(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(71)申請人北京立康生命科技有限公司地址100023北京市大興區(qū)北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)經(jīng)海四路22號院四區(qū)5號樓3層(72)發(fā)明人賈明明陳立朱偉萍魏艷慧(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京謹(jǐn)禮知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)16342專利代理師王子曄鮑曉芳(54)發(fā)明名稱一種有利于抗原呈遞的間隔肽本申請涉及一種間隔肽，其在疫苗中起到間隔不同抗原的作用，其在體內(nèi)能夠被特定酶高效剪切并釋放抗原，實(shí)現(xiàn)抗原被抗原呈遞細(xì)胞有效復(fù)蘇后時(shí)間(小時(shí))復(fù)蘇后時(shí)間(小時(shí))2×10°-復(fù)蘇后時(shí)間(小時(shí))21.一種間隔肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一種合成的核酸分子，所述合成的核酸分子編碼權(quán)利要求1所述的間隔肽，所述合成的核酸分子的序列如SEQIDNO.2所示。3.權(quán)利要求1所述的間隔肽或權(quán)利要求2所述的合成的核酸分子在制備疫苗中的用途。(Nucleicacidvaccines)或多肽疫苗(Peptide-basedvaccines)。5.權(quán)利要求4所述的用途，所述核酸疫苗是核酸癌癥疫苗。肽表位。7.多個(gè)間隔肽或編碼它們的核酸分子聯(lián)合用于制備疫苗中的用途，所述多個(gè)間隔肽中至少一個(gè)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。組成的組的一種或多種間隔肽。9.權(quán)利要求1所述的間隔肽或權(quán)利要求2所述的合成的核酸分子在制備融合蛋白中的用途。10.一種核酸癌癥疫苗，其特征在于，所述核酸癌癥疫苗編碼3-40個(gè)肽表位和位于所述肽表位之間的間隔肽，并且所述間隔肽中至少一個(gè)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3一種有利于抗原呈遞的間隔肽技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種間隔肽及其用途。背景技術(shù)[0002]間隔肽是在疫苗中起到間隔不同抗原作用的短肽，多表位疫苗(multi-epitopevaccine)也稱雞尾酒式疫苗，是同時(shí)攜帶多個(gè)與目標(biāo)抗原相關(guān)的及輔助性表位的疫苗。與得到高效的呈遞；在細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可有效應(yīng)對病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的諸多不利因素。[0003]一般而言，多表位疫苗是運(yùn)用重組DNA技術(shù)將多個(gè)編碼抗原表位的DNA序列片段進(jìn)計(jì)多表位疫苗最簡單的方法是將多表位疫苗的不同表位通過間隔序列串連起來，這種設(shè)計(jì)能夠使得不同表位相對獨(dú)立地的發(fā)揮作用。其中，治療性腫瘤疫苗是多表位疫苗重要成員之一，目前在研的治療性腫瘤疫苗大多采用間隔肽間隔不同抗原的設(shè)計(jì)思路。[0004]由于個(gè)性化腫瘤mRNA疫苗在序列設(shè)計(jì)上通常會要求其高效表達(dá)十幾種甚至幾十種新生抗原片段，因此選擇合適的間隔肽對于個(gè)性化腫瘤mRNA疫苗的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，即：1.能避免產(chǎn)生與MHC分子相結(jié)合的匯合點(diǎn)(bindingjunction)肽；2.能避免蛋白酶體加工以產(chǎn)生匯合點(diǎn)肽；3.能被有效翻譯和被蛋白酶體加工。例如：研究人員將弗林蛋白酶識別序列(REKR、RDKR)用于制備腫瘤疫苗，用于連接不同表位需要柔性或適度剛性的間隔肽，以確保不同表位獨(dú)立暴露，避免空間位阻導(dǎo)致部分抗原無法在體內(nèi)被有效切割；選擇合適長度和生物學(xué)活性的間隔肽可以促進(jìn)抗原片段被蛋白酶體有效切割，優(yōu)化抗原呈遞；此外，如果間隔肽選擇不當(dāng)或含有潛在的免疫表位，可能會與目的間隔肽，研究人員仍需要研發(fā)獲得能夠?qū)崿F(xiàn)抗原提呈效果更好的間隔肽。發(fā)明內(nèi)容[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何實(shí)現(xiàn)更好的抗原提呈效果。[0007]據(jù)此，本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是提供了一種間隔肽，能夠有效提高新生抗原疫苗在體內(nèi)的免疫效果。例如：對應(yīng)序列在樹突狀細(xì)胞(DC)中翻譯的抗原肽更傾向于優(yōu)先在間隔肽處被切割，利于各表位肽更好地被加工、提呈。[0009]此外，本申請涉及一種合成的核酸分子，所述核酸分子編碼本申請的間隔肽。4[0011]在一些實(shí)施方案中，核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5'-[0012]第二方面，提供了本申請的間隔肽或核酸分子在制備疫苗中的用途。