卡介苗重復(fù)接種對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)影響的深度解析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景慢性哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，近年來在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生活質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約有3億人受哮喘困擾，且發(fā)病率仍在持續(xù)攀升。我國的哮喘患病率也不容樂觀，最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，成人哮喘患病率已達(dá)到4.2%，患者總數(shù)超過4500萬。哮喘不僅給患者帶來身體上的痛苦，如反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，還嚴(yán)重影響其日常生活、學(xué)習(xí)和工作。長期患病還可能引發(fā)多種并發(fā)癥，如肺氣腫、肺心病等，進(jìn)一步加重患者的健康負(fù)擔(dān)，甚至危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有25萬人死于哮喘，其死亡率在部分地區(qū)仍呈上升趨勢。因此，深入研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療方法，成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要課題。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，白細(xì)胞介素33（IL-33）作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，近年來受到了廣泛關(guān)注。IL-33屬于IL-1細(xì)胞因子家族，主要由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。正常情況下，IL-33以無活性的全長形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或炎癥刺激時(shí)，會(huì)被釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮其生物學(xué)功能。在哮喘患者中，氣道上皮細(xì)胞受到過敏原、病毒感染等刺激后，會(huì)大量釋放IL-33。IL-33與其受體ST2結(jié)合后，可激活下游信號(hào)通路，促使輔助性T細(xì)胞2（Th2）、固有淋巴細(xì)胞2（ILC2）等免疫細(xì)胞活化，釋放多種細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13等，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步引發(fā)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等病理變化，在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，哮喘患者血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-33水平明顯高于健康人群，且與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。抑制IL-33信號(hào)通路可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，提示IL-33有望成為哮喘治療的新靶點(diǎn)。卡介苗（BCG）作為一種減毒活疫苗，廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，BCG除了預(yù)防結(jié)核病外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)多種免疫相關(guān)疾病，如哮喘、過敏性鼻炎等，具有潛在的治療效果。BCG的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)。BCG接種后，可被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞攝取，激活Toll樣受體（TLRs）等模式識(shí)別受體，啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答。隨后，激活的抗原呈遞細(xì)胞將抗原信息呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。在哮喘動(dòng)物模型中，接種BCG可減輕氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，改善肺功能。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、抑制炎癥細(xì)胞浸潤和減少炎癥因子釋放有關(guān)。然而，BCG對(duì)哮喘的保護(hù)作用是否通過調(diào)節(jié)IL-33的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，目前尚不完全清楚。綜上所述，慢性哮喘嚴(yán)重危害人類健康，IL-33在哮喘發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，BCG具有潛在的治療哮喘的作用。深入研究反復(fù)接種BCG對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的影響，不僅有助于揭示BCG治療哮喘的潛在機(jī)制，為哮喘的治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新的哮喘治療策略提供思路。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究反復(fù)接種卡介苗（BCG）對(duì)慢性哮喘小鼠白細(xì)胞介素33（IL-33）表達(dá)的影響，從而揭示BCG在哮喘治療中的潛在機(jī)制，為臨床治療哮喘提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。從理論層面來看，慢性哮喘的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，盡管當(dāng)前研究已取得一定進(jìn)展，但仍有許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚未完全明晰。IL-33作為一種在哮喘發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及與其他免疫因子的相互作用關(guān)系，一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)?？ń槊珉m已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)哮喘有潛在治療效果，但其具體作用機(jī)制存在諸多不確定性。本研究通過反復(fù)接種BCG，觀察慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，能夠進(jìn)一步揭示BCG與IL-33之間的內(nèi)在聯(lián)系，補(bǔ)充和完善哮喘發(fā)病機(jī)制的理論體系。這不僅有助于我們從分子和細(xì)胞層面深入理解哮喘的發(fā)病過程，還能為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向，推動(dòng)哮喘相關(guān)研究的不斷深入發(fā)展。在臨床應(yīng)用方面，目前哮喘的治療主要依賴于糖皮質(zhì)激素等藥物，雖能在一定程度上緩解癥狀，但長期使用會(huì)帶來諸多副作用，且部分患者對(duì)藥物的反應(yīng)不佳，難以達(dá)到理想的治療效果。尋找安全、有效的新型治療方法或輔助治療手段，是改善哮喘患者預(yù)后、提高生活質(zhì)量的關(guān)鍵。本研究若能證實(shí)BCG通過調(diào)節(jié)IL-33表達(dá)發(fā)揮抗哮喘作用，將為哮喘的臨床治療開辟新的途徑。一方面，可將BCG作為一種輔助治療手段，與現(xiàn)有治療方法聯(lián)合應(yīng)用，增強(qiáng)治療效果，減少糖皮質(zhì)激素等藥物的使用劑量和副作用；另一方面，基于對(duì)BCG作用機(jī)制的深入了解，有望開發(fā)出以IL-33為靶點(diǎn)的新型治療藥物，為哮喘患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療方案，從而顯著降低哮喘的發(fā)病率和死亡率，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1慢性哮喘概述2.1.1慢性哮喘的定義與特征慢性哮喘是一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限為主要特征。其定義強(qiáng)調(diào)了疾病的慢性持續(xù)性以及氣道炎癥在發(fā)病機(jī)制中的核心地位。氣道炎癥是慢性哮喘的重要病理基礎(chǔ)，涉及多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的參與。在哮喘發(fā)作時(shí)，氣道內(nèi)會(huì)聚集大量的嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞。這些炎癥細(xì)胞被激活后，會(huì)釋放一系列炎癥介質(zhì)，如組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等。組胺可引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加和黏液分泌增多；白三烯具有強(qiáng)烈的支氣管收縮作用，還能促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化和聚集；前列腺素和血小板活化因子等也在氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，共同導(dǎo)致氣道黏膜水腫、黏液分泌亢進(jìn)、氣道平滑肌痙攣等病理變化，進(jìn)而引起哮喘癥狀的發(fā)作。氣道高反應(yīng)性是指氣道對(duì)各種刺激因素如過敏原、冷空氣、運(yùn)動(dòng)、藥物等呈現(xiàn)出過度敏感的狀態(tài)，表現(xiàn)為氣道平滑肌收縮增強(qiáng)、氣道口徑縮小，從而導(dǎo)致氣流受限。這種高反應(yīng)性是慢性哮喘的重要特征之一，使得患者在接觸到輕微的刺激時(shí)就容易誘發(fā)哮喘發(fā)作。研究表明，氣道高反應(yīng)性的發(fā)生與氣道炎癥密切相關(guān)，炎癥細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)可損傷氣道上皮細(xì)胞，使氣道神經(jīng)末梢暴露，增加神經(jīng)反射的敏感性，同時(shí)還可改變氣道平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能，使其對(duì)刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)。變態(tài)反應(yīng)在慢性哮喘的發(fā)病中也起著關(guān)鍵作用。大多數(shù)哮喘患者屬于過敏性哮喘，其發(fā)病與過敏原的接觸密切相關(guān)。