1食品中磷脂酰絲氨酸的測定1范圍本文件描述了食品中磷脂酰絲氨酸含量的測定方法。本文件適用于飲料、糖果(壓片糖果、凝膠糖果)、方便食品、乳制品等食品中磷脂酰絲氨酸含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣中磷脂酰絲氨酸經(jīng)提取凈化后,采用正相液相色譜法分離,用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)測定,外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有說明,所有試劑均為分析純。5.1試劑5.1.1甲醇(CH3OH):色譜純。5.1.2乙腈(CH3CN):色譜純。5.1.3三氯甲烷(CHCl3):色譜純。5.1.4正己烷[CH3(CH2)4CH3]:色譜純。5.1.5異丙醇[(CH3)2CHOH]:色譜純。5.1.6正丙醇(C3H7OH):色譜純。5.1.7三乙胺[(CH3CH2)3N]。5.1.8乙酸(CH3COOH)。5.1.9鹽酸(HCl)。5.1.10磷酸(H3PO4)。5.1.11氯化鈉(NaCl)。25.1.12二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)。5.1.13十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)。5.1.14氫氧化鈉(NaOH)。5.1.15水(H2O):為GB/T6682—2008規(guī)定的一級水。5.2試劑配制5.2.1三氯甲烷-甲醇溶液(90+10):取900mL三氯甲烷(5.1.3)和100mL甲醇,混勻備用。5.2.2甲醇-鹽酸溶液(90+10):取90mL甲醇(5.1.1)和10mL鹽酸(5.1.9),混勻備用。5.2.3乙腈-正丙醇溶液(60+30):取60mL乙腈(5.1.2)和30mL正丙醇(5.1.6),混勻備用。5.2.4異丙醇-甲醇鹽酸溶液(80+20):取80mL異丙醇(5.1.5)和20mL甲醇-鹽酸溶液(5.2.2),混勻備用。5.2.5正己烷-異丙醇-乙酸-三乙胺溶液(820+170+10+0.8):取820mL正己烷(5.1.4)、170mL異丙醇(5.1.5)、10mL乙酸(5.1.8)、0.8mL三乙胺(5.1.7),混勻備用。5.2.6異丙醇-水-乙酸-三乙胺溶液(850+140+10+0.8):取850mL異丙醇(5.1.5)、140mL水、10mL乙酸(5.1.8)、0.8mL三乙胺(5.1.7),混勻備用。5.2.7飽和氯化鈉溶液:稱取100g氯化鈉(5.1.11),加入熱水200mL,超聲混勻,冷卻至形成固液兩相的飽和溶液。5.2.8氫氧化鈉溶液(1mol/L):稱取4.0g氫氧化鈉(5.1.14)于燒杯中攪拌溶解,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用水定容至刻度并混勻。5.2.9磷酸鹽緩沖溶液:稱取27.4g二水合磷酸二氫鈉(5.1.12)及8.80g十二水合磷酸氫二鈉(5.1.13)于1000mL燒杯中,加入800mL水溶解后,用1mol/L氫氧化鈉溶液(5.2.8)調(diào)節(jié)pH至6.0,再轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中,用水定容至刻度并混勻。5.3材料5.3.1氨基固相萃取柱:500mg/6mL,或性能相當(dāng)者。5.3.2濾膜:0.22μm,有機(jī)相。5.4標(biāo)準(zhǔn)品磷脂酰絲氨酸(C42H82NO10P,CAS號:51446-62-9):純度≥97%,或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)樣品/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)樣品/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.5標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.5.1磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10mg/mL):準(zhǔn)確稱取磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100.0mg(精確至0.0001g),用適量三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)溶解,移入10mL容量瓶中,并用三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)定容至刻度,混勻。-20℃下冷凍保存,有效期為1個月。5.5.2磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(1mg/mL):準(zhǔn)確移取磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5.5.1)1mL至10mL容量瓶中,用三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)定容至刻度。臨用現(xiàn)配。5.5.3磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別吸取磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(5.5.2)0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL至10mL容量瓶,用三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)定容至刻度,混勻。磷脂酰絲氨酸臨用現(xiàn)配。36儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜儀:配備蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)。