[0013]在一些實(shí)施方案中，疫苗包括：微生物載體疫苗(Microbialvector-basedvaccines)、病毒載體疫苗(Viral核酸疫苗(Nucleicacidvaccines)、多肽疫苗(Pept[0014]在一些實(shí)施方案中，所述核酸疫苗包括核酸傳染病疫苗、核酸自身性免疫疾病疫苗和核酸癌癥疫苗。[0016]在一些實(shí)施方案中，所述核酸癌癥疫苗針對的癌癥或腫瘤包括但不限于贅瘤、惡性腫瘤、轉(zhuǎn)移癌，或特征在于細(xì)胞生長不受控制以致它將被視為具有癌性的任何疾病或病癥。癌癥可以是原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥。[0017]在一些實(shí)施方案中，癌癥可包括但不限于膽道癌、膀胱癌、腦癌包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤絨毛膜癌、基質(zhì)腫瘤和生殖細(xì)胞腫瘤、甲狀腺癌以及腎癌。[0018]在一些實(shí)施方案中，所述核酸自身性免疫疾病疫苗針對的自身性免疫疾病包括：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、銀屑病關(guān)節(jié)炎(vitiligo)、多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis)、視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica)、克羅恩氏病(Crohn'sdisease多種核酸各自具有一個(gè)或多個(gè)編碼5-130個(gè)、20-40個(gè)、30-35個(gè)或34個(gè)肽表位的開放閱讀框。肽表位可以選自個(gè)性化癌癥抗原的部分和/或腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigen,TAA)腫瘤特異性抗原，并且其中肽表位中的每一個(gè)均具有相同或不同的長度。[0020]在一些具體的實(shí)施方案中，任何肽表位的最小長度為8個(gè)氨基酸；在一些實(shí)施方案中，任何肽表位的最大長度為31個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，任何或所有肽表位的最小長度為13個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，任何或所有肽表位的最大長度為35個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，任何或所有肽表位的長度為25個(gè)氨基酸。[0021]在一些具體的實(shí)施方案中，所述一種或多種核酸各自編碼3-130種肽表位，如3-10個(gè)肽表位、5-10個(gè)肽表位、10-20個(gè)肽表位、20-30個(gè)肽表位、30-40個(gè)肽表位、40-50個(gè)肽表位、50-60個(gè)肽表位、60-70個(gè)肽表位、70-80個(gè)肽表位、80-90個(gè)肽表位、90-100個(gè)肽表位、100-110個(gè)肽表位、110-120個(gè)肽表位，或120-5[0023]在一些具體的實(shí)施方案中，肽表位中的每一個(gè)均由單獨(dú)的開放閱讀框編碼。在一些實(shí)施方案中，所述肽表位呈由3-130個(gè)肽表位組成的多聯(lián)癌癥抗原的形式。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥疫苗組合物包含一種mRNA,所述mRNA具有一個(gè)編碼15個(gè)肽表位的開放閱讀框。[0024]在一些實(shí)施方案中，抗原序列(例如：肽表位)優(yōu)選由間隔肽分開。[0025]在一些實(shí)施方案中，除了末端抗原序列，所有的抗原序列都排列在抗原亞單元中，每個(gè)亞單元由抗原序列和間隔肽組成。由于抗原序列由間隔肽分離，因此每個(gè)抗原以最佳方式呈遞至免疫系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的免疫效果。腫瘤(癌癥)疫苗。[0028]在一些實(shí)施方案中，mRNA疫苗進(jìn)一步包含5'-UTR.5'-UTR是指mRNA的不編碼蛋白質(zhì)或肽的起始密碼子的直接上游的區(qū)域?；駽ap2。蛋白質(zhì)編碼區(qū)的終止密碼子下游，并且被轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)或肽的區(qū)域。的3'端的腺苷酸殘基序列。示例性的polyA尾包括具有至少20個(gè)且至多500個(gè)，諸如30個(gè)、40[0032]在另一些具體的實(shí)施方案中，所述新生抗原mRNA抗腫瘤疫苗的總長度編碼50-1001000-1100個(gè)氨基酸，或1100-1200個(gè)氨基酸的總蛋白質(zhì)長度。[0033]在具體的實(shí)施方案中，疫苗是多表位疫苗。[0034]在具體的實(shí)施方案中，疫苗是新生抗原腫瘤疫苗。[0035]第三方面，本申請涉及多種間隔肽或編碼它們的核酸分子聯(lián)合用于制備疫苗中的用途，所述間隔肽中至少一個(gè)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0036]在一些實(shí)施方案中，所述間隔肽進(jìn)一步可以選自：GPGPG、EAAAK、AAY、GGGS、KK、組成的組中的一種或多種。