常見的過敏原包括塵螨、花粉、動(dòng)物毛發(fā)皮屑、霉菌等。當(dāng)過敏原進(jìn)入人體后，會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞攝取并加工處理，然后將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活Th2細(xì)胞。Th2細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-4可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使這些細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同過敏原時(shí)，過敏原與致敏細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引發(fā)哮喘發(fā)作。IL-5主要作用于嗜酸性粒細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化和活化，使其在氣道內(nèi)聚集并釋放毒性物質(zhì)，加重氣道炎癥。IL-13可調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)黏液分泌，還能誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和氣道重塑。2.1.2慢性哮喘的發(fā)病機(jī)制慢性哮喘的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及免疫調(diào)節(jié)失衡等多個(gè)方面，它們相互作用，共同導(dǎo)致了哮喘的發(fā)生與發(fā)展。遺傳因素在慢性哮喘的發(fā)病中起著重要的作用。研究表明，哮喘具有明顯的遺傳傾向，家族聚集性較為顯著。多項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)鑒定出多個(gè)與哮喘相關(guān)的基因位點(diǎn)，這些基因主要參與免疫調(diào)節(jié)、氣道炎癥反應(yīng)、氣道平滑肌功能以及氣道重塑等過程。例如，IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子基因的多態(tài)性與哮喘的易感性密切相關(guān)。IL-4基因的某些單核苷酸多態(tài)性（SNPs）可影響IL-4的表達(dá)水平和生物學(xué)活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化和功能，增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，一些編碼免疫受體、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路分子的基因變異也與哮喘的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。然而，遺傳因素并非決定哮喘發(fā)病的唯一因素，環(huán)境因素在哮喘的發(fā)病過程中同樣起著不可或缺的作用。環(huán)境因素是誘發(fā)慢性哮喘發(fā)作的重要誘因，包括過敏原暴露、空氣污染、呼吸道感染、吸煙等。過敏原是導(dǎo)致過敏性哮喘發(fā)作的主要環(huán)境因素之一，如前文所述，塵螨、花粉、動(dòng)物毛發(fā)皮屑、霉菌等常見過敏原可通過觸發(fā)變態(tài)反應(yīng)，引發(fā)哮喘發(fā)作。空氣污染中的有害物質(zhì)，如二氧化硫、氮氧化物、顆粒物（PM2.5、PM10）等，可刺激氣道黏膜，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性增加。研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于高濃度的空氣污染環(huán)境中，哮喘的發(fā)病率和死亡率顯著升高。呼吸道感染，尤其是病毒感染，如呼吸道合胞病毒、鼻病毒等，是哮喘發(fā)作的重要誘因之一。病毒感染可損傷氣道上皮細(xì)胞，激活固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)釋放，從而誘發(fā)哮喘發(fā)作。此外，吸煙也是哮喘的重要危險(xiǎn)因素，無論是主動(dòng)吸煙還是被動(dòng)吸煙，都會(huì)對(duì)氣道造成損害，增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。吸煙產(chǎn)生的煙霧中含有多種有害物質(zhì)，如尼古丁、焦油、一氧化碳等，這些物質(zhì)可直接損傷氣道上皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，同時(shí)還可抑制氣道黏膜的纖毛運(yùn)動(dòng)，影響氣道的自凈功能。Th1/Th2失衡是慢性哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體的Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，共同維持著免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，抵御細(xì)胞內(nèi)病原體的感染。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答，在抗寄生蟲感染和變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在哮喘患者中，由于遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1細(xì)胞功能相對(duì)不足。這種失衡使得Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子增多，如IL-4、IL-5、IL-13等，從而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化和聚集，引發(fā)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。例如，IL-4可促進(jìn)IgE的合成，IL-5可激活和募集嗜酸性粒細(xì)胞，IL-13可誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮、黏液分泌增加和氣道重塑。同時(shí)，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子還可抑制Th1細(xì)胞的功能，進(jìn)一步加重Th1/Th2失衡，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致哮喘病情的持續(xù)發(fā)展。炎癥細(xì)胞浸潤是慢性哮喘氣道炎癥的重要病理表現(xiàn)。在哮喘發(fā)作時(shí)，多種炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會(huì)浸潤到氣道黏膜和黏膜下層。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥中最重要的炎癥細(xì)胞之一，其表面表達(dá)多種受體，可識(shí)別并結(jié)合炎癥介質(zhì)和趨化因子，從而被招募到氣道局部。嗜酸性粒細(xì)胞活化后，可釋放多種毒性物質(zhì)，如嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EPO）等，這些物質(zhì)可損傷氣道上皮細(xì)胞、促進(jìn)氣道平滑肌收縮和氣道重塑，加重氣道炎癥。肥大細(xì)胞主要分布在氣道黏膜下和血管周圍，其表面表達(dá)高親和力的IgE受體。當(dāng)過敏原與致敏肥大細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合后，可導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、前列腺素等炎癥介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加和黏液分泌增多。T淋巴細(xì)胞在哮喘的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用，其中Th2細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能和氣道炎癥反應(yīng)。此外，Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等其他T細(xì)胞亞群也參與了哮喘的發(fā)病過程。Th17細(xì)胞可分泌IL-17等細(xì)胞因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集和活化，加重氣道炎癥。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，可抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的活性，維持免疫平衡。在哮喘患者中，Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能可能發(fā)生異常，導(dǎo)致其對(duì)炎癥細(xì)胞的抑制作用減弱，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，可吞噬和清除病原體，同時(shí)還能分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在哮喘氣道炎癥中，巨噬細(xì)胞被激活后，可分泌IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子，參與氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞因子釋放是慢性哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。多種細(xì)胞因子在哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。除了前文提到的Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13外，還有其他一些細(xì)胞因子也參與了哮喘的發(fā)病過程。例如，IL-1、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子可激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。IL-1可刺激T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，IL-6可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，TNF-α可誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。此外，趨化因子如CCL11（eotaxin）、CCL24等在炎癥細(xì)胞的募集和活化中起著重要作用。CCL11可特異性地趨化嗜酸性粒細(xì)胞，使其向氣道局部聚集。細(xì)胞因子之間還存在著復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，它們通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等方式相互調(diào)節(jié)，共同影響著哮喘的發(fā)病過程。