雙光子熒光材料：從精細(xì)表征到生物成像的創(chuàng)新應(yīng)用一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，熒光成像技術(shù)已成為一種不可或缺的重要工具，能夠?yàn)樯镞^程的可視化研究提供關(guān)鍵支持。傳統(tǒng)的單光子熒光成像技術(shù)，利用熒光分子吸收一個(gè)光子后發(fā)射熒光的原理，在早期的生物研究中發(fā)揮了重要作用，為科研人員提供了大量細(xì)胞和組織層面的信息，推動了生物學(xué)的初步發(fā)展。但隨著研究的不斷深入，其局限性也逐漸凸顯。單光子熒光成像使用短波長激發(fā)光，在生物組織中容易受到散射和吸收的影響，導(dǎo)致穿透深度有限，難以對深層組織進(jìn)行清晰成像；光毒性和光漂白問題較為嚴(yán)重，長時(shí)間的光照會對生物樣本造成損傷，影響樣本的生理活性，同時(shí)也會降低熒光信號的強(qiáng)度，限制了對活細(xì)胞和活體組織的長時(shí)間觀察。雙光子熒光材料的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了新的思路和方法。雙光子熒光現(xiàn)象基于雙光子吸收原理，即熒光分子在強(qiáng)激光激發(fā)下，同時(shí)吸收兩個(gè)光子，通過一個(gè)虛中間態(tài)躍遷至高能態(tài)，隨后發(fā)射出熒光。與單光子熒光相比，雙光子熒光具有諸多顯著優(yōu)勢。其激發(fā)光波長通常位于近紅外區(qū)域，該區(qū)域的光在生物組織中散射和吸收較小，具有更好的穿透性，能夠深入組織內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)對深層組織的成像。雙光子吸收過程具有高度的空間選擇性，只有在焦點(diǎn)處的熒光分子才能被激發(fā)，大大降低了光漂白和光毒性，為長時(shí)間觀察活細(xì)胞和活體組織提供了可能；由于激發(fā)光波長較長，還能有效避免生物樣本中自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾，提高了成像的信噪比和分辨率。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雙光子熒光材料的應(yīng)用為疾病的診斷和治療帶來了新的突破。在癌癥診斷方面，通過將雙光子熒光探針特異性地標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞上，利用其高分辨率和深層組織穿透能力，可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤的早期檢測和精確定位，為癌癥的早期治療提供依據(jù)；在神經(jīng)科學(xué)研究中，雙光子熒光成像技術(shù)能夠?qū)铙w大腦中的神經(jīng)元活動進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，有助于深入理解神經(jīng)信號的傳遞和處理機(jī)制，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療提供重要的理論支持；在藥物研發(fā)過程中，雙光子熒光材料可以用于跟蹤藥物在體內(nèi)的分布和代謝過程，評估藥物的療效和毒性，加速藥物研發(fā)的進(jìn)程。雙光子熒光材料在生物成像領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)樯镝t(yī)學(xué)研究提供更加深入、準(zhǔn)確的信息，推動相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展和進(jìn)步。對雙光子熒光材料的表征和生物成像應(yīng)用的研究具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有望為解決生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題提供新的方法和手段。1.2雙光子熒光材料概述1.2.1基本原理雙光子熒光現(xiàn)象基于雙光子吸收過程，這一理論最早由Goeppert-Mayer于1931年從理論上提出，直到1961年才由Kaiser等通過實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。在傳統(tǒng)的單光子激發(fā)過程中，熒光分子在低光子密度的激發(fā)光作用下，吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后通過輻射躍遷發(fā)射出一個(gè)熒光光子回到基態(tài)，其吸收和發(fā)射過程遵循Stark-Einstein定律，激發(fā)光波長通常較短，處于紫外或可見光區(qū)域。而雙光子激發(fā)過程則截然不同，當(dāng)熒光分子處于高光子密度的強(qiáng)激光場中時(shí)，分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)光子，通過一個(gè)虛中間態(tài)，直接躍遷至高能態(tài)。這兩個(gè)光子的能量可以相同（簡并吸收，即\omega_1=\omega_2），也可以不同（非簡并吸收，即\omega_1\neq\omega_2）。例如，對于某些熒光分子，在單光子激發(fā)時(shí)，可能需要350nm的紫外光激發(fā)才能產(chǎn)生450nm的熒光；而在雙光子激發(fā)下，可使用光損傷較小的700nm近紅外光同時(shí)被分子吸收，實(shí)現(xiàn)相同的激發(fā)效果，最終發(fā)射出450nm的熒光。雙光子吸收過程具有高度的非線性特性，其誘導(dǎo)的電子躍遷幾率與入射光強(qiáng)度的平方（I^2）成正比。這意味著只有當(dāng)入射激光的峰值功率密度（光強(qiáng)）達(dá)到一定閾值時(shí)，才會發(fā)生雙光子吸收現(xiàn)象。在激光束緊聚焦條件下，焦點(diǎn)處的光子密度極高，雙光子吸收效應(yīng)主要局限于材料內(nèi)部相當(dāng)于入射波長立方（\lambda^3）的微小區(qū)域內(nèi)。而在焦點(diǎn)以外的地方，入射光的峰值功率密度可控制在激發(fā)閾值以下，幾乎不會發(fā)生雙光子吸收，從而實(shí)現(xiàn)了雙光子吸收效應(yīng)的高度空間選擇性，這一特性在生物成像中具有重要意義，能夠有效減少對非觀測區(qū)域的干擾和損傷。此外，雙光子吸收與單光子吸收的量子選擇定則也存在差異。對于具有中心對稱結(jié)構(gòu)的分子，其電子態(tài)具有明確的宇稱，分別標(biāo)記為g（gerade，對稱）或u（ungerade，反對稱）。單光子吸收的選擇定則為g-u或u-g，即分子在吸收一個(gè)光子時(shí)，宇稱發(fā)生改變；而雙光子吸收的選擇定則是g-g或u-u，分子在同時(shí)吸收兩個(gè)光子的過程中，宇稱奇偶性保持不變。這種量子選擇定則的不同，使得雙光子吸收能夠探測到一些單光子吸收無法觸及的分子態(tài)和躍遷過程，為材料的光學(xué)性質(zhì)研究和應(yīng)用提供了獨(dú)特的視角。1.2.2材料特點(diǎn)雙光子熒光材料之所以在生物成像等領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，源于其一系列特殊的材料特性。穿透性強(qiáng)：雙光子熒光材料的激發(fā)光波長通常位于近紅外區(qū)域（600-900nm），相較于單光子熒光成像中常用的紫外或短波長可見光激發(fā)光，近紅外光在生物組織中的散射和吸收明顯減小。根據(jù)Rayleigh散射理論，散射系數(shù)與光波長的四次方成反比，因此長波長的近紅外光受散射影響較小，能夠更順利地穿透生物組織。例如，在對活體小鼠的腦部成像研究中，單光子激發(fā)光由于散射和吸收的限制，往往只能對大腦表層的細(xì)胞進(jìn)行成像，而雙光子熒光成像利用近紅外激發(fā)光，能夠深入大腦內(nèi)部，對深層的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和活動進(jìn)行清晰觀測，成像深度可達(dá)幾百微米甚至更深，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了有力的工具。光損傷小：雙光子吸收過程的高度空間選擇性決定了只有在焦點(diǎn)處的熒光分子才會被激發(fā)，而焦點(diǎn)以外的區(qū)域幾乎不受影響。這使得雙光子熒光成像在長時(shí)間觀察活細(xì)胞和活體組織時(shí)，能夠大大降低光漂白和光毒性對樣本的損傷。光漂白是指熒光分子在多次激發(fā)后，由于結(jié)構(gòu)破壞而失去熒光發(fā)射能力的現(xiàn)象；光毒性則是激發(fā)光對生物樣本的生理活性產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。在單光子熒光成像中，由于整個(gè)照明區(qū)域的熒光分子都會被激發(fā)，光漂白和光毒性問題較為嚴(yán)重，限制了觀察時(shí)間和樣本的存活狀態(tài)。而雙光子熒光成像中，只有極小區(qū)域的熒光分子被激發(fā)，大大減少了非觀測區(qū)域熒光染料的破壞和細(xì)胞的損傷，例如在對活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的動態(tài)觀察中，雙光子熒光成像可以實(shí)現(xiàn)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天的連續(xù)觀測，而細(xì)胞的生理功能基本不受影響，為研究細(xì)胞的長期生理過程提供了可能。