1目的

通過對微生物檢測流程的規(guī)范確保檢驗工作有序進行。

2范圍

適用于微生物檢測的全過程。

3職責(zé)

3.1檢驗人員嚴(yán)格按檢測流程做好各項工作。

3.2檢測主管做好監(jiān)督檢查工作。

4內(nèi)容

4.1準(zhǔn)備工作

4.1.1衛(wèi)生清潔

整理普通檢驗室內(nèi)的各類檢險物品，檢查工作臺面和地面衛(wèi)生。

4.1.2樣品收集登記

4.1.2.1與收樣員溝通，確定檢樣品種、數(shù)量（如倉庫到貨的茶原料、內(nèi)包

膜，車間生產(chǎn)的半成品、成品，研發(fā)樣品，采購樣品，穩(wěn)定性試驗的樣品、定期

跟蹤檢測的樣品）。

4.L2.2與質(zhì)保員溝通，確定檢樣品種、數(shù)量（如自來水、純水、一樓生產(chǎn)

過程跟蹤的各階段液體）。

4.1.2.3按檢測計劃自行確定的檢樣品種、數(shù)量（如工作間空氣、設(shè)備內(nèi)表

面、員工手部）。

4.1.2.4各項確定后，收集并登記樣品。

4.1.3檢測方法的確定

4.1.3.1樣品收集后進行分類，確定樣品的檢測方法，若無方法的要盡快上

報或查找相關(guān)方法。

4.1.3.2微生物各項目所采用的檢測方法（見附表1）

4.2試劑配制、物品包扎

4.2.1玻璃容器的包扎：滅菌前器皿應(yīng)包扎緊密完整后才進行滅菌，以防止滅

菌后器皿受到污染。

4.2.2平皿、吸管按量分成若干單元用牛皮紙、報紙包扎;

4.2.3試管及三角瓶應(yīng)塞硅膠塞，在瓶口再用報紙包扎；

4.2.4其它玻璃或金屬取樣工具也要用報紙包扎；

4.2.5生理鹽水按氯化鈉加水比例0.84%配制；平板計數(shù)瓊脂(PCA)、孟加拉

紅、月桂基硫酸鹽胰蛋白陳肉湯(LST)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)則以標(biāo)簽上

規(guī)定的比例進行配制。按需要量分裝成于不同規(guī)珞的容器中。

4.3高壓滅菌

4.3.1培養(yǎng)基及器皿的滅菌：

4.3.1.1高壓蒸汽滅菌：金屬器具、玻璃器皿、基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其它耐熱物品

均放入鍋內(nèi)滅菌。

4.3.L2滅菌參數(shù):121℃(0.1034MPa),15~20min；

4.3.2染菌培養(yǎng)物：121℃(0.1034MPa),30min；

0

4.3.3含糖類不耐熱培養(yǎng)基(按試劑要求)：115c(0.0727MPa),15"20mino

4.3.4每次滅菌時均須將滅菌指示帶置于滅菌鍋內(nèi)，觀察滅菌效果。

4.3.5滅菌鍋的使用：參照“儀器使用維護保養(yǎng)作業(yè)指導(dǎo)書”的相關(guān)內(nèi)容執(zhí)行。

4.4烘干

高壓蒸汽滅菌后的物品除培養(yǎng)基及稀釋液外的其地物品，如玻璃平皿吸管、金屬

器具或棉花等均應(yīng)先置于105(烘箱內(nèi)，根據(jù)包裝大小應(yīng)保持lh以上，至干燥

后使用。

45貯存

4.5.1滅菌后處理：滅菌后物品，注意放置場所，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放，以

免再度污染。

4.5.2滅菌合格的培養(yǎng)基及稀釋液先貯存于消毒柜，臭氧消毒并低溫烘干瓶口

包扎紙，存放一般不超過24h,當(dāng)天未使用完的置于4(冰箱存放，3天內(nèi)使用

完。培養(yǎng)基及稀釋液的配制數(shù)量應(yīng)以適量為宜。

4.5.3烘干后合格的滅菌物品應(yīng)存放于貯藏室或消毒柜內(nèi)，滅菌后保存最長不

得超過3天。

4.5.4包裝損壞或塞子脫落者，不可作為無菌品使用。

4.6無菌室的消毒

4.6.1超凈臺的使用

4.6.1.1使用前應(yīng)先用75%酒精棉擦拭臺面，再打開超凈配咯的紫外燈，照

射時間不少于30min；

4.6.1.2使用時，應(yīng)關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，同時打開無菌風(fēng)直至實驗結(jié)束;

4.6.1.3超凈臺滅菌效果應(yīng)以落菌實驗加以驗證；

4.6.2無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開懸吊式紫外燈消毒，應(yīng)選用30W,距離