例如，IL-4和IL-13可協(xié)同作用，促進(jìn)IgE的合成和氣道重塑；IL-5和CCL11可相互促進(jìn)，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的募集和活化。深入研究細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及其相互關(guān)系，對(duì)于揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。2.2IL-33的相關(guān)知識(shí)2.2.1IL-33的結(jié)構(gòu)與功能IL-33是白細(xì)胞介素-1（IL-1）細(xì)胞因子家族的重要成員，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有多種重要的生物學(xué)功能。IL-33基因位于人類9號(hào)染色體（9p24.1），由8個(gè)外顯子組成，其中1號(hào)外顯子不參與蛋白質(zhì)翻譯。人全長IL-33蛋白含有270個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約為30kDa，包含3個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域。N端核結(jié)構(gòu)域（氨基酸1-65）包含一段染色質(zhì)結(jié)合序列（CBM，40-58位氨基酸），該序列能夠與染色質(zhì)上由組蛋白H2A-H2B形成的“酸性口袋”相互作用，進(jìn)而結(jié)合到染色質(zhì)上，影響染色質(zhì)的固縮狀態(tài)。然而，關(guān)于核內(nèi)IL-33是否像其他IL-1家族成員那樣，通過CBM結(jié)合到特定靶基因上并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，目前學(xué)術(shù)界仍存在爭議。中間結(jié)構(gòu)域（氨基酸66-111）包含多個(gè)酶切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可被中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等分泌的蛋白酶識(shí)別并切割。C端IL-1樣細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域（氨基酸112-270）是IL-33發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，它能夠與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而激活下游信號(hào)通路。在功能方面，IL-33主要由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞產(chǎn)生，在受到炎癥刺激、組織損傷或應(yīng)激等情況下，這些細(xì)胞會(huì)將IL-33釋放到細(xì)胞外。IL-33作為一種警報(bào)素，能夠在機(jī)體受到損傷或病原體入侵時(shí)，迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答。它可以與靶細(xì)胞表面的受體ST2（又稱IL-1受體樣1）結(jié)合，ST2主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）、輔助性T細(xì)胞2（Th2）等細(xì)胞表面。IL-33與ST2結(jié)合后，通過激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號(hào)通路，進(jìn)而激活核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)分子，促使靶細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子。這些細(xì)胞因子和趨化因子包括IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子，它們?cè)谘装Y反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。例如，IL-4可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，參與體液免疫應(yīng)答和過敏反應(yīng)；IL-5能夠激活和募集嗜酸性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其在炎癥部位的聚集和功能；IL-13可誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮、黏液分泌增加和氣道重塑。此外，IL-33還可以調(diào)節(jié)固有免疫細(xì)胞的功能，如激活肥大細(xì)胞，促使其釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引發(fā)過敏反應(yīng)；激活固有淋巴細(xì)胞2型（ILC2），促進(jìn)其分泌IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，參與組織修復(fù)和對(duì)寄生蟲的免疫反應(yīng)。在組織修復(fù)與再生方面，IL-33通過激活I(lǐng)LC2和Th2細(xì)胞，促進(jìn)分泌IL-13等細(xì)胞因子，刺激組織再生和膠原生成，特別是在氣道和腸道等屏障組織中，IL-33在損傷修復(fù)中的功能尤為顯著。在哮喘等過敏性疾病中，IL-33發(fā)揮著關(guān)鍵的促炎作用。哮喘患者氣道上皮細(xì)胞在受到過敏原、病毒感染等刺激后，會(huì)大量釋放IL-33。IL-33與其受體ST2結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促使Th2細(xì)胞、ILC2等免疫細(xì)胞活化，釋放大量Th2型細(xì)胞因子，引發(fā)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等病理變化。研究表明，哮喘患者血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-33水平明顯高于健康人群，且與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。抑制IL-33信號(hào)通路可顯著減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，進(jìn)一步證實(shí)了IL-33在哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要作用。2.2.2IL-33在慢性哮喘中的作用機(jī)制在慢性哮喘的發(fā)病過程中，IL-33通過與受體結(jié)合，激活一系列復(fù)雜的信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞活化、趨化，進(jìn)而引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。IL-33發(fā)揮作用的首要步驟是與靶細(xì)胞表面的受體ST2結(jié)合。ST2主要以兩種形式存在，即膜結(jié)合型ST2（ST2L）和可溶性ST2（sST2）。ST2L具有跨膜序列，主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、DCs、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面，是IL-33發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的功能性受體。當(dāng)IL-33與ST2L結(jié)合后，會(huì)招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88作為接頭蛋白，通過其死亡結(jié)構(gòu)域與ST2L的胞內(nèi)段相互作用。隨后，MyD88激活白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，包括IRAK1、IRAK4等。活化的IRAKs進(jìn)一步磷酸化并激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1可激活兩條主要的信號(hào)通路，即核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。在NF-κB信號(hào)通路中，TAK1激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，該復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基NEMO組成。IKKβ磷酸化抑制蛋白IκB，使其發(fā)生泛素化修飾并被蛋白酶體降解。解除抑制后的NF-κB得以釋放，并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括編碼多種細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等）、趨化因子（如CCL11、CCL24等）和黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1等）的基因。這些細(xì)胞因子和趨化因子能夠招募和激活多種炎癥細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。例如，IL-1可刺激T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，IL-6可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，TNF-α可誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。CCL11等趨化因子能夠特異性地趨化嗜酸性粒細(xì)胞，使其向氣道局部聚集，加重氣道炎癥。在MAPK信號(hào)通路中，TAK1激活p38MAPK、JNK和ERK等MAPK家族成員。p38MAPK被激活后，可磷酸化并激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如ATF2、Elk-1等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等過程。JNK激活后，可磷酸化c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子，形成AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。ERK激活后，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程，同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。通過激活MAPK信號(hào)通路，IL-33可促使靶細(xì)胞產(chǎn)生和釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。IL-33激活的信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的活化和趨化。在哮喘患者中，氣道上皮細(xì)胞釋放的IL-33與ST2L結(jié)合，激活Th2細(xì)胞，促使其分泌大量Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-4可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使這些細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同過敏原時(shí)，過敏原與致敏細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加和黏液分泌增多。