背景干擾低：生物樣本中存在許多自發(fā)熒光物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等，它們在短波長激發(fā)光的作用下會產(chǎn)生自發(fā)熒光，這些自發(fā)熒光會對熒光成像的背景造成干擾，降低成像的信噪比和分辨率。雙光子熒光材料使用長波長的近紅外光作為激發(fā)光，能夠有效避免激發(fā)這些自發(fā)熒光物質(zhì)，從而顯著降低背景熒光的干擾。以對生物組織中的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記成像為例，在單光子激發(fā)下，自發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生的背景熒光會掩蓋目標(biāo)蛋白質(zhì)的熒光信號，使得成像結(jié)果難以準(zhǔn)確分析；而在雙光子激發(fā)下，由于近紅外光不會激發(fā)自發(fā)熒光物質(zhì)，目標(biāo)蛋白質(zhì)的熒光信號能夠清晰地顯現(xiàn)出來，提高了成像的質(zhì)量和準(zhǔn)確性，有助于更精確地研究生物分子的分布和相互作用。1.3研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢近年來，雙光子熒光材料在材料合成、表征方法以及生物成像應(yīng)用等方面都取得了顯著的研究進(jìn)展，展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。在材料合成方面，科研人員致力于開發(fā)新型雙光子熒光材料，以滿足不同應(yīng)用場景的需求。有機(jī)小分子雙光子熒光材料由于其結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、合成方法多樣，成為研究的熱點(diǎn)之一。通過對分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，如引入不同的電子給體和受體基團(tuán)，改變共軛體系的長度和結(jié)構(gòu)，可以有效地調(diào)節(jié)材料的雙光子吸收截面和熒光發(fā)射性能。例如，一些基于花菁類、羅丹明類和香豆素類等有機(jī)小分子的雙光子熒光材料被成功合成，它們在近紅外區(qū)域表現(xiàn)出良好的雙光子吸收特性，為生物成像提供了更豐富的選擇。金屬配合物雙光子熒光材料也受到了廣泛關(guān)注，這類材料通常具有較高的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性。例如，銥(III)配合物由于其獨(dú)特的金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移特性，在雙光子熒光成像中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)特定細(xì)胞器的高分辨率成像。此外，納米材料與雙光子熒光的結(jié)合也為材料合成開辟了新的方向，如量子點(diǎn)、碳點(diǎn)和金屬納米簇等納米材料，不僅具有良好的生物相容性，還能通過表面修飾實(shí)現(xiàn)對雙光子熒光性能的調(diào)控，為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的平臺。在表征方法上，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，一系列先進(jìn)的表征技術(shù)被應(yīng)用于雙光子熒光材料的研究。飛秒瞬態(tài)吸收光譜技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測雙光子激發(fā)過程中材料的電子動力學(xué)行為，深入了解雙光子吸收和熒光發(fā)射的微觀機(jī)制。通過該技術(shù)，可以精確測量激發(fā)態(tài)的壽命、能級結(jié)構(gòu)以及電荷轉(zhuǎn)移過程，為材料的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供重要的理論依據(jù)。非線性光學(xué)顯微鏡技術(shù)，如雙光子熒光顯微鏡和二次諧波顯微鏡，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對材料微觀結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)的原位成像，還能提供高分辨率的三維成像信息。在生物成像應(yīng)用中，這些顯微鏡技術(shù)可以直觀地觀察雙光子熒光材料在生物組織中的分布和行為，評估其成像效果和生物安全性。此外，理論計(jì)算方法，如密度泛函理論（DFT）和含時(shí)密度泛函理論（TD-DFT），也成為研究雙光子熒光材料的重要手段。通過理論計(jì)算，可以預(yù)測材料的雙光子吸收截面、熒光發(fā)射波長和分子軌道分布等性質(zhì)，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)合成，加速新型雙光子熒光材料的研發(fā)進(jìn)程。在生物成像應(yīng)用領(lǐng)域，雙光子熒光材料已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像、組織成像和活體成像等多個(gè)方面。在細(xì)胞成像中，雙光子熒光探針能夠特異性地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的各種生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂質(zhì)等，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。例如，通過設(shè)計(jì)對特定離子具有選擇性響應(yīng)的雙光子熒光探針，可以精確檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鋅離子等金屬離子的濃度變化，研究其在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的作用。在組織成像方面，雙光子熒光成像技術(shù)能夠深入組織內(nèi)部，獲取高分辨率的組織結(jié)構(gòu)和功能信息。在對大腦組織的成像研究中，雙光子熒光顯微鏡可以清晰地觀察神經(jīng)元的形態(tài)和連接方式，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了重要的技術(shù)支持。在活體成像中，雙光子熒光材料可以用于追蹤藥物在體內(nèi)的分布和代謝過程，評估藥物的療效和毒性。通過將雙光子熒光探針與藥物載體相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對藥物載體的靶向輸送和釋放過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測，為藥物研發(fā)和臨床治療提供更準(zhǔn)確的信息。展望未來，雙光子熒光材料的研究有望在以下幾個(gè)方向取得進(jìn)一步突破。一是開發(fā)具有更高雙光子吸收截面和熒光量子產(chǎn)率的材料，以提高成像的靈敏度和分辨率，滿足對生物樣本更精細(xì)觀測的需求；二是拓展雙光子熒光材料的應(yīng)用范圍，如在疾病早期診斷、生物分子傳感和光動力治療等領(lǐng)域的應(yīng)用，為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床治療提供更多的解決方案；三是加強(qiáng)多學(xué)科交叉融合，結(jié)合納米技術(shù)、生物技術(shù)和信息技術(shù)等，發(fā)展新型的雙光子熒光成像技術(shù)和系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對生物樣本的多模態(tài)、實(shí)時(shí)、動態(tài)成像；四是深入研究雙光子熒光材料與生物體系的相互作用機(jī)制，評估其生物安全性，為其臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。二、雙光子熒光材料的表征方法2.1光學(xué)性能表征2.1.1熒光光譜分析熒光光譜分析是研究雙光子熒光材料光學(xué)性能的基礎(chǔ)手段，主要包括熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的測量。熒光激發(fā)光譜反映了熒光材料在不同波長激發(fā)光作用下產(chǎn)生熒光的能力，其測量原理是固定熒光發(fā)射波長，掃描激發(fā)光的波長，記錄不同激發(fā)波長下的熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長變化的曲線。例如，在研究一種新型有機(jī)雙光子熒光染料時(shí)，通過調(diào)節(jié)激發(fā)光源的波長，從400nm到800nm進(jìn)行掃描，在固定的550nm發(fā)射波長處檢測熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)激發(fā)波長為650nm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，表明該染料在650nm波長的激發(fā)光下具有最佳的激發(fā)效率。