-6-附件2牛角膜渾濁度和滲透性試驗(yàn)方法BovineCornealOpacityandPermeability(BCOP)Assay1范圍本方法規(guī)定了牛角膜渾濁度和滲透性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料的潛在不可逆眼損傷和無(wú)刺激性評(píng)價(jià)，適用于單一成分物質(zhì)、多成分物質(zhì)和已知明確成分及含量的混合物。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)通過(guò)定量測(cè)定牛角膜渾濁度和滲透性的變化，評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料對(duì)眼角膜的不可逆眼損傷或無(wú)刺激性。3定義3.1眼睛刺激性eyeirritation眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。3.2不可逆眼損傷irreversibleeyedamage眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。3.3角膜的渾濁度cornealopacity角膜暴露于受試物后通透性改變的程度，角膜渾濁度增加表明角膜受損。3.4角膜的滲透性cornealpermeability測(cè)定通過(guò)角膜細(xì)胞層的熒光素鈉染料的量來(lái)代表角膜上皮損傷的指標(biāo)。4試驗(yàn)原理牛角膜渾濁度和滲透性試驗(yàn)是牛角膜接觸化妝品原料后，通過(guò)測(cè)定角膜渾濁度和滲透性的變化來(lái)評(píng)估化妝品用化學(xué)原料的眼刺激程度。5試劑和材料5.1培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液（含酚紅）5.2Hanks’溶液稱(chēng)取氯化鈣140mg、六水合氯化鎂100mg、七水合硫酸鎂100mg、氯化鉀400mg、磷酸二氫鉀60mg、碳酸氫鈉350mg、氯化鈉8g、磷酸氫二鈉48mg、葡萄糖1g，加水至1L。現(xiàn)用現(xiàn)配。5.3熒光素鈉溶液液體及表面活性劑受試物選用濃度為4mg/mL，固體受試物選用5mg/mL的熒光素鈉溶液進(jìn)行滲透性試驗(yàn)。5.4陽(yáng)性對(duì)照物液體受試物的陽(yáng)性對(duì)照物可使用100%N,N-二甲基甲酰胺（CAS68-12-2）；固體受試物的陽(yáng)性對(duì)照物可使用20%咪唑（CAS288-32-4）溶液。20%咪唑溶液的配制：取固體咪唑20g，加水至100mL溶解并搖勻。5.5陰性對(duì)照物陰性對(duì)照物可使用0.9%氯化鈉溶液，也可根據(jù)受試物的性質(zhì)選擇蒸餾水或其他可證明對(duì)測(cè)試系統(tǒng)無(wú)影響的溶劑，需同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照。5.6牛眼發(fā)育成熟的牛眼，直徑大于1.8cm，選用6~60月齡的牛。牛眼放在2~4℃的Hanks’溶液中，使用時(shí)間為24h內(nèi)。5.7渾濁度儀及角膜夾持器（見(jiàn)附錄）渾濁度儀是用來(lái)測(cè)量渾濁度的裝置。根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分為白光光源的渾濁度儀和單色光源的渾濁度儀。不同光源體外刺激分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式不同。角膜夾持器由前室和后室兩部分組成，前后室的內(nèi)部直徑均為1.7cm，深度2.2cm。6試驗(yàn)步驟6.1牛角膜的制備剔除渾濁，有劃痕、白斑、新生血管形成的牛眼。取無(wú)缺陷的牛眼，沿鞏膜邊緣2~3mm剪取并剝離角膜，角膜內(nèi)皮層向上，置于Hanks’溶液中。6.2角膜安裝角膜內(nèi)皮層向下對(duì)準(zhǔn)O型環(huán)放置在夾持器的后室上，再將前室蓋在角膜上，前后室組合，旋緊。6.3角膜平衡按先后室再前室的順序，將32oC預(yù)熱的MEM培養(yǎng)液加滿(mǎn)夾持器的前后室，確保沒(méi)有氣泡，將固定好的角膜夾持器垂直放置于32±1oC恒溫設(shè)備中平衡1h。6.4基準(zhǔn)渾濁度的測(cè)定角膜平衡后，按先前室再后室的順序，吸出前后室培養(yǎng)液，重新加入預(yù)熱的MEM培養(yǎng)液。