IL-5可激活和募集嗜酸性粒細(xì)胞，使其在氣道內(nèi)大量聚集。嗜酸性粒細(xì)胞活化后，釋放多種毒性物質(zhì)，如嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EPO）等，這些物質(zhì)可損傷氣道上皮細(xì)胞、促進(jìn)氣道平滑肌收縮和氣道重塑，加重氣道炎癥。此外，IL-33還可激活I(lǐng)LC2，ILC2分泌的IL-5和IL-13等細(xì)胞因子也參與了氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。IL-13可誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮、黏液分泌增加和氣道重塑，它還能調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，導(dǎo)致氣道黏液高分泌，進(jìn)一步加重氣道阻塞。炎癥細(xì)胞的活化和趨化最終引發(fā)氣道炎癥和高反應(yīng)性。大量炎癥細(xì)胞浸潤到氣道黏膜和黏膜下層，釋放的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子破壞了氣道的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致氣道黏膜水腫、黏液分泌亢進(jìn)、氣道平滑肌痙攣等病理變化，從而引起氣道炎癥。氣道炎癥又進(jìn)一步損傷氣道上皮細(xì)胞，使氣道神經(jīng)末梢暴露，增加神經(jīng)反射的敏感性，同時(shí)改變氣道平滑肌的結(jié)構(gòu)和功能，使其對(duì)刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。氣道高反應(yīng)性使得患者的氣道對(duì)各種刺激因素如過敏原、冷空氣、運(yùn)動(dòng)、藥物等呈現(xiàn)出過度敏感的狀態(tài)，輕微刺激即可誘發(fā)哮喘發(fā)作，表現(xiàn)為喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀。2.3BCG的相關(guān)知識(shí)2.3.1BCG的簡介卡介苗（BCG）是由減毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液制成的活菌苗，其來源可追溯到20世紀(jì)初。1908年，法國細(xì)菌學(xué)家阿爾伯特?卡爾梅特（AlbertCalmette）和卡米爾?介朗（CamilleGuérin）將牛型結(jié)核桿菌在含有膽汁、甘油和馬鈴薯的培養(yǎng)基上進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)，經(jīng)過13年230次傳代，成功獲得了減毒牛型結(jié)核桿菌菌株，這便是卡介苗的前身。此后，卡介苗逐漸在全球范圍內(nèi)推廣應(yīng)用，成為預(yù)防結(jié)核病的重要手段。BCG的主要成分包括減毒牛型結(jié)核桿菌及其代謝產(chǎn)物，這些成分能夠刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫應(yīng)答。減毒牛型結(jié)核桿菌保留了結(jié)核桿菌的一些抗原特性，但致病力顯著降低，使其能夠在不引起嚴(yán)重疾病的前提下，激活機(jī)體的免疫細(xì)胞。卡介苗中的細(xì)胞壁成分，如脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、阿拉伯半乳聚糖等，可被巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別，啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答?？ń槊缭谌蚍秶鷥?nèi)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防，尤其是在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，卡介苗接種是預(yù)防兒童重癥結(jié)核病，如結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核病的重要措施。世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦，在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，新生兒應(yīng)在出生后盡快接種卡介苗。在我國，卡介苗接種是國家免疫規(guī)劃的重要組成部分，新生兒出生后24小時(shí)內(nèi)通常會(huì)接種卡介苗。接種卡介苗后，機(jī)體可產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫方面，T淋巴細(xì)胞被激活，分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞可直接殺傷感染結(jié)核桿菌的細(xì)胞，記憶T細(xì)胞則在再次接觸結(jié)核桿菌時(shí)迅速活化，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。體液免疫方面，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，可中和結(jié)核桿菌及其毒素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卡介苗對(duì)兒童結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核病的預(yù)防效果可達(dá)70%-90%，在控制結(jié)核病的傳播和發(fā)病方面發(fā)揮了重要作用。2.3.2BCG的免疫調(diào)節(jié)作用卡介苗（BCG）具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，其通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，維持免疫平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，在預(yù)防和治療多種免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用。巨噬細(xì)胞是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分，BCG可有效激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力。BCG通過其表面的抗原成分與巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。這些通路包括髓樣分化因子88（MyD88）依賴和非依賴的信號(hào)通路，最終導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等轉(zhuǎn)錄因子的激活?；罨霓D(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促使巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子不僅可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，還能招募和激活其他免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，共同參與免疫應(yīng)答。此外，BCG激活的巨噬細(xì)胞還可通過產(chǎn)生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等物質(zhì)，直接殺傷病原體。研究表明，接種BCG后，巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯增強(qiáng)，對(duì)結(jié)核桿菌等病原體的殺傷效率顯著提高。T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著核心作用，BCG能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化、增殖和分化，影響細(xì)胞免疫和體液免疫的平衡。BCG被抗原呈遞細(xì)胞（APCs）攝取后，經(jīng)過加工處理，將抗原肽呈遞給T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR），同時(shí)APCs表面的共刺激分子，如CD80、CD86等與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，從而激活T細(xì)胞。激活的T細(xì)胞開始增殖分化，根據(jù)分泌的細(xì)胞因子和功能的不同，可分為輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞2（Th2）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等不同亞群。BCG主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子。IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷病原體的能力，同時(shí)還能抑制Th2細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。IL-2則可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。此外，BCG還能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，可抑制過度的免疫反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，接種BCG后，機(jī)體中Th1細(xì)胞的比例增加，Th1型細(xì)胞因子的分泌水平升高，而Th2細(xì)胞的比例和Th2型細(xì)胞因子的分泌受到抑制，從而增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力。B細(xì)胞是體液免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，BCG對(duì)B細(xì)胞的功能也具有調(diào)節(jié)作用。BCG激活的T細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子和直接接觸等方式，輔助B細(xì)胞的活化和分化。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a等抗體，增強(qiáng)體液免疫對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的清除能力。同時(shí)，BCG還能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生天然抗體，這些抗體在病原體入侵的早期階段發(fā)揮重要的防御作用。研究表明，接種BCG后，機(jī)體血清中IgG、IgA等抗體水平升高，且抗體的親和力和特異性也有所增強(qiáng)。BCG對(duì)Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)在免疫調(diào)節(jié)中具有重要意義。