熒光發(fā)射光譜則展示了熒光材料在特定激發(fā)波長下發(fā)射熒光的波長分布情況。測量時(shí)，固定激發(fā)光波長，掃描熒光發(fā)射的波長，獲取熒光強(qiáng)度隨發(fā)射波長的變化關(guān)系。繼續(xù)以上述有機(jī)雙光子熒光染料為例，當(dāng)用650nm的激發(fā)光照射時(shí)，掃描發(fā)射波長從500nm到700nm，得到的發(fā)射光譜顯示在580nm處有一個(gè)明顯的熒光發(fā)射峰，說明該染料在650nm激發(fā)下主要發(fā)射580nm的熒光。熒光光譜分析在雙光子熒光材料特性分析中具有重要作用。通過激發(fā)光譜，可以確定材料的最佳激發(fā)波長，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用提供準(zhǔn)確的激發(fā)條件，有助于提高熒光信號的強(qiáng)度和檢測的靈敏度；發(fā)射光譜則能提供關(guān)于材料熒光發(fā)射特性的信息，如發(fā)射波長范圍、發(fā)射峰的位置和形狀等，這些信息對于判斷材料是否適用于特定的生物成像應(yīng)用至關(guān)重要。不同的生物組織和細(xì)胞在不同波長下具有不同的光學(xué)特性，選擇發(fā)射波長與生物樣本背景熒光干擾小的雙光子熒光材料，能夠提高成像的信噪比和分辨率。2.1.2量子產(chǎn)率測定量子產(chǎn)率是衡量雙光子熒光材料發(fā)光效率的關(guān)鍵參數(shù)，其定義為熒光發(fā)射的光子數(shù)與吸收的光子數(shù)之比，反映了材料將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射的能力，量子產(chǎn)率越高，表明材料的發(fā)光效率越高。測量量子產(chǎn)率的方法主要有參比法和絕對法。參比法是在相同的激發(fā)條件下，將待測樣品的熒光強(qiáng)度與已知量子產(chǎn)率的參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，通過特定公式計(jì)算待測樣品的量子產(chǎn)率。具體來說，首先需要選擇一種合適的參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其量子產(chǎn)率應(yīng)具有準(zhǔn)確的已知值，且在激發(fā)和發(fā)射波長范圍上與待測樣品相近。例如，常用的硫酸奎寧在0.1mol/L硫酸溶液中的量子產(chǎn)率為0.546，可作為參比標(biāo)準(zhǔn)用于測量其他熒光材料的量子產(chǎn)率。在實(shí)驗(yàn)中，分別配制待測樣品和參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀溶液，確保溶液的吸光度在合適范圍內(nèi)（一般要求吸光度低于0.05，以減少內(nèi)濾效應(yīng)的影響）。使用相同的激發(fā)光源和檢測條件，測量兩者的積分熒光強(qiáng)度（即校正熒光光譜所包括的面積）以及對相同激發(fā)波長的入射光的吸光度，代入公式Y(jié)_{u}=Y_{s}\cdot\frac{F_{u}}{F_{s}}\cdot\frac{A_{s}}{A_{u}}進(jìn)行計(jì)算，其中Y_{u}、Y_{s}分別為待測物質(zhì)和參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)_{u}、F_{s}為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度，A_{u}、A_{s}為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)在該激發(fā)波長的入射光的吸光度。絕對法通常采用積分球來直接測量量子產(chǎn)率。積分球是一種內(nèi)壁涂有高反射率材料的空心球體，能夠?qū)悠钒l(fā)射的熒光均勻收集并進(jìn)行檢測。樣品放置在積分球內(nèi)，激發(fā)光照射樣品后，發(fā)射的熒光在積分球內(nèi)多次反射，最終被探測器收集。通過測量激發(fā)光的功率和樣品發(fā)射的熒光功率，結(jié)合相關(guān)的光學(xué)原理和計(jì)算公式，可直接得到量子產(chǎn)率。絕對法測量量子產(chǎn)率不受參比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的限制，適用于各種類型的熒光材料，但實(shí)驗(yàn)裝置較為復(fù)雜，對儀器的精度和穩(wěn)定性要求較高。量子產(chǎn)率的準(zhǔn)確測定對于評估雙光子熒光材料的發(fā)光效率具有重要意義。在生物成像應(yīng)用中，高量子產(chǎn)率的雙光子熒光材料能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號，提高成像的靈敏度和清晰度，有助于檢測和觀察生物樣本中微量的目標(biāo)物質(zhì)或生物過程；在材料研發(fā)過程中，量子產(chǎn)率是評估材料性能優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，通過優(yōu)化材料的分子結(jié)構(gòu)和合成條件，提高量子產(chǎn)率，能夠不斷改進(jìn)材料的發(fā)光性能，滿足不同應(yīng)用場景的需求。2.1.3雙光子吸收截面測定雙光子吸收截面是描述雙光子熒光材料雙光子吸收能力的重要物理量，它表示單個(gè)分子在單位光強(qiáng)下同時(shí)吸收兩個(gè)光子的概率，單位通常為GM（1GM=10???cm??s/photon）。雙光子吸收截面越大，說明材料的雙光子吸收能力越強(qiáng)，在相同的激發(fā)條件下，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的雙光子熒光信號。常用的測量雙光子吸收截面的技術(shù)有非線性透過率法、Z-掃描方法、雙光子誘導(dǎo)熒光法（上轉(zhuǎn)換熒光法）和雙光子瞬態(tài)吸收光譜法等。非線性透過率法通過改變?nèi)肷涔鈴?qiáng)，測量樣品的非線性透過率，根據(jù)非線性透過率與入射光強(qiáng)的關(guān)系，擬合得到雙光子吸收系數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出雙光子吸收截面。該方法實(shí)驗(yàn)裝置相對簡單，測量方便，但當(dāng)待測介質(zhì)濃度較高時(shí)，線性吸收較大，會影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性；在入射光強(qiáng)度很高時(shí)，其他機(jī)制的吸收可能對非線性吸收過程產(chǎn)生貢獻(xiàn)，導(dǎo)致測量誤差。Z-掃描方法則是基于單光束測量，通過將樣品沿光軸方向進(jìn)行掃描，測量透過樣品的光強(qiáng)變化，從而得到樣品的非線性光學(xué)特性，包括雙光子吸收截面。該方法靈敏度高，但缺點(diǎn)與非線性透過率法類似，在實(shí)際測量中也容易受到線性吸收和其他非線性效應(yīng)的干擾。雙光子誘導(dǎo)熒光法（上轉(zhuǎn)換熒光法）利用雙光子吸收后材料會發(fā)射熒光的特性，通過測量介質(zhì)的雙光子誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度，結(jié)合已知雙光子吸收截面的標(biāo)準(zhǔn)樣品，來計(jì)算待測樣品的雙光子吸收截面。對于很多有機(jī)染料分子，雙光子吸收后將伴隨著熒光輻射過程，其熒光發(fā)射波長比激發(fā)光的波長短，并且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度之間的依賴關(guān)系為平方關(guān)系。該方法可以有效排除其他非線性效應(yīng)所產(chǎn)生的影響，準(zhǔn)確地測量介質(zhì)真實(shí)的雙光子吸收截面，入射光強(qiáng)和溶液濃度比非線性透過率法分別低1和3個(gè)數(shù)量級，相對于雙光子吸收來說，其他非線性效應(yīng)的貢獻(xiàn)被大大減小；利用單色儀可以把雙光子誘導(dǎo)熒光和其他非線性產(chǎn)生的效應(yīng)區(qū)分開來。但該方法需要首先測出樣品的熒光量子效率，準(zhǔn)確度很大程度上依賴于所選擇標(biāo)準(zhǔn)樣品，對實(shí)驗(yàn)光學(xué)裝置要求較高，尤其對熒光收集系統(tǒng)，必須保證兩次測量熒光時(shí)的熒光收集效率相同，且難以測出非熒光材料的雙光子吸收截面。雙光子瞬態(tài)吸收光譜法由激發(fā)態(tài)泵浦-探測瞬態(tài)吸收光譜法發(fā)展而來，是唯一能精確測出非熒光材料雙光子吸收截面的方法。它能將直接的雙光子吸收和通過中間實(shí)能級實(shí)現(xiàn)的連續(xù)分布吸收區(qū)分開來，也是通過比較待測樣品和已知雙光子吸收截面的標(biāo)準(zhǔn)樣品來求得待測樣品的雙光子吸收截面。雙光子吸收截面的測定在雙光子熒光材料性能評估中起著關(guān)鍵作用。在生物成像應(yīng)用中，材料的雙光子吸收截面決定了其在一定激發(fā)光強(qiáng)度下產(chǎn)生雙光子熒光的效率，較大的雙光子吸收截面意味著在較低的激發(fā)光強(qiáng)度下就能獲得足夠強(qiáng)的熒光信號，從而降低對生物樣本的光損傷，提高成像的質(zhì)量和安全性；在材料設(shè)計(jì)和優(yōu)化過程中，雙光子吸收截面是評估材料性能的重要指標(biāo)，通過理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)測量相結(jié)合，深入研究分子結(jié)構(gòu)與雙光子吸收截面之間的關(guān)系，能夠指導(dǎo)新型雙光子熒光材料的合成，開發(fā)出具有更優(yōu)異性能的材料。