渾濁度儀測(cè)定并記錄每個(gè)角膜的渾濁度值，作為基準(zhǔn)渾濁度。白光光度儀測(cè)定渾濁度小于7的角膜、單色光渾濁度儀測(cè)定值介于1200lux到1850lux之間的角膜為合格角膜。6.5角膜的分組取基準(zhǔn)渾濁度符合要求的牛角膜，每次試驗(yàn)設(shè)受試物組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組（必要時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組），每組至少3只角膜。6.6受試物暴露受試物暴露方式有兩種，一種針對(duì)液體和表面活性劑（固體或液體），另一種針對(duì)非表面活性劑（固體）。液體和表面活性劑（液體）以原液給樣；半固體、乳霜和蠟通常按液體測(cè)試；表面活性劑（固體）配制成濃度為10%的液體進(jìn)行測(cè)試。暴露時(shí)間為10min。非表面活性劑固體配制成濃度為20%溶液或混懸液給樣，暴露時(shí)間為4h。溶劑除0.9%氯化鈉溶液外，選擇蒸餾水或其他溶劑時(shí)，需設(shè)溶劑對(duì)照。根據(jù)受試物理化性質(zhì)，給樣方式有兩種，一種直接給樣法適用于非粘性到微粘性的液體化學(xué)品，另一種開(kāi)窗給樣法適用于半粘性和粘性液體化學(xué)品以及純固體。確保測(cè)試受試物充分覆蓋上皮表面，并在沖洗步驟中充分去除。直接給樣：取分組后帶有角膜的夾持器，吸去前室液體，加入750μL受試物于前室中，全部加樣后，確保樣品覆蓋整個(gè)角膜，角膜內(nèi)皮層朝下水平放置于32±1oC恒溫設(shè)備中。開(kāi)窗給樣：吸去前室液體，用開(kāi)窗器移除前室的玻璃片，夾持器前室在上，水平放置。用棉球輕輕吸干角膜上殘存培養(yǎng)液，取750μL受試物均勻平鋪在角膜上，置于32±1oC恒溫設(shè)備中。6.7暴露后渾濁度值測(cè)定暴露結(jié)束后，吸去前室的受試物，前室用MEM（含酚紅）培養(yǎng)液將角膜沖洗至少3次（直到酚紅不變色且肉眼無(wú)法識(shí)別到被測(cè)物質(zhì)為止），再用MEM培養(yǎng)液沖洗至無(wú)色后，將MEM培養(yǎng)液加入前室，渾濁度儀測(cè)定每個(gè)角膜的渾濁度。液體受試物測(cè)定后，角膜夾持器需垂直置于32±1oC的恒溫設(shè)備中再孵育2h后，更換前后室培養(yǎng)液，測(cè)定每個(gè)角膜的渾濁度值，作為終渾濁度。對(duì)于固體受試物，暴露結(jié)束沖洗后測(cè)定的渾濁度值直接作為終渾濁度，無(wú)需再孵育。每只角膜的渾濁度改變值為終渾濁度減去基準(zhǔn)渾濁度。計(jì)算每組中角膜渾濁度改變值的平均值作為平均渾濁度。渾濁度改變值=終渾濁度-基準(zhǔn)渾濁度6.8光密度值測(cè)定角膜的滲透性是由酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光素鈉溶液滲透過(guò)角膜后室培養(yǎng)液的光密度值產(chǎn)生的變化來(lái)表示。吸去前室培養(yǎng)液，加入1mL熒光素鈉溶液，夾持器前室向上水平放置32±1oC恒溫設(shè)備中孵育90min。取后室液體360μL用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，計(jì)算每組角膜的光密度值的平均值作為平均光密度值。當(dāng)光密度值超出線性范圍時(shí)，需對(duì)測(cè)定液進(jìn)行稀釋?zhuān)汗饷芏戎?稀釋倍數(shù)×（稀釋后測(cè)定液的光密度值-陰性對(duì)照光密度值）6.9體外刺激分?jǐn)?shù)計(jì)算根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分別選用下列不同的體外刺激分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：白光渾濁度儀體外眼刺激分?jǐn)?shù)（IVIS）=平均渾濁度+15×平均光密度值單色光渾濁度儀體外眼刺激分?jǐn)?shù)（LIS）=平均渾濁度（單色光源光度值lux/7）+15×平均光密度值7試驗(yàn)成立條件陰性對(duì)照體外刺激分類(lèi)為無(wú)刺激性，液體受試物陽(yáng)性對(duì)照100%N,N-二甲基甲酰胺或固體受試物陽(yáng)性對(duì)照20%咪唑溶液眼刺激等級(jí)分類(lèi)為I類(lèi)不可逆眼損傷，則此次試驗(yàn)成立。