在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體的Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，共同維持著免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。然而，在某些疾病狀態(tài)下，如過敏性疾病、感染性疾病等，Th1/Th2平衡會(huì)發(fā)生失調(diào)。在過敏性哮喘中，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌大量Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，導(dǎo)致氣道炎癥和過敏反應(yīng)。而BCG接種可通過激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，抑制Th2細(xì)胞的功能，使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。BCG激活的巨噬細(xì)胞分泌的IL-12等細(xì)胞因子，可促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，抑制Th2細(xì)胞的發(fā)育。同時(shí)，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕氣道炎癥和過敏反應(yīng)。許多研究已經(jīng)證實(shí)，在哮喘動(dòng)物模型中，接種BCG后，氣道內(nèi)Th2型細(xì)胞因子的水平降低，Th1型細(xì)胞因子的水平升高，氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性得到明顯改善。綜上所述，卡介苗通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，在預(yù)防和治療多種免疫相關(guān)疾病中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的深入研究，為開發(fā)新的免疫治療策略提供了理論基礎(chǔ)。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重為18-22g，共60只。BALB/c小鼠是常用的近交系小鼠，在免疫學(xué)和生理學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。其免疫遺傳背景清晰，品系純正，成本相對(duì)較低且來源廣泛。大量研究表明，BALB/c小鼠對(duì)致敏原的敏感性較高，在受到卵清蛋白等致敏原刺激后，易產(chǎn)生針對(duì)致敏原的高滴度IgE抗體，同時(shí)出現(xiàn)明顯的氣道高反應(yīng)性和過敏性氣道炎癥，這些反應(yīng)與人類哮喘的病理生理特征高度相似。雌性BALB/c小鼠在過敏性氣道炎癥方面的表現(xiàn)相較于雄性更為顯著，因此本研究選用雌性小鼠，以更好地模擬人類哮喘的發(fā)病過程，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和有效性。小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，實(shí)驗(yàn)前在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(23±2)℃，相對(duì)濕度為(50±5)%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需試劑如下：卡介苗（BCG），購自[BCG生產(chǎn)廠家]，為減毒牛型結(jié)核桿菌懸浮液，用于小鼠的接種；卵清蛋白（OVA），GradeⅤ，購自[OVA生產(chǎn)廠家]，作為致敏原用于誘導(dǎo)小鼠哮喘模型；氫氧化鋁，分析純，購自[氫氧化鋁生產(chǎn)廠家]，作為佐劑增強(qiáng)OVA的致敏效果；戊巴比妥鈉，購自[戊巴比妥鈉生產(chǎn)廠家]，用于小鼠的麻醉；多聚甲醛，分析純，購自[多聚甲醛生產(chǎn)廠家]，用于固定小鼠肺組織；Trizol試劑，購自[Trizol試劑生產(chǎn)廠家]，用于提取小鼠肺組織中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自[逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自[實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測IL-33基因的表達(dá)水平；ELISA試劑盒，購自[ELISA試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-33的蛋白含量；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[HE染色試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行染色，觀察病理變化；免疫組化試劑盒，購自[免疫組化試劑盒生產(chǎn)廠家]，用于檢測小鼠肺組織中IL-33蛋白的表達(dá)定位。實(shí)驗(yàn)所需儀器如下：電子天平，型號(hào)[天平型號(hào)]，購自[天平生產(chǎn)廠家]，用于稱量試劑和小鼠體重；超聲霧化器，型號(hào)[霧化器型號(hào)]，購自[霧化器生產(chǎn)廠家]，用于將OVA溶液霧化，對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)；CO?麻醉箱，購自[麻醉箱生產(chǎn)廠家]，用于對(duì)小鼠實(shí)施CO?麻醉；低溫高速離心機(jī)，型號(hào)[離心機(jī)型號(hào)]，購自[離心機(jī)生產(chǎn)廠家]，用于分離小鼠血清和BALF；PCR儀，型號(hào)[PCR儀型號(hào)]，購自[PCR儀生產(chǎn)廠家]，用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；酶標(biāo)儀，型號(hào)[酶標(biāo)儀型號(hào)]，購自[酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家]，用于檢測ELISA試劑盒的吸光度值；石蠟切片機(jī)，型號(hào)[切片機(jī)型號(hào)]，購自[切片機(jī)生產(chǎn)廠家]，用于制作小鼠肺組織石蠟切片；顯微鏡，型號(hào)[顯微鏡型號(hào)]，購自[顯微鏡生產(chǎn)廠家]，用于觀察小鼠肺組織的病理變化和免疫組化染色結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1慢性哮喘小鼠模型的建立采用卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法建立慢性哮喘小鼠模型。具體步驟如下：在實(shí)驗(yàn)的第1天和第14天，將OVA（20μg）與氫氧化鋁（4mg）充分混合，溶解于0.2mL滅菌生理鹽水中，配制成致敏液。對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏液，以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫致敏反應(yīng)。在第21、22、23天，將小鼠置于特制的霧化箱內(nèi)，使用超聲霧化器將1%OVA溶液霧化，使小鼠吸入霧化的OVA，每次霧化時(shí)間為30分鐘，每天1次，連續(xù)3天，從而激發(fā)哮喘發(fā)作。正常對(duì)照組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量的生理鹽水，并吸入生理鹽水霧化液。在模型建立過程中，需密切關(guān)注小鼠的狀態(tài)，如出現(xiàn)呼吸急促、喘息、煩躁不安、口唇紫紺等典型哮喘癥狀，表明模型建立成功。同時(shí)，為確保模型的穩(wěn)定性和可靠性，應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括致敏原的劑量、注射方式、霧化時(shí)間和環(huán)境溫度、濕度等。此外，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)輕柔，避免對(duì)小鼠造成不必要的應(yīng)激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)死亡或其他異常情況，應(yīng)及時(shí)記錄并分析原因，必要時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。3.2.2BCG的接種方案將建模成功的慢性哮喘小鼠隨機(jī)分為反復(fù)接種BCG組、單次接種BCG組和哮喘模型對(duì)照組，每組各20只。反復(fù)接種BCG組：在哮喘模型建立完成后第1天開始接種BCG，采用皮內(nèi)注射的方式，于小鼠左后肢足墊部位注射BCG（每只小鼠注射劑量為1×10^6CFU，用無菌生理鹽水稀釋至0.05mL）。此后，每隔14天接種1次，共接種3次。這種反復(fù)接種的方式能夠持續(xù)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其不斷產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而更有效地發(fā)揮BCG的免疫調(diào)節(jié)作用。單次接種BCG組：在哮喘模型建立完成后第1天，同樣采用皮內(nèi)注射的方式，于小鼠左后肢足墊部位注射BCG（每只小鼠注射劑量為1×10^6CFU，用無菌生理鹽水稀釋至0.05mL），僅接種1次。通過設(shè)置單次接種組，可與反復(fù)接種組進(jìn)行對(duì)比，觀察接種次數(shù)對(duì)BCG免疫調(diào)節(jié)效果的影響。哮喘模型對(duì)照組：在哮喘模型建立完成后，于相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠左后肢足墊部位注射0.05mL無菌生理鹽水，不接種BCG。該組用于觀察哮喘模型自然發(fā)展過程中的各項(xiàng)指標(biāo)變化，作為其他兩組的對(duì)照基礎(chǔ)。在接種過程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止感染的發(fā)生。同時(shí)，要準(zhǔn)確控制BCG的接種劑量和接種部位，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。接種后，密切觀察小鼠的反應(yīng)，如有無局部紅腫、發(fā)熱、全身不適等不良反應(yīng)，若出現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時(shí)記錄并采取相應(yīng)措施。3.2.3樣本采集與檢測指標(biāo)在末次激發(fā)或接種BCG24小時(shí)后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行樣本采集。首先，使用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，然后進(jìn)行以下操作：肺組織采集：通過頸椎脫臼法處死小鼠，迅速打開胸腔，完整取出肺組織。將一部分肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)的組織病理學(xué)檢查和免疫組化檢測；另一部分肺組織置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于提取總RNA和蛋白質(zhì)，以檢測IL-33基因和蛋白的表達(dá)水平。