2.2結(jié)構(gòu)與形貌表征2.2.1光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)在雙光子熒光材料的結(jié)構(gòu)研究中扮演著重要角色，其中紅外光譜和拉曼光譜是常用的兩種手段，它們從不同角度揭示材料的分子結(jié)構(gòu)信息。紅外光譜的原理基于分子振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷。當(dāng)紅外光照射到分子上時(shí)，分子中的化學(xué)鍵會發(fā)生振動和轉(zhuǎn)動，只有當(dāng)紅外光的頻率與分子振動或轉(zhuǎn)動的固有頻率相等時(shí)，分子才能吸收紅外光，產(chǎn)生紅外吸收光譜。不同的化學(xué)鍵具有不同的振動頻率，因此紅外光譜中的吸收峰位置和強(qiáng)度可以反映分子中化學(xué)鍵的類型和環(huán)境。例如，在有機(jī)雙光子熒光材料中，羰基（C=O）的伸縮振動通常在1650-1850cm?1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，通過檢測該吸收峰的位置和強(qiáng)度，可以判斷材料中是否存在羰基以及羰基的化學(xué)環(huán)境。在研究一種新型含羰基的雙光子熒光染料時(shí)，通過紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在1720cm?1處有明顯的吸收峰，表明該染料分子中存在羰基，且其所處化學(xué)環(huán)境與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。紅外光譜在雙光子熒光材料結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用十分廣泛，可用于確定材料的分子骨架、官能團(tuán)的種類和數(shù)量，以及判斷分子間的相互作用等。通過分析紅外光譜中吸收峰的變化，可以研究材料在合成過程中的反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測官能團(tuán)的引入或消除，為材料的合成和優(yōu)化提供重要依據(jù)。拉曼光譜則是基于光的非彈性散射效應(yīng)，即拉曼散射。當(dāng)光照射到物質(zhì)上時(shí)，大部分光會發(fā)生彈性散射（瑞利散射），散射光的頻率與入射光相同；而一小部分光會發(fā)生非彈性散射，散射光的頻率與入射光不同，這種頻率的變化與分子的振動和轉(zhuǎn)動能級有關(guān)。拉曼散射光的頻率位移（拉曼位移）只取決于分子的振動和轉(zhuǎn)動模式，與入射光的頻率無關(guān)。在雙光子熒光材料中，不同的化學(xué)鍵和基團(tuán)具有特定的拉曼位移，例如碳-碳雙鍵（C=C）的拉曼位移通常在1600-1680cm?1左右。通過測量拉曼光譜，可以獲得分子結(jié)構(gòu)的信息，包括化學(xué)鍵的類型、分子的對稱性以及分子內(nèi)原子的相對位置等。拉曼光譜對于研究具有對稱結(jié)構(gòu)的分子特別有效，因?yàn)檫@些分子在紅外光譜中可能由于對稱性而沒有明顯的吸收峰，但在拉曼光譜中會有特征的散射峰。與紅外光譜相比，拉曼光譜具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢，如對水的散射較弱，適用于水溶液中樣品的分析；可以提供分子骨架的信息，對于研究復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)更為有利。在研究一種水溶性雙光子熒光材料時(shí)，利用拉曼光譜可以在水溶液環(huán)境下準(zhǔn)確分析其分子結(jié)構(gòu)，避免了水對紅外光譜分析的干擾。紅外光譜和拉曼光譜相互補(bǔ)充，為雙光子熒光材料的結(jié)構(gòu)分析提供了全面而準(zhǔn)確的信息。在實(shí)際研究中，通常會結(jié)合這兩種光譜技術(shù)，對材料進(jìn)行深入分析，以更全面地了解材料的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，為材料的設(shè)計(jì)、合成和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。2.2.2顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù)是觀察雙光子熒光材料微觀結(jié)構(gòu)和形貌的重要手段，其中掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）在材料表征中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們各自具有獨(dú)特的原理和應(yīng)用特點(diǎn)。掃描電子顯微鏡利用電子束掃描樣品表面，通過檢測二次電子、背散射電子等信號來獲取樣品表面的形貌信息。當(dāng)高能電子束與樣品表面相互作用時(shí)，會激發(fā)出樣品表面的二次電子，這些二次電子的發(fā)射強(qiáng)度與樣品表面的形貌密切相關(guān)。樣品表面的凸起部位會發(fā)射出更多的二次電子，在SEM圖像中呈現(xiàn)出較亮的區(qū)域；而凹陷部位發(fā)射的二次電子較少，圖像中則表現(xiàn)為較暗的區(qū)域。通過逐點(diǎn)掃描樣品表面，并收集和處理二次電子信號，就可以構(gòu)建出樣品表面的三維形貌圖像。在觀察雙光子熒光材料的納米顆粒時(shí)，SEM可以清晰地展示納米顆粒的形狀、大小分布和團(tuán)聚情況。例如，對于一種合成的雙光子熒光量子點(diǎn)，通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)其呈球形，粒徑分布較為均勻，平均粒徑約為20nm，且無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，這為評估量子點(diǎn)的質(zhì)量和性能提供了直觀的依據(jù)。SEM還可用于觀察材料的表面粗糙度、孔隙結(jié)構(gòu)等信息，對于研究材料的表面性質(zhì)和應(yīng)用性能具有重要意義。透射電子顯微鏡則是利用電子束穿透樣品，通過檢測透過樣品的電子束來獲取樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。電子束在穿透樣品時(shí)，會與樣品中的原子相互作用，發(fā)生散射和吸收。樣品中不同區(qū)域的原子密度和厚度不同，對電子束的散射程度也不同，從而在透射電子圖像中形成不同的襯度。原子密度高或厚度大的區(qū)域?qū)﹄娮邮⑸漭^強(qiáng)，在圖像中呈現(xiàn)為較暗的區(qū)域；而原子密度低或厚度小的區(qū)域?qū)﹄娮邮⑸漭^弱，圖像中則表現(xiàn)為較亮的區(qū)域。TEM具有極高的分辨率，能夠觀察到材料的原子結(jié)構(gòu)和晶體缺陷等微觀細(xì)節(jié)。在研究雙光子熒光材料的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，TEM可以通過電子衍射和高分辨成像技術(shù)，確定材料的晶體結(jié)構(gòu)類型、晶格參數(shù)以及晶體缺陷的類型和分布。例如，對于一種具有特殊晶體結(jié)構(gòu)的雙光子熒光金屬配合物，利用TEM的電子衍射分析，確定了其晶體結(jié)構(gòu)屬于正交晶系，并通過高分辨成像觀察到了晶體中的位錯和層錯等缺陷，這些信息對于深入理解材料的性能和優(yōu)化材料的合成工藝具有重要價(jià)值。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡在雙光子熒光材料的微觀結(jié)構(gòu)和形貌表征中相輔相成。SEM提供了材料表面的宏觀形貌信息，而TEM則深入揭示了材料內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。通過綜合運(yùn)用這兩種顯微鏡技術(shù)，可以全面、深入地了解雙光子熒光材料的微觀特征，為材料的性能研究和應(yīng)用開發(fā)提供有力的支持。2.3穩(wěn)定性與生物相容性表征2.3.1光學(xué)穩(wěn)定性測試雙光子熒光材料在實(shí)際生物成像應(yīng)用中，需要在長時(shí)間光照下保持穩(wěn)定的熒光性能，因此光學(xué)穩(wěn)定性測試至關(guān)重要。其測試方法主要是通過持續(xù)照射樣品，監(jiān)測熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。在實(shí)驗(yàn)中，通常使用高強(qiáng)度的脈沖激光作為激發(fā)光源，如鈦寶石飛秒激光器，其脈沖寬度可達(dá)飛秒量級，重復(fù)頻率高，能夠提供穩(wěn)定且高能量密度的激發(fā)光。將雙光子熒光材料樣品置于激光焦點(diǎn)處，設(shè)置固定的激發(fā)光強(qiáng)度、波長和脈沖頻率等參數(shù)。例如，對于一種用于細(xì)胞成像的雙光子熒光探針，使用中心波長為800nm的飛秒激光，激發(fā)光強(qiáng)度為100mW，脈沖頻率為80MHz進(jìn)行照射。