1適用范圍本規(guī)程適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“實(shí)驗(yàn)室”）開(kāi)展人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測(cè)及基因分型（若含分型），包括宮頸/陰道拭子、外陰/肛周拭子、痰液、尿液等臨床樣本的檢測(cè)。本規(guī)程依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號(hào)）、《人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)及基因分型技術(shù)規(guī)范》（WS/T____）及相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)制定。2檢測(cè)原理本規(guī)程采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，基于HPV基因組的保守區(qū)域（如L1區(qū)）設(shè)計(jì)特異性引物與熒光探針（TaqMan探針），通過(guò)擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HPV核酸的存在。若為分型檢測(cè)，需針對(duì)不同HPV基因型（如高危型16、18，低危型6、11等）設(shè)計(jì)特異性探針，實(shí)現(xiàn)多基因型同時(shí)檢測(cè)。3試劑與儀器3.1試劑核酸提取試劑：磁珠法/柱提法核酸提取試劑盒（含裂解液、結(jié)合液、洗滌液、洗脫液、磁珠等）；PCR反應(yīng)試劑：HPV核酸檢測(cè)試劑盒（含引物探針混合液、酶混合液（Taq酶、dNTPs、Mg2?等）、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照）；樣本保存液：專(zhuān)用病毒保存液（含胍鹽、RNA酶抑制劑等，用于保持HPV核酸穩(wěn)定性）。試劑要求：所有試劑需在有效期內(nèi)，按照說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存（如熒光探針試劑需-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融；核酸提取試劑需2-8℃保存）。3.2儀器核酸提取儀（如磁珠法自動(dòng)提取儀）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（需具備多通道熒光檢測(cè)能力，適配試劑盒探針的熒光基團(tuán)，如FAM、VIC、ROX等）；生物安全柜（Ⅱ級(jí)，用于樣本處理及試劑配制）；離心機(jī)（臺(tái)式高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速≥____rpm）；移液器（1-10μL、____μL、____μL，帶濾芯槍頭）；恒溫孵育箱（用于核酸提取中的裂解步驟）。4樣本采集與處理4.1樣本類(lèi)型首選：宮頸拭子（用于宮頸癌篩查）、陰道拭子（用于陰道HPV感染檢測(cè)）；其他：外陰/肛周拭子（用于生殖器疣檢測(cè)）、痰液（用于呼吸道HPV感染檢測(cè)）、尿液（用于無(wú)創(chuàng)篩查，需驗(yàn)證試劑盒適用性）。4.2樣本采集宮頸拭子采集方法（以宮頸癌篩查為例）：1.受檢者取截石位，暴露宮頸；2.使用專(zhuān)用HPV采樣刷（刷頭為尼龍纖維），插入宮頸管內(nèi)約1-2cm（到達(dá)宮頸鱗柱交界區(qū)）；3.順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3-5圈（約10秒），確保刷頭充分接觸宮頸黏膜；4.將采樣刷放入含有3-5mL保存液的試管中，折斷刷頭（留取刷頭于管內(nèi)），蓋緊蓋子，做好標(biāo)記（姓名、性別、年齡、樣本類(lèi)型、采集時(shí)間）。注意：采集前24小時(shí)內(nèi)避免性生活、陰道沖洗或用藥；經(jīng)期需暫緩采集。4.3樣本運(yùn)輸與保存新鮮樣本：采集后立即置于2-8℃冷藏，24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；長(zhǎng)期保存：若無(wú)法及時(shí)檢測(cè)，需將樣本置于-20℃（可保存1個(gè)月）或-70℃（可保存6個(gè)月），避免反復(fù)凍融；運(yùn)輸：采用冷鏈運(yùn)輸（2-8℃），避免劇烈震蕩。