支氣管肺泡灌洗液（BALF）采集：在處死小鼠后，暴露氣管，插入氣管插管，用預(yù)冷的無菌生理鹽水（每次0.8mL，共3次）進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。輕柔按摩小鼠肺部，然后緩慢回抽灌洗液，收集BALF于離心管中。將BALF以1500r/min離心10分鐘，取上清液置于-80℃冰箱保存，用于檢測IL-33、炎癥細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等）的蛋白含量以及細(xì)胞計(jì)數(shù)；沉淀用1mL無菌生理鹽水重懸，用于進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。血清采集：在麻醉小鼠后，通過眼球取血的方法收集血液，將血液置于離心管中，室溫靜置2小時(shí)，然后以3000r/min離心15分鐘，分離出血清。將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于-80℃冰箱保存，用于檢測IL-33、OVA特異性IgE等指標(biāo)的含量。檢測指標(biāo)及方法如下：IL-33表達(dá)檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測肺組織中IL-33基因的表達(dá)水平。具體步驟為：使用Trizol試劑提取肺組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中IL-33基因序列設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；內(nèi)參基因選擇GAPDH，上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH?O7μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒，60℃退火30秒。通過檢測Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算IL-33基因的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用ELISA試劑盒檢測血清和BALF中IL-33的蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-33的濃度。此外，運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測肺組織中IL-33蛋白的表達(dá)定位，具體步驟為：將固定好的肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后加入一抗（兔抗小鼠IL-33多克隆抗體），4℃孵育過夜。次日，加入二抗（山羊抗兔IgG），37℃孵育30分鐘。最后，使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察IL-33蛋白的表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度。其他指標(biāo)檢測：采用ELISA試劑盒檢測血清中OVA特異性IgE的含量，以及BALF中IL-4、IL-5、IL-13等炎癥細(xì)胞因子的含量，操作方法同IL-33蛋白檢測。對(duì)BALF中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，取適量BALF細(xì)胞懸液滴于玻片上，自然干燥后，進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等各類細(xì)胞的百分比。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織的病理變化，將固定好的肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，脫蠟至水后，用蘇木精染色細(xì)胞核，伊紅染色細(xì)胞質(zhì)。脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括氣道炎癥細(xì)胞浸潤、氣道平滑肌增厚、黏液分泌等情況。3.3數(shù)據(jù)處理與分析本研究使用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。在數(shù)據(jù)錄入環(huán)節(jié)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性至關(guān)重要。將實(shí)驗(yàn)所得的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，包括IL-33基因和蛋白表達(dá)水平、炎癥細(xì)胞因子含量、BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果以及肺組織病理評(píng)分等，仔細(xì)錄入到統(tǒng)計(jì)軟件中。對(duì)于缺失值或異常值，進(jìn)行嚴(yán)格的審核和處理。若缺失值較少，采用均值替代法或多重填補(bǔ)法進(jìn)行填補(bǔ)；若存在異常值，通過Z-score法或箱線圖法進(jìn)行識(shí)別，對(duì)于由實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致的異常值，予以剔除或修正。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。若方差齊性，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett’sT3法進(jìn)行兩兩比較。例如，在比較反復(fù)接種BCG組、單次接種BCG組和哮喘模型對(duì)照組小鼠肺組織中IL-33基因表達(dá)水平時(shí)，先進(jìn)行單因素方差分析，判斷三組數(shù)據(jù)總體上是否存在差異。若存在差異，再根據(jù)方差齊性情況選擇合適的兩兩比較方法，確定具體哪些組之間存在顯著差異。對(duì)于兩組間比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。比如，在比較正常對(duì)照組和哮喘模型對(duì)照組小鼠血清中OVA特異性IgE含量時(shí)，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分析兩組數(shù)據(jù)是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以判斷哮喘模型的建立是否成功。在統(tǒng)計(jì)分析過程中，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過合理的統(tǒng)計(jì)分析方法，準(zhǔn)確揭示不同組間數(shù)據(jù)的差異，為研究反復(fù)接種BCG對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的影響提供可靠的統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1慢性哮喘小鼠模型的鑒定結(jié)果在哮喘癥狀方面，正常對(duì)照組小鼠呼吸平穩(wěn)，活動(dòng)自如，無明顯喘息、呼吸急促等癥狀。而哮喘模型對(duì)照組小鼠在吸入OVA激發(fā)后，出現(xiàn)了典型的哮喘癥狀，表現(xiàn)為呼吸急促，呼吸頻率明顯加快，可達(dá)正常小鼠的2-3倍。小鼠還伴有明顯的喘息，可聽到清晰的喘鳴聲，活動(dòng)量顯著減少，常蜷縮在籠角，精神萎靡。部分小鼠出現(xiàn)口唇紫紺，提示機(jī)體缺氧，這是由于氣道痙攣和炎癥導(dǎo)致通氣功能障礙所致。這些癥狀在激發(fā)后的1-2小時(shí)內(nèi)最為明顯，隨后逐漸有所緩解，但在整個(gè)觀察期內(nèi)仍可間斷觀察到。肺組織病理變化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡形態(tài)規(guī)則，大小均勻，肺泡壁薄且光滑，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。支氣管黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，杯狀細(xì)胞數(shù)量正常，無黏液分泌亢進(jìn)現(xiàn)象。血管周圍無充血、水腫，平滑肌厚度正常。而哮喘模型對(duì)照組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡融合，肺泡間隔增寬。支氣管黏膜上皮損傷，纖毛脫落，杯狀細(xì)胞大量增生，導(dǎo)致氣道內(nèi)黏液栓形成，堵塞氣道。氣道和血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要包括嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。嗜酸性粒細(xì)胞呈橘紅色，胞質(zhì)內(nèi)含有粗大的嗜酸性顆粒；淋巴細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)致密；巨噬細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核不規(guī)則，胞質(zhì)豐富。氣道平滑肌增厚，提示氣道重塑的發(fā)生。這些病理變化表明哮喘模型對(duì)照組小鼠成功復(fù)制出了慢性哮喘的病理特征。對(duì)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)較少，平均為（0.52±0.15）×10?個(gè)/mL。其中，嗜酸性粒細(xì)胞比例極低，僅占（2.5±1.2）%；中性粒細(xì)胞占（10.3±3.5）%；淋巴細(xì)胞占（35.6±5.2）%；巨噬細(xì)胞占（51.6±6.8）%。而哮喘模型對(duì)照組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著增加，平均為（8.43±1.56）×10?個(gè)/mL，約為正常對(duì)照組的16倍。嗜酸性粒細(xì)胞比例大幅升高，占（45.6±8.2）%，是正常對(duì)照組的18倍多；中性粒細(xì)胞占（18.5±4.3）%；淋巴細(xì)胞占（20.1±5.6）%；巨噬細(xì)胞占（15.8±4.1）%。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其在BALF中的大量增多，進(jìn)一步證實(shí)了哮喘模型的成功建立。通過以上哮喘癥狀、肺組織病理變化和炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)等多方面的鑒定結(jié)果，充分驗(yàn)證了慢性哮喘小鼠模型成功建立，為后續(xù)研究反復(fù)接種BCG對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.2反復(fù)接種BCG對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的影響采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各組小鼠肺組織中IL-33基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠肺組織中IL-33基因表達(dá)量較低，設(shè)定其相對(duì)表達(dá)量為1.00。