在照射過程中，利用熒光光譜儀或高靈敏度的探測器，按一定時(shí)間間隔（如每10分鐘）測量樣品的熒光強(qiáng)度。通過記錄不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，繪制出熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線，以此來評估材料的光學(xué)穩(wěn)定性。如果熒光強(qiáng)度在長時(shí)間照射下基本保持不變，表明材料具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性；若熒光強(qiáng)度逐漸降低，則說明材料發(fā)生了光漂白現(xiàn)象，穩(wěn)定性較差。例如，在對一種新型雙光子熒光染料進(jìn)行光學(xué)穩(wěn)定性測試時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在連續(xù)照射1小時(shí)后，熒光強(qiáng)度僅下降了5%，表明該染料具有較好的光學(xué)穩(wěn)定性，適合用于長時(shí)間的生物成像實(shí)驗(yàn)。影響材料光學(xué)穩(wěn)定性的因素眾多，主要包括激發(fā)光強(qiáng)度、照射時(shí)間、材料自身結(jié)構(gòu)以及環(huán)境因素等。激發(fā)光強(qiáng)度過高會加速熒光分子的光漂白過程，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度快速下降。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度超過一定閾值時(shí)，熒光分子可能會發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)變化，如化學(xué)鍵的斷裂或分子的分解，從而失去熒光發(fā)射能力。照射時(shí)間越長，熒光分子受到激發(fā)的次數(shù)越多，發(fā)生光漂白的概率也越大。材料自身的結(jié)構(gòu)對光學(xué)穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用，具有穩(wěn)定共軛結(jié)構(gòu)和強(qiáng)電子離域能力的分子，通常具有較好的抗光漂白性能。一些含有大共軛體系和剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)雙光子熒光材料，由于其分子內(nèi)電子云分布較為均勻，能夠有效地分散激發(fā)態(tài)能量，減少分子結(jié)構(gòu)的破壞，從而表現(xiàn)出較高的光學(xué)穩(wěn)定性。環(huán)境因素，如溫度、氧氣和溶劑等，也會對材料的光學(xué)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。高溫會加速分子的熱運(yùn)動，增加分子與周圍環(huán)境的相互作用，從而促進(jìn)光漂白過程；氧氣具有較強(qiáng)的氧化性，可能會與熒光分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的改變；溶劑的極性和酸堿度等性質(zhì)會影響熒光分子的電子云分布和分子間相互作用，進(jìn)而影響其光學(xué)穩(wěn)定性。2.3.2生物相容性評估生物相容性是雙光子熒光材料應(yīng)用于生物成像的關(guān)鍵前提，它直接關(guān)系到材料對生物體的安全性和對生物過程的干擾程度。評估雙光子熒光材料生物相容性的方法主要包括細(xì)胞毒性測試和溶血實(shí)驗(yàn)等，每種方法都有其特定的原理、操作流程和評估標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞毒性測試是評估生物相容性的常用方法之一，其原理是通過檢測材料對細(xì)胞生長、增殖和代謝等生理活動的影響來判斷其細(xì)胞毒性。常用的細(xì)胞系有小鼠成纖維細(xì)胞（L929）、人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）和人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）等。以MTT法為例，這是一種基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）的原理來檢測細(xì)胞活性的方法。具體操作時(shí)，首先將對數(shù)生長期的細(xì)胞以一定密度接種于96孔板中，每孔加入適量的細(xì)胞懸液，使其在培養(yǎng)板中均勻分布，然后在適宜的培養(yǎng)條件下（如37℃、5%CO?培養(yǎng)箱）孵育一段時(shí)間，讓細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含有不同濃度雙光子熒光材料的新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組和對照組，對照組加入不含材料的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間（如24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)）后，每孔加入適量的MTT溶液，繼續(xù)孵育數(shù)小時(shí)，使MTT充分被活細(xì)胞還原。然后棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解生成的甲瓚結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在特定波長下（通常為570nm）測量各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。一般認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞存活率大于75%時(shí)，材料的細(xì)胞毒性較低，具有較好的生物相容性；若細(xì)胞存活率低于50%，則表明材料可能具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，生物相容性較差。溶血實(shí)驗(yàn)主要用于評估材料對紅細(xì)胞的破壞作用，其原理是基于紅細(xì)胞膜的完整性被破壞后，血紅蛋白會釋放到溶液中，通過檢測溶液中血紅蛋白的含量來判斷材料是否具有溶血作用。實(shí)驗(yàn)通常采用新鮮的抗凝血液，如兔血或人血。首先將血液進(jìn)行離心處理，分離出紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞數(shù)次，以去除血漿和其他雜質(zhì)。然后將紅細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液。將不同濃度的雙光子熒光材料溶液與紅細(xì)胞懸液混合，同時(shí)設(shè)置陽性對照（如蒸餾水，可使紅細(xì)胞完全溶血）和陰性對照（如生理鹽水，不引起溶血）。在37℃恒溫條件下孵育一定時(shí)間（如1小時(shí)）后，再次離心，取上清液，用分光光度計(jì)在特定波長下（通常為540nm）測量上清液的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算溶血率，計(jì)算公式為：溶血率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-陰性對照組吸光度值）/（陽性對照組吸光度值-陰性對照組吸光度值）×100%。一般規(guī)定，溶血率小于5%的材料被認(rèn)為符合生物材料的溶血安全性要求，具有良好的生物相容性；若溶血率大于5%，則說明材料可能對紅細(xì)胞有較強(qiáng)的破壞作用，生物相容性不佳。通過細(xì)胞毒性測試和溶血實(shí)驗(yàn)等方法，可以全面、準(zhǔn)確地評估雙光子熒光材料的生物相容性，為其在生物成像領(lǐng)域的安全應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。三、雙光子熒光材料在生物成像中的應(yīng)用實(shí)例3.1細(xì)胞成像3.1.1線粒體成像線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，在細(xì)胞的能量代謝、信號傳導(dǎo)和凋亡調(diào)控等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對線粒體進(jìn)行精準(zhǔn)成像，對于深入研究細(xì)胞生理病理過程具有重要意義。聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AggregationInducedEmission，AIE）分子修飾的雙光子熒光染料在細(xì)胞線粒體成像領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的熒光分子大多存在聚集誘導(dǎo)淬滅（AggregationCausedQuenching，ACQ）效應(yīng)，即在聚集狀態(tài)下熒光強(qiáng)度會顯著降低，這限制了它們在生物成像中的應(yīng)用。而AIE分子則相反，在溶液中熒光較弱，但在聚集態(tài)下熒光顯著增強(qiáng)。當(dāng)AIE分子修飾成雙光子熒光染料后，結(jié)合了雙光子激發(fā)的優(yōu)勢和AIE特性，能夠?qū)崿F(xiàn)對線粒體的高效、精準(zhǔn)成像。