4.4樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)樣本標(biāo)識(shí)不清或信息不全；樣本量不足（保存液體積＜1mL）；保存液泄漏或污染；超過(guò)保存期限（如2-8℃保存超過(guò)24小時(shí)）；樣本類(lèi)型與檢測(cè)申請(qǐng)不符。5核酸提取5.1提取前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：嚴(yán)格按照“試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)”劃分，各區(qū)獨(dú)立，避免交叉污染；儀器與試劑：提前啟動(dòng)核酸提取儀，預(yù)溫孵育箱（如60℃）；取出核酸提取試劑，平衡至室溫；防護(hù)措施：實(shí)驗(yàn)人員戴手套、口罩，穿實(shí)驗(yàn)服；使用帶濾芯槍頭，避免氣溶膠污染。5.2提取步驟（以磁珠法為例）1.樣本裂解：取1mL樣本保存液（含刷頭）加入裂解管，加入200μL裂解液，渦旋混合30秒，60℃孵育10分鐘（加速病毒包膜破裂，釋放核酸）；2.磁珠結(jié)合：加入100μL磁珠混懸液，渦旋混合1分鐘，室溫靜置5分鐘（磁珠與核酸結(jié)合）；3.洗滌：將裂解管置于磁力架上，吸附磁珠（約1分鐘），棄上清；加入500μL洗滌液1，渦旋混合30秒，吸附磁珠，棄上清；重復(fù)上述步驟1次（用洗滌液2）；4.洗脫：加入50μL洗脫液（預(yù)熱至60℃），渦旋混合30秒，60℃孵育5分鐘，吸附磁珠，收集上清液（即提取的HPV核酸），置于冰上備用。5.3提取質(zhì)量控制每批提取需同時(shí)處理陽(yáng)性對(duì)照（試劑盒自帶，含已知濃度HPV核酸）、陰性對(duì)照（不含HPV核酸的模擬樣本）、空白對(duì)照（無(wú)樣本，僅加保存液）；提取后的核酸需在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若無(wú)法及時(shí)擴(kuò)增，需-20℃保存（≤24小時(shí)）。6PCR擴(kuò)增反應(yīng)6.1反應(yīng)體系配制在試劑準(zhǔn)備區(qū)（生物安全柜內(nèi)）配制PCR反應(yīng)體系，每樣本體系體積為20μL（可根據(jù)試劑盒調(diào)整）：成分體積（μL）引物探針混合液10酶混合液2提取的核酸模板5無(wú)核酸酶水3注意：引物探針混合液與酶混合液需充分混勻，避免沉淀；體系配制需嚴(yán)格按照“先加試劑，后加模板”的順序，避免交叉污染；每批實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（試劑盒自帶，含HPV核酸）、陰性對(duì)照（提取的陰性對(duì)照核酸）、空白對(duì)照（無(wú)核酸酶水）。6.2擴(kuò)增程序設(shè)置將配制好的PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)置以下擴(kuò)增程序（以HPV16/18分型檢測(cè)為例）：步驟溫度（℃）時(shí)間循環(huán)數(shù)熒光收集預(yù)變性955分鐘1否變性9515秒40否退火延伸6030秒40是（FAM/VIC通道）注意：擴(kuò)增儀需提前預(yù)熱，確保溫度準(zhǔn)確性；反應(yīng)管需蓋緊，避免蒸發(fā)。7結(jié)果判讀7.1對(duì)照品結(jié)果要求陽(yáng)性對(duì)照：需出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，Ct值≤35（符合試劑盒說(shuō)明書(shū)要求）；陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增曲線（Ct值＞40）；空白對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增曲線（Ct值＞40）。若對(duì)照品結(jié)果不符合要求，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。7.2樣本結(jié)果判讀陽(yáng)性：Ct值≤38，且擴(kuò)增曲線呈典型S型；灰區(qū)：38＜Ct值≤40，需重復(fù)檢測(cè)（若重復(fù)后Ct值≤38，判為陽(yáng)性；否則判為陰性）；陰性：Ct值＞40，無(wú)擴(kuò)增曲線。分型檢測(cè)結(jié)果：若為多基因型檢測(cè)，每個(gè)基因型對(duì)應(yīng)特定熒光通道（如HPV16對(duì)應(yīng)FAM通道，HPV18對(duì)應(yīng)VIC通道），需根據(jù)各通道的Ct值分別判斷基因型。