8結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)表1眼刺激性反應(yīng)分級(jí)體外刺激分?jǐn)?shù)眼刺激分類(lèi)白光光源單色光源IVIS≤3LIS≤30無(wú)刺激性3<IVIS≤55LIS>30且lux/7≤145且OD490≤2.5不可單獨(dú)預(yù)測(cè)*IVIS>55LIS>30且lux/7≤145且OD490>2.5或者LIS>30且lux/7>145不可逆眼損傷，I類(lèi)*該分類(lèi)需結(jié)合其他方法進(jìn)一步判定。9結(jié)果解釋當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)，認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果不確定：情況1：3個(gè)角膜中的2個(gè)與平均值結(jié)果不一致；情況2：3個(gè)角膜中的1個(gè)與平均值結(jié)果不一致，并且不一致的值滿(mǎn)足下面四種情形之一：情形1：采用白光光源渾濁度儀測(cè)定，得到的IVIS分?jǐn)?shù)與55（不可逆眼損傷臨界值）相差大于10；情形2：采用單色光源渾濁度儀測(cè)定，根據(jù)渾濁度可分為不可逆眼損傷，I類(lèi)（平均Lux/7>145），但3只角膜中有1只角膜Lux/7<130；情形3：采用單色光源渾濁度儀測(cè)定，根據(jù)光密度值可分為不可逆眼損傷，I類(lèi)（平均光密度值>2.5），但3只角膜中有1只角膜光密度值<2.0；情形4：采用單色光源渾濁度儀測(cè)定，LIS分?jǐn)?shù)為無(wú)刺激性（平均LIS分?jǐn)?shù)≤30），但3只角膜中有1只角膜LIS分?jǐn)?shù)>40。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不確定時(shí)，應(yīng)重復(fù)測(cè)試，當(dāng)?shù)谝淮螜z測(cè)結(jié)果與第二次檢測(cè)結(jié)果相反時(shí)，應(yīng)進(jìn)行第三次檢測(cè)，以第三次檢測(cè)結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)結(jié)果能預(yù)測(cè)受試物的不可逆眼損傷和無(wú)刺激性，可作為不可逆眼損傷和刺激性的確定性方法中的組合方法之一。

附錄渾濁度儀和夾持器1渾濁度儀渾濁度儀是牛角膜渾濁度和滲透性試驗(yàn)中用來(lái)測(cè)量渾濁度的裝置。根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分為白光光源的渾濁度儀和單色光源的渾濁度儀。根據(jù)光源的不同，目前市面上渾濁度儀主要有采用鹵素?zé)舻腛P-KIT渾濁度儀、采用氦氖綠光激光器的LLBO渾濁度儀以及LED白光光源和LED綠色光源的渾濁度儀。任何類(lèi)型的渾濁度儀都應(yīng)符合為一系列渾濁度讀數(shù)提供線性響應(yīng)，包含預(yù)測(cè)模型所涉及的不同刺激等級(jí)的閾值。其他證明與經(jīng)過(guò)驗(yàn)證儀器具有相似的結(jié)果的設(shè)備也可以在實(shí)驗(yàn)室使用。2角膜夾持器BCOP角膜夾持器由惰性材料（如聚丙烯）制成。夾持器由前室和后室兩部分組成，前后室由三個(gè)不銹鋼螺釘固定，位于前后室的外邊緣（分解結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1）。前后室均有1個(gè)圓柱形內(nèi)腔。每個(gè)腔室容積約5mL。兩端各有一個(gè)玻璃片。渾濁度儀透過(guò)玻璃片檢測(cè)光通過(guò)內(nèi)徑的渾濁度。在開(kāi)窗暴露時(shí)，應(yīng)將前室端的玻璃片用開(kāi)窗器移除。玻璃窗和腔室間以及后室的O型環(huán)用于防止液體泄漏。前后室頂部的兩個(gè)孔用于加入和移除受試物和培養(yǎng)基。在暴露和孵育的過(guò)程中，用膠塞封閉。圖1角膜夾持器分解結(jié)構(gòu)圖對(duì)于任何型號(hào)渾濁度儀的夾持器，前后室的內(nèi)徑表面積與后室體積的比例需與傳統(tǒng)角膜夾持器保持一致。這是正確使用公式計(jì)算IVIS或LIS和測(cè)定滲透率值所必需的。