其成像原理主要基于線粒體的生理特性和染料分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。線粒體具有較高的膜電位，帶正電荷的AIE雙光子熒光染料可以通過靜電作用與線粒體膜結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對線粒體的靶向。一些AIE雙光子熒光染料還具有特定的分子結(jié)構(gòu)，如含有親脂性基團(tuán)，能夠更容易地穿透細(xì)胞膜和線粒體膜，進(jìn)入線粒體內(nèi)部，與線粒體中的特定成分相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對線粒體的特異性標(biāo)記。在雙光子激發(fā)過程中，近紅外激發(fā)光的長波長特性使得光能夠更深入地穿透細(xì)胞，減少對細(xì)胞的損傷，同時(shí)避免了細(xì)胞內(nèi)自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾。AIE分子在聚集態(tài)下的強(qiáng)熒光發(fā)射，使得線粒體的成像信號更強(qiáng)，對比度更高，能夠清晰地呈現(xiàn)線粒體的形態(tài)和分布。以中國科學(xué)院成都生物研究所和國家納米科學(xué)中心合作研發(fā)的一種納米尺度的有機(jī)雙光子熒光染料為例。該染料由聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子通過化學(xué)修飾制備而成，能夠聚集成20-40nm的納米顆粒。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，無論是單光子激發(fā)還是雙光子激發(fā)，這些納米顆粒都能夠準(zhǔn)確定位到細(xì)胞線粒體內(nèi)。通過雙光子熒光顯微鏡觀察，清晰地呈現(xiàn)出線粒體的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，其熒光信號強(qiáng)且穩(wěn)定，背景噪音低。與傳統(tǒng)的線粒體熒光染料相比，該AIE雙光子熒光染料無需對生物樣本進(jìn)行反復(fù)洗滌以去除背景熒光，簡化了實(shí)驗(yàn)操作流程，同時(shí)保證了熒光強(qiáng)度不受洗滌步驟的影響。這一特性對于臨床生物成像避免背景熒光干擾、提高成像質(zhì)量具有重要意義，為研究線粒體相關(guān)的細(xì)胞生理病理過程提供了有力的工具。3.1.2細(xì)菌微生物成像利用線粒體與細(xì)菌之間的相似性，雙光子熒光染料為細(xì)菌微生物成像提供了一種創(chuàng)新且有效的方法。線粒體和細(xì)菌在某些生理特征上具有相似之處，例如它們都具有膜結(jié)構(gòu)，且膜電位存在一定的相似性。這使得一些原本用于線粒體成像的雙光子熒光染料能夠?qū)?xì)菌微生物進(jìn)行有效標(biāo)記和成像。在實(shí)際應(yīng)用中，基于線粒體靶向的雙光子熒光染料，通過合理的分子設(shè)計(jì)和修飾，使其能夠特異性地識別細(xì)菌表面的某些分子或結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的選擇性標(biāo)記。這些染料在雙光子激發(fā)下，能夠發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光信號，利用雙光子熒光顯微鏡的高分辨率和深層組織穿透能力，可以清晰地觀察到細(xì)菌在生物樣本中的分布、形態(tài)和動態(tài)變化。這種成像方法具有諸多優(yōu)勢，首先，雙光子激發(fā)的長波長特性使得激發(fā)光在生物組織中散射和吸收較少，能夠深入樣本內(nèi)部，對深層組織中的細(xì)菌進(jìn)行成像，這對于研究感染性疾病中細(xì)菌在組織深部的侵染過程尤為重要。其次，雙光子熒光成像的高空間選擇性，能夠有效減少背景熒光的干擾，提高成像的信噪比和分辨率，使得細(xì)菌的成像更加清晰準(zhǔn)確。以之前提到的由聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子修飾的雙光子熒光染料為例，由于其納米顆粒的尺寸較小，能夠更容易地與細(xì)菌表面相互作用。在對細(xì)菌微生物成像時(shí)，這些納米顆?？梢钥焖俚匚降郊?xì)菌表面，并通過與細(xì)菌膜的相互作用進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。在雙光子激發(fā)下，染料發(fā)射出強(qiáng)烈的熒光，能夠清晰地區(qū)分細(xì)菌與周圍的生物組織。與傳統(tǒng)的細(xì)菌成像方法相比，這種基于雙光子熒光染料的成像技術(shù)無需復(fù)雜的樣本處理過程，能夠在活體狀態(tài)下對細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，為研究細(xì)菌的生長、繁殖和感染機(jī)制提供了更直接、更真實(shí)的信息。在研究細(xì)菌感染的動物模型中，利用雙光子熒光成像技術(shù)，可以實(shí)時(shí)追蹤細(xì)菌在體內(nèi)的傳播路徑和感染范圍，為開發(fā)新的抗菌治療策略提供重要的理論依據(jù)。3.2組織成像3.2.1腦血管成像腦血管成像對于研究大腦的生理功能、疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及臨床診斷和治療具有至關(guān)重要的意義。暨南大學(xué)陳明副教授、香港中文大學(xué)（深圳）唐本忠院士和浙江大學(xué)錢駿教授合作開展的一項(xiàng)研究，基于空間電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)和“扭曲-扭曲”相互作用，設(shè)計(jì)出具有雙光子激發(fā)性質(zhì)的復(fù)合物納米熒光探針，為小鼠腦血管活體成像提供了新的解決方案?？臻g電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物通常由具有低電子電離能的平面給體分子和高電子親和能的平面受體分子組成，在聚集態(tài)下，它們會形成有序、密集的堆積，并發(fā)生從給體向受體的空間電荷轉(zhuǎn)移。四硫富瓦烯（TTF）-7,7,8,8-四氰基對醌二甲烷（TCNQ）體系是最早被報(bào)道且最為著名的空間電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物。傳統(tǒng)空間電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物的特殊聚集態(tài)結(jié)構(gòu)使其在有機(jī)金屬、兩極傳輸和光導(dǎo)材料等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，然而，由于平面給受體分子之間的π-π堆積效應(yīng)容易導(dǎo)致熒光猝滅，限制了其在發(fā)光領(lǐng)域的應(yīng)用。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)選用吡嗪類AIE受體分子和芳胺類給體分子?？臻g電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)顯著降低了復(fù)合物的能帶隙，使其具有深紅光發(fā)射特性，這在生物成像中具有重要優(yōu)勢，深紅光能夠減少生物組織對光的吸收和散射，提高成像的穿透深度和信噪比。給受體分子之間的“扭曲-扭曲”相互作用發(fā)揮了關(guān)鍵作用，一方面，它抑制了π-π堆積效應(yīng)、激子分離和電荷傳輸?shù)瓤赡軐?dǎo)致熒光猝滅的過程；另一方面，使二者之間產(chǎn)生多重氫鍵，限制了激發(fā)態(tài)的非輻射耗散，促進(jìn)了發(fā)光。傳統(tǒng)空間電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物一般以共晶態(tài)使用，制備納米級別的共晶粒子難度極大。而該研究提出的“扭曲-扭曲”相互作用，不限定給受體分子間以有序堆積來實(shí)現(xiàn)功能，利用這一特性，成功便捷地制備出穩(wěn)定性和生物相容性好的納米探針材料。結(jié)合其雙光子激發(fā)性質(zhì)，該納米探針能夠?qū)崿F(xiàn)多功能、深度、高信噪比的鼠腦血管活體成像。通過實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)對小鼠腦血管在不同深度下進(jìn)行了雙光子成像。結(jié)果顯示，在0-400微米深度范圍內(nèi)，清晰地呈現(xiàn)出腦血管的三維結(jié)構(gòu)。在100微米深度處，通過雙光子激發(fā)熒光壽命成像，進(jìn)一步獲取了腦血管的熒光壽命信息，這對于研究腦血管的生理狀態(tài)和功能具有重要價(jià)值。沿著血管所畫直線上獲得的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，經(jīng)過分析推演，得到了血管直徑和成像信噪比等關(guān)鍵參數(shù)，為腦血管的定量分析提供了依據(jù)。這項(xiàng)研究不僅提供了一種便捷設(shè)計(jì)雙光子熒光探針的新理念，還開辟了空間電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物在生物成像領(lǐng)域的新應(yīng)用，為腦血管成像研究和相關(guān)疾病的診斷與治療提供了有力的技術(shù)支持。