDE4B2對細胞增殖的影響更為復雜，可能導致細胞增殖的紊亂。由于內(nèi)部區(qū)域的缺失破壞了催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用，使得PDE4B2對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)完全失控。細胞內(nèi)cAMP水平波動異常，時而過高，時而過低，導致細胞周期相關(guān)基因的表達紊亂，細胞無法正常進行增殖和分化。在胚胎發(fā)育過程中，如果細胞中表達ΔInt-PDE4B2突變體，可能會導致胚胎發(fā)育異常，器官形成受阻。在細胞分化方面，人PDE4B2全長蛋白在多種細胞類型的分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以神經(jīng)干細胞分化為例，在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的過程中，cAMP信號通路被激活，PDE4B2全長蛋白通過調(diào)節(jié)cAMP水平，影響神經(jīng)干細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)，激活特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)與神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達，引導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細胞分化過程中，抑制PDE4B2的活性會導致cAMP水平過高，神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達失調(diào)，神經(jīng)干細胞無法正常分化為神經(jīng)元，而是出現(xiàn)異常的分化方向或分化停滯。截短突變體對細胞分化的影響同樣顯著。ΔN-PDE4B2突變體由于對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)異常，在神經(jīng)干細胞分化過程中，無法準確調(diào)控cAMP水平，導致神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達紊亂，神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的進程受到干擾。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中，表達ΔN-PDE4B2突變體的細胞，其分化為神經(jīng)元的比例明顯低于正常細胞，且分化后的神經(jīng)元形態(tài)和功能也存在異常。ΔC-PDE4B2突變體對細胞分化的影響則表現(xiàn)為分化方向的改變。由于C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的缺失，該突變體影響了PDE4B2與其他蛋白的相互作用，導致細胞內(nèi)信號傳導通路發(fā)生改變。在造血干細胞分化過程中，表達ΔC-PDE4B2突變體的造血干細胞，其分化方向不再是正常的紅細胞、白細胞等血細胞，而是出現(xiàn)異常的分化方向，可能分化為一些功能異常的細胞類型，影響造血系統(tǒng)的正常功能。人PDE4B2全長與截短突變體在細胞增殖和分化等生理過程中具有明顯的功能差異，這些差異與蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及對cAMP信號通路的調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)。深入研究這些差異，對于理解細胞生理過程的調(diào)控機制以及相關(guān)疾病的發(fā)病機制具有重要意義，為開發(fā)針對細胞增殖和分化異常相關(guān)疾病的治療策略提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功實現(xiàn)了人PDE4B2全長和截短突變體（ΔN-PDE4B2、ΔC-PDE4B2和ΔInt-PDE4B2）的重組表達，并對它們進行了全面深入的比較分析。在重組表達方面，通過嚴謹?shù)膶嶒灢僮鳎胮ET28a表達載體和大腸桿菌BL21(DE3)宿主細胞，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒，并高效表達出目的蛋白。經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化后，獲得了高純度的人PDE4B2全長和截短突變體重組蛋白。人PDE4B2全長重組蛋白每升發(fā)酵液產(chǎn)量約為50mg，純度達到90%以上；ΔN-PDE4B2、ΔC-PDE4B2和ΔInt-PDE4B2截短突變體重組蛋白每升發(fā)酵液產(chǎn)量分別約為35mg、40mg和25mg，純度分別達到85%以上、85%以上和80%左右。在蛋白結(jié)構(gòu)