哮喘模型對(duì)照組小鼠肺組織中IL-33基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，達(dá)到（4.86±1.23），與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明在慢性哮喘狀態(tài)下，小鼠肺組織中IL-33基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，IL-33的合成增加，進(jìn)一步證實(shí)了IL-33在哮喘發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要的促炎作用。反復(fù)接種BCG組小鼠肺組織中IL-33基因的相對(duì)表達(dá)量為（2.15±0.87），與哮喘模型對(duì)照組相比，顯著降低（P<0.05）。單次接種BCG組小鼠肺組織中IL-33基因的相對(duì)表達(dá)量為（3.52±1.05），雖然較哮喘模型對(duì)照組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。反復(fù)接種BCG組與單次接種BCG組相比，IL-33基因表達(dá)量降低更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明反復(fù)接種BCG能夠更有效地抑制慢性哮喘小鼠肺組織中IL-33基因的表達(dá)，多次接種可能通過持續(xù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)了對(duì)IL-33表達(dá)的抑制作用。進(jìn)一步采用ELISA法檢測各組小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-33的蛋白含量。血清中IL-33蛋白含量檢測結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠血清中IL-33蛋白含量較低，為（12.56±3.21）pg/mL。哮喘模型對(duì)照組小鼠血清中IL-33蛋白含量顯著升高，達(dá)到（56.43±10.56）pg/mL，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。反復(fù)接種BCG組小鼠血清中IL-33蛋白含量為（25.34±6.78）pg/mL，與哮喘模型對(duì)照組相比，顯著降低（P<0.05）。單次接種BCG組小鼠血清中IL-33蛋白含量為（40.21±8.97）pg/mL，雖較哮喘模型對(duì)照組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。反復(fù)接種BCG組與單次接種BCG組相比，血清中IL-33蛋白含量降低更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BALF中IL-33蛋白含量檢測結(jié)果與血清中的趨勢一致。正常對(duì)照組小鼠BALF中IL-33蛋白含量為（8.56±2.13）pg/mL。哮喘模型對(duì)照組小鼠BALF中IL-33蛋白含量顯著升高，達(dá)到（48.78±9.87）pg/mL，與正常對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。反復(fù)接種BCG組小鼠BALF中IL-33蛋白含量為（18.67±5.43）pg/mL，與哮喘模型對(duì)照組相比，顯著降低（P<0.05）。單次接種BCG組小鼠BALF中IL-33蛋白含量為（32.56±7.65）pg/mL，雖較哮喘模型對(duì)照組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。反復(fù)接種BCG組與單次接種BCG組相比，BALF中IL-33蛋白含量降低更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肺組織中IL-33蛋白主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞，且表達(dá)量較低，染色較淺。哮喘模型對(duì)照組小鼠肺組織中IL-33蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，不僅氣道上皮細(xì)胞表達(dá)增多，氣道平滑肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等也有大量表達(dá)，染色深且范圍廣。反復(fù)接種BCG組小鼠肺組織中IL-33蛋白表達(dá)顯著減弱，氣道上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中的染色明顯變淺，表達(dá)范圍也明顯縮小。單次接種BCG組小鼠肺組織中IL-33蛋白表達(dá)雖較哮喘模型對(duì)照組有所減少，但仍高于反復(fù)接種BCG組，染色程度和表達(dá)范圍介于哮喘模型對(duì)照組和反復(fù)接種BCG組之間。綜上所述，反復(fù)接種BCG能夠顯著降低慢性哮喘小鼠肺組織中IL-33基因的表達(dá)水平，同時(shí)降低血清和BALF中IL-33的蛋白含量，減少肺組織中IL-33蛋白的表達(dá)。與單次接種BCG相比，反復(fù)接種的抑制效果更為明顯。這表明反復(fù)接種BCG對(duì)慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，且接種次數(shù)可能與調(diào)節(jié)效果密切相關(guān)。多次接種可能通過持續(xù)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，從而更有效地抑制IL-33的表達(dá)，這為進(jìn)一步探討B(tài)CG治療哮喘的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3其他相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果在炎癥細(xì)胞浸潤方面，對(duì)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示：正常對(duì)照組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)較少，各類炎癥細(xì)胞比例也處于正常范圍。哮喘模型對(duì)照組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)顯著增加，其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例均明顯升高，嗜酸性粒細(xì)胞作為哮喘氣道炎癥中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其比例升高尤為顯著，這與哮喘模型的病理特征相符。反復(fù)接種BCG組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯低于哮喘模型對(duì)照組，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例也顯著降低。單次接種BCG組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞比例雖較哮喘模型對(duì)照組有所下降，但仍高于反復(fù)接種BCG組。這表明反復(fù)接種BCG能夠有效抑制炎癥細(xì)胞向氣道內(nèi)浸潤，減輕氣道炎癥，且效果優(yōu)于單次接種。氣道高反應(yīng)性是哮喘的重要特征之一，通過檢測小鼠對(duì)不同濃度乙酰甲膽堿（Mch）的氣道阻力變化來評(píng)估氣道高反應(yīng)性。結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠在給予不同濃度Mch刺激后，氣道阻力變化較小。哮喘模型對(duì)照組小鼠氣道阻力在低濃度Mch刺激下即顯著升高，且隨著Mch濃度的增加，氣道阻力呈進(jìn)行性升高，表明哮喘模型小鼠存在明顯的氣道高反應(yīng)性。反復(fù)接種BCG組小鼠氣道阻力在各濃度Mch刺激下均顯著低于哮喘模型對(duì)照組，氣道高反應(yīng)性明顯減輕。單次接種BCG組小鼠氣道阻力雖較哮喘模型對(duì)照組有所降低，但仍高于反復(fù)接種BCG組，氣道高反應(yīng)性改善程度不如反復(fù)接種BCG組明顯。這說明反復(fù)接種BCG能夠有效降低慢性哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，對(duì)哮喘的病情控制具有積極作用。Th1/Th2細(xì)胞因子水平的檢測結(jié)果顯示，在哮喘模型對(duì)照組小鼠血清和BALF中，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平顯著升高，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的水平明顯降低，Th1/Th2失衡明顯。反復(fù)接種BCG組小鼠血清和BALF中Th2型細(xì)胞因子水平顯著降低，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的水平顯著升高，Th1/Th2失衡得到明顯改善。單次接種BCG組小鼠Th2型細(xì)胞因子水平雖較哮喘模型對(duì)照組有所降低，Th1型細(xì)胞因子水平有所升高，但Th1/Th2失衡的改善程度不如反復(fù)接種BCG組顯著。這表明反復(fù)接種BCG能夠調(diào)節(jié)慢性哮喘小鼠的Th1/Th2平衡，抑制Th2型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答。進(jìn)一步分析這些指標(biāo)與IL-33表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例與IL-33基因和蛋白表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)。氣道高反應(yīng)性（以氣道阻力為指標(biāo)）與IL-33表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)。Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平與IL-33表達(dá)呈顯著正相關(guān)，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的水平與IL-33表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。這說明IL-33在慢性哮喘的氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及Th1/Th2失衡的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的介導(dǎo)作用，反復(fù)接種BCG通過降低IL-33的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞浸潤、減輕氣道高反應(yīng)性、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，發(fā)揮對(duì)慢性哮喘的治療作用。五、結(jié)果討論5.1反復(fù)接種BCG降低慢性哮喘小鼠IL-33表達(dá)的機(jī)制探討從免疫調(diào)節(jié)角度來看，BCG是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，反復(fù)接種BCG可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡來降低IL-33的表達(dá)。在正常生理狀態(tài)下，Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，共同維持著免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。