3.2.2癲癇腦組織成像癲癇是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性神經(jīng)退行性疾病，其病理進(jìn)展與過氧化亞硝酰（ONOO-）密切相關(guān)。然而，由于缺乏有效的成像探針來確定癲癇腦中ONOO-水平的波動，深入了解ONOO-在癲癇中的生理作用一直面臨挑戰(zhàn)。海南醫(yī)學(xué)院急診創(chuàng)傷學(xué)院功能材料與分子影像技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的于法標(biāo)教授和王銳副教授設(shè)計(jì)了一種近紅外的雙光子熒光探針（DCM-ONOO），成功實(shí)現(xiàn)了對大鼠癲癇模型中過氧化亞硝酰波動的動態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測，并用于癲癇腦組織成像。該探針由近紅外雙光子二氰基亞甲基-4H-吡喃（DCM）熒光團(tuán)和識別部分二苯基次膦酰胺組成。其工作原理基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）機(jī)制，當(dāng)探針與ONOO-反應(yīng)時(shí)，磷酰胺鍵被打斷，釋放出氨基，從而恢復(fù)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程，發(fā)出強(qiáng)烈熒光。這一過程具有高靈敏性和選擇性，能夠快速追蹤活細(xì)胞和海藻酸鹽誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中的ONOO-波動。在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，探針能夠準(zhǔn)確地檢測到細(xì)胞內(nèi)ONOO-水平的變化，為研究細(xì)胞內(nèi)的生理病理過程提供了重要信息。在大鼠癲癇模型實(shí)驗(yàn)中，通過雙光子熒光成像技術(shù)，對癲癇大鼠腦組織海馬區(qū)域的ONOO-進(jìn)行了活體成像。結(jié)果表明，在海藻酸鹽刺激下，癲癇大鼠腦中ONOO-水平顯著升高，且與癲癇發(fā)作和大腦中嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，小劑量白藜蘆醇可以有效抑制ONOO-的過表達(dá)，并進(jìn)一步緩解神經(jīng)元損傷。這一發(fā)現(xiàn)為癲癇的治療提供了新的潛在藥物靶點(diǎn)和治療策略。借助雙光子熒光成像技術(shù)，異常水平的ONOO-有望作為診斷癲癇的潛在指標(biāo)。該探針基于其快速動力學(xué)和出色的生物相容性，能夠在活細(xì)胞和大鼠癲癇腦中以優(yōu)異的時(shí)空分辨率有效檢測內(nèi)源性O(shè)NOO-的變化?；贒CM-ONOO的雙光子熒光成像為了解癲癇的病理學(xué)和診斷提供了一種很好的潛在方法，具有巨大的臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化潛力，可作為強(qiáng)大的化學(xué)工具實(shí)時(shí)跟蹤ONOO-波動，進(jìn)一步幫助診斷癲癇病。四、應(yīng)用中的挑戰(zhàn)與解決方案4.1面臨的挑戰(zhàn)4.1.1材料性能局限盡管雙光子熒光材料在生物成像領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，但目前仍面臨一些材料性能方面的局限，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用和發(fā)展。首先，雙光子吸收截面小是一個(gè)突出問題。雙光子吸收截面直接決定了材料在雙光子激發(fā)過程中吸收光子的能力，較小的雙光子吸收截面意味著需要更高的激發(fā)光強(qiáng)度才能實(shí)現(xiàn)有效的雙光子激發(fā)，這不僅增加了對激光設(shè)備的要求，還可能導(dǎo)致對生物樣本的光損傷加劇。目前，大多數(shù)雙光子熒光材料的雙光子吸收截面在10-1000GM范圍內(nèi)，雖然部分材料在特定結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)下能夠達(dá)到較高的值，但總體來說，與實(shí)際應(yīng)用需求相比仍有提升空間。例如，在對深層組織進(jìn)行高分辨率成像時(shí)，由于組織對光的散射和吸收，需要材料具有較大的雙光子吸收截面，以保證在穿透組織過程中仍能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的熒光信號。然而，現(xiàn)有的材料難以滿足這一要求，導(dǎo)致成像深度和分辨率受到限制。熒光量子產(chǎn)率低也是制約雙光子熒光材料性能的重要因素。熒光量子產(chǎn)率反映了材料將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射的效率，低量子產(chǎn)率使得熒光信號較弱，影響成像的靈敏度和清晰度。許多有機(jī)雙光子熒光材料由于分子內(nèi)的能量損耗機(jī)制，如振動弛豫、系間竄越等，導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)率較低。一些傳統(tǒng)的有機(jī)染料在溶液中的熒光量子產(chǎn)率可能僅為10%-30%，即使通過結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，也難以達(dá)到理想的高量子產(chǎn)率水平。在生物成像中，弱的熒光信號容易被背景噪聲淹沒，尤其是在檢測微量生物分子或?qū)Φ捅磉_(dá)目標(biāo)進(jìn)行成像時(shí)，低熒光量子產(chǎn)率會嚴(yán)重影響檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。材料的穩(wěn)定性不足同樣不容忽視。雙光子熒光材料在生物成像過程中，需要長時(shí)間暴露在激發(fā)光下，同時(shí)還可能受到生物環(huán)境中各種因素的影響，如溫度、pH值、生物分子的相互作用等。如果材料的穩(wěn)定性不佳，可能會發(fā)生光漂白、化學(xué)降解或結(jié)構(gòu)變化等現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光性能下降甚至喪失。例如，某些有機(jī)雙光子熒光探針在光照數(shù)小時(shí)后，熒光強(qiáng)度會顯著降低，無法滿足長時(shí)間動態(tài)監(jiān)測生物過程的需求；一些材料在生理環(huán)境中，由于與生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)被破壞，從而失去雙光子熒光特性。材料穩(wěn)定性不足不僅影響成像的質(zhì)量和可靠性，還限制了其在體內(nèi)成像等長期應(yīng)用場景中的使用。4.1.2成像技術(shù)難題在雙光子熒光成像技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中，也面臨著一系列技術(shù)難題，這些難題阻礙了成像效果的進(jìn)一步提升和應(yīng)用范圍的拓展。成像深度和分辨率受限是目前雙光子熒光成像面臨的主要技術(shù)瓶頸之一。雖然雙光子熒光成像相較于單光子成像具有更好的穿透能力，但在對深層生物組織成像時(shí)，仍受到光散射和吸收的限制。生物組織是一種復(fù)雜的介質(zhì)，其中的細(xì)胞、細(xì)胞器和生物大分子等會對激發(fā)光和熒光信號產(chǎn)生散射和吸收作用，導(dǎo)致光在組織中的傳播過程中能量逐漸衰減，成像深度和分辨率下降。當(dāng)成像深度增加時(shí)，散射光的干擾使得熒光信號變得模糊，難以分辨組織中的細(xì)微結(jié)構(gòu)。在對大腦深層組織成像時(shí)，由于腦組織中富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分，對光的散射較強(qiáng)，即使使用近紅外激發(fā)光，成像深度也通常限制在1-2mm以內(nèi)，且在該深度下分辨率也會顯著降低，無法滿足對深部腦區(qū)進(jìn)行高分辨率成像的需求。成像速度慢也是一個(gè)亟待解決的問題。雙光子熒光成像通常采用逐點(diǎn)掃描的方式獲取圖像，掃描速度受到掃描設(shè)備和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的限制。傳統(tǒng)的振鏡掃描系統(tǒng)在高速掃描時(shí)，由于振鏡的慣性和響應(yīng)速度限制，難以實(shí)現(xiàn)快速的圖像采集，導(dǎo)致成像速度較慢，無法滿足對快速動態(tài)生物過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測需求。在研究神經(jīng)元的快速電活動或細(xì)胞內(nèi)的快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程時(shí)，需要能夠捕捉到毫秒甚至微秒級別的變化，而現(xiàn)有的成像速度往往只能達(dá)到每秒數(shù)幀到數(shù)十幀，無法準(zhǔn)確記錄這些快速變化的過程，限制了對生物動態(tài)過程的深入研究。此外，成像速度慢還會增加樣本在激發(fā)光下的暴露時(shí)間，進(jìn)一步加劇光漂白和光毒性問題。