8質(zhì)量控制8.1室內(nèi)質(zhì)控每批實(shí)驗(yàn)需設(shè)置定值質(zhì)控品（如第三方HPV核酸質(zhì)控品，含高、中、低濃度），監(jiān)測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性與精密度；質(zhì)控品結(jié)果需在試劑盒規(guī)定的范圍內(nèi)（如高濃度質(zhì)控品Ct值18-22，中濃度25-29，低濃度32-36）；若質(zhì)控品結(jié)果異常，需查找原因（如試劑失效、儀器故障、操作誤差），糾正后重新檢測(cè)。8.2室間質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室需每年參加國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心或省級(jí)臨檢中心組織的HPV核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃；室間質(zhì)評(píng)成績(jī)需合格（如得分≥80分），否則需暫停檢測(cè)，整改后重新申請(qǐng)。8.3污染防控分區(qū)管理：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)嚴(yán)格分開(kāi)，人員與物品單向流動(dòng)（從低污染區(qū)到高污染區(qū)）；環(huán)境監(jiān)測(cè)：每月對(duì)各區(qū)進(jìn)行環(huán)境核酸檢測(cè)（如擦拭臺(tái)面、移液器、門(mén)把手等），若檢測(cè)到HPV核酸，需徹底消毒（用1000mg/L含氯消毒液擦拭，紫外線照射30分鐘）；操作規(guī)范：使用帶濾芯槍頭，避免氣溶膠產(chǎn)生；PCR產(chǎn)物需置于專(zhuān)用容器，高壓滅菌后丟棄；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用75%乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，紫外線照射30分鐘。9結(jié)果報(bào)告與解釋9.1報(bào)告內(nèi)容樣本信息：姓名、性別、年齡、樣本類(lèi)型、采集時(shí)間、檢測(cè)編號(hào)；檢測(cè)方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（PCR-熒光探針?lè)ǎ?；檢測(cè)結(jié)果：定性結(jié)果：陽(yáng)性/陰性/灰區(qū)；分型結(jié)果（若有）：具體基因型（如高危型16型陽(yáng)性、低危型6型陽(yáng)性）；參考范圍：陰性；備注：灰區(qū)結(jié)果建議重復(fù)檢測(cè)；陽(yáng)性結(jié)果建議結(jié)合TCT（薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)）、陰道鏡檢查等臨床指標(biāo)。9.2結(jié)果解釋陰性結(jié)果：提示樣本中未檢測(cè)到HPV核酸，但不能完全排除感染（如樣本采集不當(dāng)、病毒載量低）；陽(yáng)性結(jié)果：低危型HPV（如6、11型）：主要與生殖器疣（如尖銳濕疣）相關(guān)，需結(jié)合臨床癥狀（如外陰贅生物）判斷；高危型HPV（如16、18型）：與宮頸癌及癌前病變密切相關(guān)（16型導(dǎo)致約50%的宮頸癌，18型導(dǎo)致約15%），需進(jìn)一步行TCT檢查（若TCT異常，需做陰道鏡活檢）；持續(xù)陽(yáng)性：高危型HPV持續(xù)感染（＞12個(gè)月）是宮頸癌的重要危險(xiǎn)因素，需加強(qiáng)隨訪（每6-12個(gè)月檢測(cè)一次）。10注意事項(xiàng)試劑使用前需檢查是否有沉淀、渾濁，若有則禁止使用；樣本采集時(shí)需避免接觸陰道壁或外陰皮膚，防止雜菌污染；PCR反應(yīng)體系配制需在冰上進(jìn)行，避免酶失活；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀需定期校準(zhǔn)（每6個(gè)月一次），確保溫度準(zhǔn)確性；實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)過(guò)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，考核合格后方可操作；檢測(cè)結(jié)果需由兩名檢驗(yàn)人員核對(duì)，確認(rèn)無(wú)誤后簽字發(fā)放。11廢棄物處理樣本保存液、提取后的廢液：放入醫(yī)療廢物袋，標(biāo)注“感染性廢物”，高壓滅菌