角膜夾持器在常規(guī)使用前應(yīng)通過(guò)測(cè)量充滿(mǎn)培養(yǎng)基（無(wú)角膜）的腔室的空白渾濁度進(jìn)行檢查。定期檢查空白渾濁度的變化，若渾濁度發(fā)生變化，進(jìn)行適當(dāng)清潔或考慮角膜更換夾持器。附件3體外皮膚變態(tài)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)方法InChemicoSkinSensitisation:KineticDirectPeptideReactivityAssay(kDPRA)1范圍本方法規(guī)定了動(dòng)力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)的基本原則、試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本方法用于化妝品用化學(xué)原料的皮膚致敏性評(píng)價(jià)，適用于單一成分物質(zhì)、多成分物質(zhì)和已知成分及含量的混合物。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)化妝品用化學(xué)原料是否具有潛在的皮膚致敏性及其分級(jí)。3定義3.1多肽消耗百分比percentpeptidedepletion與溶劑對(duì)照相比，受試物消耗多肽的程度。3.2單一成分物質(zhì)mono-constituentsubstance組成可定量的物質(zhì)，單一主要成分含量至少為80%（w/w）。3.3多成分物質(zhì)multi-constituentsubstance組成可定量的物質(zhì)，其中含有兩種或兩種以上主要成分，每種主要成分的含量≥10%（w/w）和<80%（w/w）。多成分物質(zhì)是制造過(guò)程產(chǎn)生的。3.4混合物mixture由兩種或兩種以上不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)組成的固體或液體物質(zhì)。4試驗(yàn)原理試驗(yàn)基本原理同直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)（DPRA），有致敏性的受試物與多肽模擬的皮膚蛋白（本試驗(yàn)僅使用半胱氨酸多肽）共同孵育，導(dǎo)致多肽量減少。不同于DPRA僅測(cè)試化學(xué)物質(zhì)一個(gè)濃度和一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，kDPRA以時(shí)間和濃度依賴(lài)的方式量化評(píng)價(jià)被測(cè)物質(zhì)的多肽結(jié)合反應(yīng)性。被測(cè)物質(zhì)采用5個(gè)濃度與半胱氨酸多肽溶液孵育不同時(shí)間（6個(gè)時(shí)間點(diǎn)）后，通過(guò)添加單溴二胺（Monobromobimane，mBrB，CAS74235-78-2）與未結(jié)合的半胱氨酸多肽形成熒光復(fù)合物，來(lái)測(cè)量多肽的剩余量。如某時(shí)間點(diǎn)未結(jié)合多肽百分比的自然對(duì)數(shù)與受試物濃度呈線性關(guān)系（準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)），則通過(guò)斜率絕對(duì)值求得反應(yīng)速率常數(shù)k，換算成對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)kt（單位：M-1s-1），并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)lgkt，以其中最大值lgkmax進(jìn)行結(jié)果判斷，評(píng)價(jià)受試物的皮膚致敏性。5試劑和受試物制備5.1多肽片段與純度半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，分子量：751.35，純度：≥95%。5.2陽(yáng)性對(duì)照物陽(yáng)性對(duì)照物常用肉桂醛（CAS104-55-2；純度≥95%）。5.3受試物5.3.1溶劑的選擇溶劑首選乙腈，其次是pH7.5的磷酸鹽緩沖液。二甲基亞砜可能導(dǎo)致肽二聚化，應(yīng)避免使用。5.3.2受試物溶液的配制進(jìn)行試驗(yàn)前，應(yīng)評(píng)估受試物的溶解度。溶解性可用肉眼鑒別，應(yīng)形成澄清透明的溶液。