[0037]第四方面，本申請涉及一種核酸癌癥疫苗，其中，所述疫苗編碼3-40個(gè)肽表位和相鄰的肽表位之間的間隔肽，并且至少一個(gè)間隔肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0038]在一些實(shí)施方案中，所述間隔肽進(jìn)一步可選自：GPGPG、EAAAK、AAY、GGGS、KK、組成的組中的一種或多種。[0039]在一些實(shí)施方案中，所述核酸癌癥疫苗包括編碼多個(gè)肽表位抗原的mRNA疫苗，所述多個(gè)肽表位抗原被排列成在相鄰的肽表位之間均設(shè)置有間隔肽，或者在部分相鄰的肽表6位之間不具有間隔肽的情況下直接彼此聯(lián)接。[0041]在一些實(shí)施方案中，所述表位是非預(yù)測性表位，其包括已鑒定或通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。[0042]在一些實(shí)施方案中，所述抗原包括但不限于：傳染病病毒抗原、腫瘤抗原、自身免疫疾病抗原。[0043]在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤抗原包括：腫瘤相關(guān)抗原(TAA)和腫瘤特異性抗原(TSA)。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤特異性抗原(TSA)包括腫瘤新抗原，又稱腫瘤新生抗原。[0044]在一些實(shí)施方案中，腫瘤新生抗原包括：通用型新生抗原(Sharedneoantigen)和個(gè)性化新生抗原(personalizedneoantigen)。通用型新生抗原可以在不同個(gè)體或者瘤種之間都有表達(dá)。個(gè)性化新生抗原則是特異的表達(dá)在某一患者體內(nèi)。[0046]本發(fā)明的有益效果是本申請的間隔肽在呈遞不同靶點(diǎn)不同序列的抗原肽時(shí)都有效并顯著地優(yōu)于對照。附圖說明[0047]圖1:MART1-Jurkat細(xì)胞抗原提呈實(shí)驗(yàn)結(jié)果。[0048]圖2:G12V-Jurkat細(xì)胞抗原提呈實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式[0049]在一些實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┝艘环N包含一種或多種核酸的核酸癌癥疫苗，其中每種核酸編碼至少一種合適的癌癥抗原，諸如對癌癥受試者具有特異性的個(gè)性化抗原。例如，核酸癌癥疫苗可包含編碼一種或多種對每名受試者具有特異性的癌癥抗原(稱為新表位)的核酸。在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)或由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原被稱為“腫腫瘤相關(guān)抗原也可在，或者也可不在非癌性細(xì)胞中表達(dá)。許多腫瘤突變在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在非癌性細(xì)胞中不表達(dá)或很少表達(dá)，或者其在非癌性細(xì)胞中的表達(dá)相比在癌性細(xì)胞中的表達(dá)充分降低并且在接種疫苗后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)抗原被稱為新表位。新表位一般不會產(chǎn)生針對健康組織的免疫應(yīng)答，也不會被免疫系統(tǒng)的保護(hù)性組分掩蓋。[0050]在一些實(shí)施方案中，基于新表位的個(gè)性化疫苗是合乎需要的，因?yàn)榇祟愐呙缰苿⑹贯槍颊叩奶囟[瘤的特異性最大化。突變源性新表位可由以下產(chǎn)生：點(diǎn)突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的氨基酸不同的非同義突變；通讀突變，其中終止密碼子被修飾或刪除從而導(dǎo)致在C末端處具有新型腫瘤特異性序列的較長蛋白質(zhì)的翻譯；剪接位點(diǎn)突變，其導(dǎo)致在成熟mRNA中包含內(nèi)含子并因而包含獨(dú)特的腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列；染色體重排，其在2種蛋白質(zhì)的接合點(diǎn)處產(chǎn)生具有腫瘤特異性序列的嵌合蛋白(即：基因融合);移碼突變或刪除，其導(dǎo)致具有新型腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列的新的開放閱讀框和/或易位。[0051]每個(gè)肽表位可以是對于表位合理的任何長度。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)肽表位的長度不一定相等。在一些實(shí)施方案中，核酸癌癥疫苗中的每個(gè)肽表位具有不同的長度。在某7至少15個(gè)，以及多達(dá)且包括全部)具有不同的長度。[0052]在一些實(shí)施方案中，所述肽表位中的至少一個(gè)的長度為至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4少39個(gè)、至少40個(gè)氨基酸。