4.2解決方案與策略4.2.1材料優(yōu)化策略為克服雙光子熒光材料性能上的局限，科研人員從分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和納米材料制備等方面入手，探索有效的材料優(yōu)化策略，以提升材料的性能，滿足生物成像的需求。在分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面，合理調(diào)控分子內(nèi)的電子云分布和共軛體系是提高雙光子吸收截面和熒光量子產(chǎn)率的關(guān)鍵。引入強(qiáng)電子給體和受體基團(tuán)是一種常用的方法。給體基團(tuán)能夠提供電子，受體基團(tuán)則能接受電子，通過給受體之間的電荷轉(zhuǎn)移作用，增強(qiáng)分子的共軛程度，從而增大雙光子吸收截面。以基于三苯胺類的雙光子熒光材料為例，將強(qiáng)給電子的氨基（-NH?）作為給體，與強(qiáng)吸電子的氰基（-CN）作為受體，通過共軛橋連接，形成D-π-A結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)，電子云分布更加離域，顯著提高了雙光子吸收截面。理論計(jì)算表明，該結(jié)構(gòu)的雙光子吸收截面比未引入給受體基團(tuán)的分子提高了數(shù)倍。在熒光量子產(chǎn)率方面，通過優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，減少分子內(nèi)的能量損耗途徑，如抑制振動弛豫和系間竄越等非輻射躍遷過程，能夠提高熒光量子產(chǎn)率。例如，設(shè)計(jì)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子，限制分子的振動和轉(zhuǎn)動，減少能量以熱的形式散失，從而提高熒光發(fā)射效率。一些含有大共軛稠環(huán)結(jié)構(gòu)的雙光子熒光分子，由于其分子平面性好，共軛程度高，能夠有效降低非輻射躍遷幾率，熒光量子產(chǎn)率可達(dá)到50%以上。納米材料制備也是優(yōu)化雙光子熒光材料性能的重要途徑。通過制備納米尺寸的雙光子熒光材料，如量子點(diǎn)、納米粒子和納米復(fù)合物等，可以調(diào)控材料的光學(xué)性質(zhì)，提高其穩(wěn)定性和生物相容性。量子點(diǎn)是一種具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的半導(dǎo)體納米材料，其尺寸效應(yīng)和量子限域效應(yīng)使其在雙光子熒光成像中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。通過精確控制量子點(diǎn)的尺寸和表面配體，可以調(diào)節(jié)其雙光子吸收和熒光發(fā)射性能。例如，制備的CdSe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)，通過優(yōu)化殼層厚度和表面配體的種類和數(shù)量，能夠提高量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率和穩(wěn)定性。在生物成像實(shí)驗(yàn)中，該量子點(diǎn)表現(xiàn)出良好的雙光子熒光性能，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的生物分子進(jìn)行高靈敏度的檢測和成像。納米粒子和納米復(fù)合物的制備可以將雙光子熒光材料與其他功能性材料相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)性能的協(xié)同優(yōu)化。將雙光子熒光染料與具有生物靶向性的納米載體相結(jié)合，如脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒等，不僅可以提高熒光材料的生物相容性和靶向性，還能通過納米載體的保護(hù)作用，增強(qiáng)熒光材料的穩(wěn)定性。一種將雙光子熒光染料包裹在脂質(zhì)體中的納米復(fù)合物，在生物體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在，并通過脂質(zhì)體表面的靶向配體，特異性地富集在腫瘤組織中，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的高分辨率雙光子熒光成像。4.2.2成像技術(shù)改進(jìn)針對雙光子熒光成像技術(shù)面臨的成像深度和分辨率受限、成像速度慢等難題，研究人員積極探索成像技術(shù)改進(jìn)措施，通過多模態(tài)成像技術(shù)融合和成像參數(shù)優(yōu)化等手段，提升成像效果和應(yīng)用范圍。多模態(tài)成像技術(shù)融合是突破成像深度和分辨率限制的有效策略。將雙光子熒光成像與其他成像技術(shù)相結(jié)合，如二次諧波成像、相干反斯托克斯拉曼散射成像等，可以綜合利用不同成像技術(shù)的優(yōu)勢，提高對生物組織的成像能力。雙光子熒光成像能夠提供生物分子的熒光信息，而二次諧波成像則可以對生物組織中的非中心對稱結(jié)構(gòu)，如膠原蛋白等進(jìn)行成像，兩者結(jié)合可以同時(shí)獲取生物分子和組織結(jié)構(gòu)的信息，提高成像的全面性和準(zhǔn)確性。在對皮膚組織成像時(shí)，雙光子熒光成像可以顯示皮膚細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記物分布，二次諧波成像則能清晰呈現(xiàn)皮膚中的膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)，通過融合這兩種成像信息，可以更深入地了解皮膚的生理病理狀態(tài)。相干反斯托克斯拉曼散射成像能夠?qū)ι锓肿拥恼駝犹卣鬟M(jìn)行成像，提供分子組成和結(jié)構(gòu)信息，與雙光子熒光成像融合后，可以實(shí)現(xiàn)對生物組織的多參數(shù)成像，進(jìn)一步提高成像的分辨率和對比度。在研究細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)分布時(shí)，相干反斯托克斯拉曼散射成像可以準(zhǔn)確識別脂質(zhì)分子，雙光子熒光成像則可標(biāo)記其他生物分子，兩者結(jié)合能夠全面展示細(xì)胞內(nèi)不同生物分子的分布和相互作用。成像參數(shù)優(yōu)化也是提高成像質(zhì)量的關(guān)鍵。合理調(diào)整激發(fā)光的功率、波長和脈沖寬度等參數(shù)，以及探測器的增益、積分時(shí)間等參數(shù)，可以在保證成像效果的前提下，減少光損傷和提高成像速度。激發(fā)光功率過高會增加光漂白和光毒性，而過低則會導(dǎo)致熒光信號強(qiáng)度不足。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，找到最佳的激發(fā)光功率，在保證熒光信號強(qiáng)度的同時(shí)，降低對生物樣本的損傷。在對神經(jīng)元成像時(shí)，通過調(diào)整激發(fā)光功率，使熒光信號強(qiáng)度達(dá)到最佳，同時(shí)避免了神經(jīng)元因光損傷而導(dǎo)致的功能異常。優(yōu)化探測器的積分時(shí)間可以在一定程度上提高成像速度，縮短圖像采集時(shí)間。對于快速變化的生物過程，適當(dāng)縮短積分時(shí)間，能夠更快地捕捉到生物過程的動態(tài)變化，但需要注意的是，積分時(shí)間過短可能會導(dǎo)致噪聲增加，因此需要在成像速度和圖像質(zhì)量之間找到平衡。在研究細(xì)胞內(nèi)的鈣離子瞬變過程時(shí)，通過優(yōu)化探測器積分時(shí)間，成功實(shí)現(xiàn)了對鈣離子快速變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測，為研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究全面且深入地探討了雙光子熒光材料的表征方法及其在生物成像中的應(yīng)用，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的成果。在雙光子熒光材料的表征方面，系統(tǒng)研究了多種關(guān)鍵的表征方法。在光學(xué)性能表征中，熒光光譜分析能夠準(zhǔn)確獲取材料的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，從而確定最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍，為材料的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)的光學(xué)參數(shù)。通過量子產(chǎn)率測定，明確了材料將吸收光能轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射的效率，這對于評估材料的發(fā)光性能和成像靈敏度至關(guān)重要。雙光子吸收截面的測定則量化了材料的雙光子吸收能力，不同的測量技術(shù)如非線性透過率法、Z-掃描方法、雙光子誘導(dǎo)熒光法和雙光子瞬態(tài)吸收光譜法，從不同角度準(zhǔn)確地測定了雙光子吸收截面，為材料的性能評估和應(yīng)用選擇提供了關(guān)鍵依據(jù)。在結(jié)構(gòu)與形貌表征