6.2分析天平:精確度0.001g和0.0001g。6.3超聲波清洗儀:溫度范圍10℃~80℃。6.4渦旋混合器:最高轉(zhuǎn)速不低于500r/min。6.5離心機(jī):最高轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.6搗碎機(jī)。7分析步驟7.1試樣的制備固體試樣主要分為:—塊狀試樣(壓片糖果、方便食品等):取代表試樣用搗碎機(jī)搗至粉末狀,樣品袋密封,冷藏備用;—粉末試樣(乳粉、飲料等):取代表試樣混勻,樣品袋密封,冷藏備用;—凝膠糖果:取代表性樣品,于-20℃冰箱冷凍至堅硬后用搗碎機(jī)搗碎,樣品袋密封,冷藏備用;—軟膠囊型凝膠糖果:取代表性樣品,去除外軟膠囊,內(nèi)容物混勻,樣品袋密封,冷藏備用。7.1.2液體試樣取代表性液體試樣混勻,樣品袋密封,冷藏備用。7.2試樣的提取7.2.1飲料、壓片糖果、軟膠囊型凝膠糖果、方便食品等稱取0.1g~1.0g試樣(精確至0.001g)于50mL離心管中,加入10mL三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1),用渦旋混合器渦旋分散試樣,用超聲波清洗儀室溫超聲10min,于10000r/min離心2min,上清液過0.22μm有機(jī)相濾膜,濾液待上機(jī)測定。7.2.2凝膠糖果取1.0g試樣(精確至0.001g)于50mL離心管中,加入10mL磷酸鹽緩沖溶液(5.2.9),用渦旋混合器渦旋振蕩分散試樣,加入10mL三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)渦旋2min,用超聲波清洗儀室溫超聲10min,10000r/min離心2min,若離心后三氯甲烷層出現(xiàn)乳化,三氯甲烷層轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中,加入10mL飽和氯化鈉溶液(5.2.7),渦旋2min,于10000r/min離心2min,取下層的三氯甲烷層過0.22μm有機(jī)相濾膜,濾液待上機(jī)測定。7.2.3乳制品稱取1.0g試樣(精確至0.001g)于50mL離心管中,加入2mL水,用渦旋混合器渦旋分散試樣,加入9mL甲醇(5.1.1),渦旋混勻1min,加入10mL三氯甲烷(5.1.3),渦旋混勻1min,于10000r/min離心2min,上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管,加入10mL飽和氯化鈉溶液(5.2.7),渦旋2min,于10000r/min離心2min,去除上層水相,保留下層三氯甲烷層,待凈化。47.3凈化氨基固相萃取柱用5mL正己烷(5.1.4)活化后,取5mL待凈化溶液(7.2.3)過柱,依次用5mL三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)、5mL乙腈-正丙醇溶液(5.2.3)、5mL甲醇(5.1.1)淋洗。加入6mL異丙醇-甲醇鹽酸溶液(5.2.4)洗脫,收集洗脫液,于45℃水浴氮吹揮去溶劑。用1mL~5mL三氯甲烷-甲醇溶液(5.2.1)復(fù)溶,過0.22μm有機(jī)相濾膜,濾液待上機(jī)測定。7.4色譜測定7.4.1參考色譜條件參考色譜條件如下:a)色譜柱:Diol二醇基柱(4.6mm×250mm,5μm),或具有同等性能的色譜柱;b)柱溫:45℃;c)進(jìn)樣體積:20μL;d)流速:1.0mL/min;e)流動相A:正己烷-異丙醇-乙酸-三乙胺溶液(5.2.5);f)流動相B:異丙醇-水-乙酸-三乙胺溶液(5.2.6);g)載氣壓力:4.5bar(4.5×105Pa);h)氣體流量:2.0L/min;i)漂移管溫度:80℃;j)霧化室溫度:80℃;k)洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序時間min流動相A%流動相B%0955860401740600100200100955229557.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(5.5.3)按儀器參考條件進(jìn)行測定,得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的色譜峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo),繪制對數(shù)工作曲線。7.4.3試樣測定將待測樣液注入液相色譜儀中,得到待測溶液中磷脂酰絲氨酸的峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到測定液中磷脂酰絲氨酸的質(zhì)量濃度。待測樣液中磷脂酰絲氨酸的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi),超過線5性范圍則應(yīng)稀釋上機(jī)溶液,或調(diào)整取樣量重新按樣品分析步驟處理后再進(jìn)樣分析。磷脂酰絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖及試樣色譜圖見附錄A。7.4.4空白試驗(yàn)除不加試樣外,按上述測定步驟進(jìn)行。8結(jié)果計算與表示試樣中磷脂酰絲氨酸的含量按公式(1)計算。)式中:X—試樣中磷脂酰絲氨酸的含量,單位為毫克每一百克(mg/100g);CC0VmF—試樣測定液中磷脂酰絲氨酸的質(zhì)量濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得空白試樣進(jìn)樣溶液中磷脂酰絲氨酸的質(zhì)量濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);—定容體積,單位為毫升(mL);—樣品稱樣量,單位為克(g);—試樣稀釋的倍數(shù);100、1000—換算系數(shù);結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度9.1重復(fù)性在重復(fù)性條件下,獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均