一般受試物最大配制濃度為20mM（應(yīng)完全溶解），對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系終濃度為5mM。試驗(yàn)時(shí)用溶劑連續(xù)稀釋以獲得20、10、5、2.5和1.25mM系列濃度的受試物溶液。20mM的受試物溶液應(yīng)于試驗(yàn)當(dāng)日配制，否則應(yīng)證明儲(chǔ)存不影響其穩(wěn)定性。通常配制量為5mL，受試物（陽(yáng)性對(duì)照）理論稱(chēng)取量為分子量×0.1mg（以純物質(zhì)計(jì)）。kDPRA在技術(shù)上適用于成分和含量明確的多成分物質(zhì)和混合物的測(cè)試，此時(shí)，可以根據(jù)不同組分（不包括水）的占比和分子量計(jì)算受試物總的純度和單一的表觀分子量，用于計(jì)算制備20mM溶液的取樣量。5.3.3陽(yáng)性對(duì)照溶液的配制按受試物溶液的配制方法，用乙腈溶解陽(yáng)性對(duì)照物制成20mM濃度的溶液，并稀釋得到20、10、5、2.5和1.25mM系列濃度的溶液。5.4多肽貯備液的配制稱(chēng)取適量半胱氨酸多肽，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液配制成0.667mM（0.501mg/mL）的溶液。孵育前新鮮配制，配制時(shí)使用渦旋儀震蕩溶解，必要時(shí)可用超聲溶解，應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，防止多肽降解。pH7.5磷酸鹽緩沖液：取0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液18mL，加0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液82mL混合，測(cè)定pH值，應(yīng)在7.50±0.05之間。若偏酸性，加入0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。若偏堿性，加入0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃保存，可在4周內(nèi)使用。5.5單溴二胺溶液的配制稱(chēng)取8.1mg單溴二胺置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成3mM單溴二胺溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。6試驗(yàn)步驟6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)置受試物組（終濃度為0.31mM、0.63mM、1.25mM、2.5mM、5mM）、陽(yáng)性對(duì)照組（positivecontrol，PC）、受試物對(duì)照組（substancecontrol，SC）、溶劑對(duì)照組（vehiclecontrol，VC）和空白對(duì)照組（blankcontrol，BC），其中受試物組每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，VC組、BC組12個(gè)重復(fù)，PC和SC每個(gè)濃度一個(gè)孔。以3個(gè)受試物（A、B、C）為例加樣示例參見(jiàn)圖1。123456789101112AVC組（溶劑+0.5mM多肽）BBC組（溶劑）C0.31mM受試物A+0.5mM多肽0.31mM受試物B+0.5mM多肽0.31mM受試物C+0.5mM多肽0.31mM受試物A+緩沖液0.31mM受試物B+緩沖液0.31mM受試物C+緩沖液D0.63mM受試物A+0.5mM多肽0.63mM受試物B+0.5mM多肽0.63mM受試物C+0.5mM多肽0.63mM受試物A+緩沖液0.63mM受試物B+緩沖液0.63mM受試物C+緩沖液E1.25mM受試物A+0.5mM多肽1.25mM受試物B+0.5mM多肽1.25mM受試物C+0.5mM多肽1.25mM受試物A+緩沖液1.25mM受試物B+緩沖液1.25mM受試物C+緩沖液F2.5mM受試物A+0.5mM多肽2.5mM受試物B+0.5mM多肽2.5mM受試物C+0.5mM多肽2.5mM受試物A+緩沖液2.5mM受試物B+緩沖液2.5mM受試物C+緩沖液G5mM受試物A+0.5mM多肽5mM受試物B+0.5mM多肽5mM受試物C+0.5mM多肽5mM受試物A+緩沖液5mM受試物B+緩沖液5mM受試物C+緩沖液H0.31mMPC+0.5mM多肽0.63mMPC+0.5mM多肽1.25mMPC+0.5mM多肽2.5mMPC+0.5mM多肽5mMPC+0.5mM多肽1.25mMPC+緩沖液2.5mMPC+緩沖液5mMPC+緩沖液10mMPC+緩沖液20mMPC+緩沖液圖1kDPRA反應(yīng)板加樣示例6.2操作步驟每個(gè)反應(yīng)時(shí)間分別準(zhǔn)備應(yīng)用板（受試物溶液稀釋板）和反應(yīng)板。