在1.0m處，照射時間不少于30min；

4.6.3緩沖間的使用：微檢員工作時穿的衣帽、鞋等物品需放置在緩沖間。并于

實驗前后打開紫外燈，照射時間不少于30min。

4.7檢測過程

4.7.1操作過程要求無菌；

4.7.2進入緩沖間后用75%的酒精棉球消毒雙手，換上已消毒的專用工作服、

帽、口罩及鞋；

4.7.3接種樣品時，應(yīng)再用75%的酒精棉球消毒雙手；

4.7.4檢品須稱量的要保證重量準(zhǔn)確，且要盡快加入至稀釋液中；

4.7.5檢樣液瓶口應(yīng)盡快塞緊硅膠塞，將其樣液充分搖勻；

4.7.6從包裝中取出吸管時，尖端不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或

平皿時，吸管尖端不得觸及試管或平皿；

4.7.7接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，吸管從包裝中取出后及打開

試管塞都要通過火焰滅菌。接種環(huán)和接種針在接種細(xì)菌前后應(yīng)經(jīng)火焰灼燒全部金

屬絲，必要時要燒到環(huán)和針的連接處?；鹧鏈缇挠行Х秶曰鹧鏋橹行陌霃?/p>

9cm內(nèi)。

4.7.8傾倒培養(yǎng)基至平皿中搖勻放置；

4.7.8檢品檢測完畢時，要求做空白對照；

4.7.9不同檢品要根據(jù)各自特性綜合考慮，如選擇的檢測項目、稀釋度等（附

表1的相關(guān)內(nèi)容）：

4.7.10打開包裝未使月完的器皿，放置后再使用應(yīng)重新滅菌；

4.8記錄

按檢品的種類、檢測項目、稀釋度進行登記，注明編號。

4.9培養(yǎng)

4.9.1冷卻后的平板及已接種的稀釋培養(yǎng)液（如菌落總數(shù)、大腸菌群）置入37寸

恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；

4.9.2冷卻后的平板（如霉菌）則置入28T恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天；

4.9.2培養(yǎng)溫度時間按不同檢測項目進行確定，置入前均須檢查培養(yǎng)箱溫度是否

符合要求。

4.10結(jié)果報告

4.10.1按品種、檢測項目查記錄后，確認(rèn)達(dá)到規(guī)定培養(yǎng)時間的培養(yǎng)物，取出

進行計數(shù)；

4.10.2計數(shù)方法按附錄1中不同檢測項目規(guī)定的內(nèi)容執(zhí)行；

4.11清洗

4.11.1器皿的清洗：凡被污染的器皿，應(yīng)先經(jīng)過12UC,30min高壓蒸汽滅菌

后再進行清洗。

4.11.2日常使用后的容器、平皿等經(jīng)水沖洗或超聲波清洗干凈。

4.11.3清洗后要求烘干或晾干備用。

4.12衛(wèi)生清潔消毒

按《化驗室衛(wèi)生管理制度》、《微生物檢定室管理制度》的相關(guān)內(nèi)容執(zhí)行。

5衛(wèi)生檢測

5.1微生物涂抹實驗

5.1.1實驗試劑：0.84%滅菌生理鹽水;

5.1.2實驗儀器：試管、滅菌鏡子、滅菌棉球：體積為3X3X3cm3.酒精燈

5.1.3準(zhǔn)備工作：配制0.84%生理鹽水分裝在一定數(shù)量試管中，每管10ml,滅

菌后待用；

5.1.4樣品采集：

5.1.4.1設(shè)備及容器具取樣：

在酒精燈火焰上方，以無菌鑲子鑲?cè)o菌棉球沾潤滅菌生理鹽水，反

復(fù)擦拭需采集樣品物體表面約30cm2,然后將該棉球迅速裝入盛有10ml的滅菌

生理鹽水試管中，搖勻待用；

5.1.4.2內(nèi)包裝材料取樣：

在酒精燈火焰上方，以無菌鑲子鑲?cè)o菌棉球沾潤滅菌生理鹽水，以無菌

操作方式于無菌操作臺內(nèi)反復(fù)擦拭內(nèi)包裝材料表面，再將擦拭后的棉球裝入盛

有10ml的滅菌生理鹽水試管中，搖勻待用；

5.1.4.3操作人員手菌取樣：

在酒精燈火焰上方，以無菌鑲子鑲?cè)o菌棉球沾潤滅菌生理鹽水，用此棉球

反復(fù)擦拭待測人員左手（或右手），然后棉球迅速裝入盛有10ml的滅菌生理鹽

水試管中，搖勻待用；

5.1.5樣品檢測：

將帶有檢測棉球的生理鹽水在微生物無菌室按4中相關(guān)內(nèi)容操作。

5.1.6計算方法：

5.1.6.1設(shè)備、容器具與內(nèi)包裝材料（涂抹法）：

菌落總數(shù)（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均數(shù)X樣液稀釋倍數(shù)X10/30

5.1.6.2：人員手部（涂抹法）：

菌落總數(shù)（cfu/只手）二平皿上菌落的平均數(shù)X樣液稀釋倍數(shù)X10/2

5.2落菌實驗

5.2.1實驗試劑：營養(yǎng)瓊脂；

5.2.2實驗儀器：平皿、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱

5.2.3實驗步驟：

5.2.3.1在微生物檢驗室內(nèi)將滅菌好的涼至45T左右的營養(yǎng)瓊脂倒入滅菌

平皿內(nèi)，每皿約15-20以，待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，待用；

5.2.3.2生產(chǎn)車間環(huán)境落菌檢測的操作方法：

生產(chǎn)車間滅菌后或生產(chǎn)進行中進行測試。將