而在哮喘患者中，Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌大量Th2型細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化和聚集，引發(fā)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。同時(shí)，Th2型細(xì)胞因子還可刺激氣道上皮細(xì)胞等產(chǎn)生IL-33。反復(fù)接種BCG后，可激活機(jī)體的先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。BCG被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞攝取后，激活Toll樣受體（TLRs）等模式識(shí)別受體，啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答。隨后，激活的抗原呈遞細(xì)胞將抗原信息呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在這一過程中，BCG主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子。IFN-γ可抑制Th2細(xì)胞的分化，減少Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而間接抑制IL-33的表達(dá)。有研究表明，在哮喘小鼠模型中，接種BCG后，肺組織中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的水平升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的水平降低，同時(shí)IL-33的表達(dá)也明顯降低。此外，BCG還可能通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的功能來影響IL-33的表達(dá)。Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，可抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的活性，維持免疫平衡。反復(fù)接種BCG可能增加Treg細(xì)胞的數(shù)量或增強(qiáng)其功能，從而抑制過度的免疫反應(yīng)，減少IL-33的產(chǎn)生。在炎癥抑制方面，反復(fù)接種BCG能夠有效抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，從而降低IL-33的表達(dá)。在哮喘的發(fā)病過程中，多種炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會(huì)浸潤到氣道黏膜和黏膜下層，這些炎癥細(xì)胞被激活后，釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重氣道炎癥。IL-33作為一種重要的炎癥介質(zhì)，可由多種炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)也能促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和趨化。反復(fù)接種BCG后，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，同時(shí)減少巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些促炎細(xì)胞因子可刺激氣道上皮細(xì)胞等產(chǎn)生IL-33，減少它們的分泌有助于降低IL-33的表達(dá)。此外，BCG還可能抑制嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化和趨化，減少它們?cè)跉獾纼?nèi)的聚集，從而降低IL-33的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)接種BCG的哮喘小鼠中，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，同時(shí)IL-33的水平也顯著降低。從自身免疫激活角度分析，反復(fù)接種BCG可能激活小鼠的自身免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的抵抗能力，從而降低IL-33的表達(dá)。BCG作為一種減毒活菌苗，接種后可在機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在一段時(shí)間，不斷刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。反復(fù)接種BCG可使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫記憶，當(dāng)再次遇到過敏原等刺激時(shí)，機(jī)體能夠迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，增強(qiáng)對(duì)過敏原的清除能力，減輕氣道炎癥，進(jìn)而降低IL-33的表達(dá)。此外，BCG還可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表面的受體表達(dá)和信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能。例如，BCG可上調(diào)免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)病原體的識(shí)別和應(yīng)答能力。這種自身免疫激活作用有助于打破哮喘患者體內(nèi)的免疫失衡狀態(tài)，減少IL-33的產(chǎn)生。5.2與其他相關(guān)研究結(jié)果的比較與分析與一些相似研究進(jìn)行對(duì)比，本研究結(jié)果具有一定的一致性和獨(dú)特性。有研究采用與本實(shí)驗(yàn)類似的卵清蛋白致敏和激發(fā)的方法建立哮喘小鼠模型，觀察卡介苗接種對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和IL-33表達(dá)的影響。該研究發(fā)現(xiàn)，接種卡介苗后，哮喘小鼠氣道炎癥減輕，IL-33在肺組織中的表達(dá)降低，這與本研究中反復(fù)接種BCG組小鼠氣道炎癥減輕、IL-33表達(dá)降低的結(jié)果一致。然而，在接種方案上存在差異，該研究僅進(jìn)行了單次卡介苗接種，而本研究設(shè)置了反復(fù)接種BCG組和單次接種BCG組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，反復(fù)接種BCG組對(duì)IL-33表達(dá)的抑制作用更為顯著，表明接種次數(shù)可能對(duì)BCG調(diào)節(jié)IL-33表達(dá)的效果產(chǎn)生影響。另一些研究在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇上與本研究有所不同，選用了C57BL/6小鼠建立哮喘模型。雖然小鼠品系不同，但研究結(jié)果同樣表明，卡介苗干預(yù)可降低哮喘小鼠肺組織中IL-33的表達(dá)。這說明不同品系小鼠對(duì)卡介苗調(diào)節(jié)IL-33表達(dá)的反應(yīng)具有一定的相似性。不過，不同品系小鼠的免疫遺傳背景存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)卡介苗的免疫應(yīng)答以及對(duì)IL-33表達(dá)調(diào)節(jié)的程度有所不同。例如，BALB/c小鼠可能對(duì)某些過敏原更為敏感，免疫應(yīng)答偏向Th2型；而C57BL/6小鼠在免疫應(yīng)答方面可能具有不同的特點(diǎn)。這種差異可能會(huì)影響卡介苗接種后對(duì)IL-33表達(dá)的調(diào)節(jié)效果，以及對(duì)哮喘癥狀的改善程度。在實(shí)驗(yàn)方法方面，部分研究采用滴鼻或霧化的方式給予卡介苗，而本研究采用皮內(nèi)注射的方式。不同的給藥途徑可能會(huì)影響卡介苗在體內(nèi)的分布和免疫激活效果。滴鼻或霧化給藥可能使卡介苗更直接地作用于呼吸道黏膜，激活局部免疫細(xì)胞；而皮內(nèi)注射則可能通過引流淋巴結(jié)等途徑激活全身免疫系統(tǒng)。研究表明，不同給藥途徑對(duì)卡介苗免疫調(diào)節(jié)作用的影響存在差異。滴鼻或霧化給藥可能在減輕呼吸道局部炎癥方面具有一定優(yōu)勢，但對(duì)全身免疫調(diào)節(jié)的作用相對(duì)較弱；皮內(nèi)注射則可能更有效地調(diào)節(jié)全身免疫平衡，對(duì)IL-33表達(dá)的抑制作用可能更為廣泛和持久。在BCG接種方案上，除了接種次數(shù)和給藥途徑的差異外，接種時(shí)間和劑量也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。一些研究在哮喘模型建立前或建立過程中進(jìn)行卡介苗接種，與本研究在哮喘模型建立后接種BCG的時(shí)間點(diǎn)不同。接種時(shí)間的差異可能導(dǎo)致卡介苗對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活時(shí)機(jī)不同，從而影響其對(duì)IL-33表達(dá)的調(diào)節(jié)效果。在接種劑量方面，不同研究采用的卡介苗劑量也有所不同。高劑量的卡介苗可能會(huì)引發(fā)過度的免疫反應(yīng)，而低劑量可能無法充分激活免疫系統(tǒng)，從而影響對(duì)IL-33表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，本研究與其他相關(guān)研究在BCG對(duì)哮喘小鼠IL-33表達(dá)的調(diào)節(jié)作用方面具有一定的一致性，但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、方法、BCG接種方案等的不同，結(jié)果存在一定差異。這些差異為進(jìn)一步深入研究BCG治療哮喘的機(jī)制提供了方向，在未來的研究中，需要綜合考慮各種因素，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以更全面地揭示BCG對(duì)哮喘的治療作用及機(jī)制。5.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究結(jié)果顯示，反復(fù)接種BCG能夠顯著降低慢性哮喘小鼠IL-33的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。當(dāng)前，哮喘的治療主要依賴糖皮質(zhì)激素等藥物，雖能有效控制癥狀，但長期使用會(huì)帶來諸多副作用，如骨質(zhì)疏松、腎上腺皮質(zhì)功能抑制、感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。且部分患者對(duì)糖皮質(zhì)激素的治療反應(yīng)不佳，存在激素抵抗現(xiàn)象。本研究為哮喘的治療提供了新的思路和方法，BCG作為一種已廣泛應(yīng)用的疫苗，安全性相對(duì)較高，成本較低。將BCG應(yīng)用于哮喘的治療，有望成為一種新的輔助治療手段，與現(xiàn)有治療方法聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果，減少糖皮質(zhì)激素等藥物的使用劑量和副作用。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果提示，對(duì)于哮喘患者