應(yīng)先準(zhǔn)備反應(yīng)板，隨后立即準(zhǔn)備含有受試物稀釋液的應(yīng)用板，并將各組受試物溶液立即加入到反應(yīng)板中。6.2.1反應(yīng)板的準(zhǔn)備使用黑色96孔板，參照?qǐng)D1準(zhǔn)備各時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)板。分別在A1~A12、C1-H1~C5-H5、C6~G6、C7-G7~C9-G9孔中加入120μL0.667mM多肽溶液，在B1~B12、C10-G10~C12-G12、H8~H12孔中加入120μLpH7.5的磷酸鹽緩沖液。6.2.2應(yīng)用板的準(zhǔn)備準(zhǔn)備2mL深孔板，參照?qǐng)D2準(zhǔn)備各時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)用板。分別在A行、B行、C行~F行中每孔分別加入300μL溶劑，將600μL20mM受試物儲(chǔ)存液加入G行。使用多通道移液器從G行吸取300μL，加入F行，隨后按同樣方法依次稀釋至C行。在H1~H4每孔中每孔分別加入600μL溶劑，將1200μL20mM陽(yáng)性對(duì)照物儲(chǔ)存液加入H5孔。使用移液器從H5孔吸取600μL，加入H4行，按同樣方法依次稀釋至H1。從H1~H5中吸取300μL溶液轉(zhuǎn)移到H8~H12孔。配制完成后及時(shí)用封板膜密封待用。123456789101112A溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑B溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑溶劑C1.25mM受試物A1.25mM受試物A1.25mM受試物A1.25mM受試物B1.25mM受試物B1.25mM受試物B1.25mM受試物C1.25mM受試物C1.25mM受試物C1.25mM受試物A1.25mM受試物B1.25mM受試物CD2.5mM受試物A2.5mM受試物A2.5mM受試物A2.5mM受試物B2.5mM受試物B2.5mM受試物B2.5mM受試物C2.5mM受試物C2.5mM受試物C2.5mM受試物A2.5mM受試物B2.5mM受試物CE5mM受試物A5mM受試物A5mM受試物A5mM受試物B5mM受試物B5mM受試物B5mM受試物C5mM受試物C5mM受試物C5mM受試物A5mM受試物B5mM受試物CF10mM受試物A10mM受試物A10mM受試物A10mM受試物B10mM受試物B10mM受試物B10mM受試物C10mM受試物C10mM受試物C10mM受試物A10mM受試物B10mM受試物CG20mM受試物A20mM受試物A20mM受試物A20mM受試物B20mM受試物B20mM受試物B20mM受試物C20mM受試物C20mM受試物C20mM受試物A20mM受試物B20mM受試物CH1.25mMPC2.5mMPC5mMPC10mMPC20mMPC1.25mMPC2.5mMPC5mMPC10mMPC20mMPC圖2應(yīng)用板加樣示例6.3孵育使用多通道移液器從應(yīng)用板中吸取40μL配制好的溶液加入反應(yīng)板對(duì)應(yīng)孔中，用封板膜將反應(yīng)板密封，200rpm震搖5min后，25℃分別孵育10min±30s、30min±3min、90min±5min、150min±10min、210min±10min、1440min±15min。6.4測(cè)定孵育結(jié)束后，撕下封板膜，每孔加入新鮮配制的3mM單溴二胺溶液40μL。200~300rpm震搖5min后，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)480nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。7數(shù)據(jù)處理7.1熒光值計(jì)算和校正計(jì)算BC組、VC組的平均熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差，VC孔減去BC組的平均熒光強(qiáng)度值，各濃度受試物和陽(yáng)性對(duì)照孔減去各自的對(duì)照組的熒光強(qiáng)度值。計(jì)算每個(gè)測(cè)試濃度三個(gè)重復(fù)孔的平均熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與VC組（12個(gè)重復(fù)）的平均多肽濃度是否有顯著性差異。7.2多肽消耗率計(jì)算按以下公式計(jì)算多肽消除率：多肽消耗率（%）=[1-]7.3反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)計(jì)算如給定時(shí)間的最高測(cè)試濃度（受試物終濃度為5mM）符合半胱氨酸多肽結(jié)合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，即多肽消除率≥13.89%，且與VC組差異有顯著性，對(duì)該暴露時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。如不符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，則受試物為非反應(yīng)性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以未消耗肽占比（%）的自然對(duì)數(shù)，即ln（100-dp）為縱坐標(biāo)，受試物濃度為橫坐標(biāo)繪制反應(yīng)曲線，若兩者呈線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r＞0.90），則得到的負(fù)斜率的絕對(duì)值即為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)kobserved（mM-1），按照下式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)kt（M-1s-1）：kt=kobserved·注：t為孵育時(shí)間，以min表示。計(jì)算所有滿(mǎn)足r＞0.90的孵育時(shí)間的lgkt，取其中最大值為lgkmax。8試驗(yàn)成立條件陽(yáng)性對(duì)照組90min時(shí)間點(diǎn)lgk值應(yīng)在-1.75M-1s-1~-1.40M-1s-1范圍內(nèi)，若90min時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有得到lgk值，150min時(shí)間點(diǎn)lgk應(yīng)在-1.90M-1s-1~-1.45M-1s-1范圍內(nèi)。至少有5個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶劑對(duì)照組變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV）＜15%。9結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按表1對(duì)受試物進(jìn)行致敏性分級(jí)。表1kDPRA結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)結(jié)果lgkmax≥-2.0極強(qiáng)或強(qiáng)致敏劑非反應(yīng)性或lgkmax＜-2.0非致敏劑或中、弱致敏劑10注意事項(xiàng)10.1溶劑為磷酸鹽緩沖液的受試物如果受試物溶劑為磷酸鹽緩沖液，則半胱氨酸多肽貯備液配制濃度為1mM（0.752mg/mL），同時(shí)反應(yīng)板制備時(shí)半胱氨酸多肽貯備液（或磷酸鹽緩沖液）每孔加樣體積減少到80μL，然后再加入乙腈或磷酸鹽緩沖液40μL補(bǔ)至120μL，使所有孔中乙腈總體積仍為40μL。10.2非線性反應(yīng)出現(xiàn)非線性反應(yīng)時(shí)無(wú)法通過(guò)斜率法求得速率常數(shù)。速率常數(shù)可以根據(jù)多肽消除率個(gè)體值按以下公式計(jì)算：k=注：dp為多肽消除率（%），E為受試物的濃度，t是孵育時(shí)間。根據(jù)該公式，計(jì)算多肽消耗率高于13.89%