在其他實(shí)施方案中，所述肽表位中的至少一個(gè)的長度為50個(gè)或更他實(shí)施方案中，所述肽表位中的至少一個(gè)的長度為多達(dá)55個(gè)、多達(dá)50個(gè)、多達(dá)45個(gè)、多達(dá)40[0053]在一些更為具體的實(shí)施方案中，核酸或mRNA可特別用于轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞并且作為工具用于呈遞抗原，待呈遞抗原對應(yīng)于mRNA表達(dá)的肽或蛋白質(zhì)；抗原呈遞細(xì)胞可以用于[0054]在某些實(shí)施方式中，所述抗原或其功能片段包括但不限于腫瘤新生抗原(Tumorneoantigen)、腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associatedantigen)、腫瘤特異性抗原(Tumor-specificantigens)、通用腫瘤突變位點(diǎn)抗原(Universaltumormutationsite[0055]在某些具體實(shí)施方案中，“肽或蛋白質(zhì)”包括作為抗原的肽和蛋質(zhì)在對象中引發(fā)免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答可以是預(yù)防性或治療性的或者是部分或完全保護(hù)性[0056]在某些具體實(shí)施方案中，將編碼抗原例如腫瘤相關(guān)抗原的RNA,尤其mRNA施用于哺乳動(dòng)物，特別地如果期望治療患有涉及該抗原的疾病的哺乳動(dòng)物的話。RNA,尤其mRNA被攝入到哺乳動(dòng)物的抗原呈遞細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞或其他細(xì)胞)中。形成RNA,尤其mRNA的抗原性翻譯產(chǎn)物并且該產(chǎn)物被展示在細(xì)胞表面上以被T細(xì)胞識別。[0057]在某些具體實(shí)施方案中，抗原被展示在細(xì)胞表面上以被針對該抗原的CAR改造T細(xì)胞識別。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原或通過其任選加工產(chǎn)生的產(chǎn)物在MHC分子的背景下被展示在細(xì)胞表面上進(jìn)而被T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體而識別。[0058]在某些具體的實(shí)施方案中，將表達(dá)抗原的RNA,尤其mRNA引入離體抗原呈遞細(xì)胞(例如從患者獲取的抗原呈遞細(xì)胞)中，并將抗原呈遞細(xì)胞、任選地離體克隆增殖的抗原呈遞細(xì)胞移植回同一患者體內(nèi)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)、腔內(nèi)、腹膜內(nèi)或瘤內(nèi)施用以無菌形式將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重新引入患者體內(nèi)。[0059]在某些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以涉及用于表達(dá)編碼抗原的RNA,尤其呈遞細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)中。對于抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染，可以8他抗原呈遞細(xì)胞的遞送載劑可以被施用于患者，在體內(nèi)完成轉(zhuǎn)染。[0060]本申請中應(yīng)用了具體實(shí)施例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。[0064](1)將抗原氨基酸序列用間隔肽序列串聯(lián)，經(jīng)密碼子優(yōu)化為核苷酸序列構(gòu)建mRNA大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，37℃220rpm搖菌16h后用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。[0065](2)將質(zhì)粒加入到SpeI-HF限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系中，37℃孵育酶切30-60min。采用DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行線性化質(zhì)粒的純化，獲得線性化質(zhì)粒沉淀，加入滅菌注射用水溶轉(zhuǎn)錄酶和帽子類似物等組分，混勻后37℃孵育2h。反應(yīng)結(jié)束后37℃下用DNaseI孵育15min,得mRNA沉淀，用70%乙醇溶液洗滌沉淀，后用滅菌注射用水溶解，獲得mRNA(A146和對照[0067]表1:實(shí)施例中所涉及的CN120209073A說明書7/10頁9相關(guān)序列MRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVPLKWVVVGADGVGKPLKWVVVGVGKPLKWVVVGACGVGKPLKWELAGIGILTVPLKWSLLMWITQCPLKWNVPVPLKWSLLQHLIGLPLKWVLDGLDVLLPLKWSIINATGAGGGCCCTGTGGGTCCTGGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGACATTTGGCGTGAGGGCCGATGATGAGGTGGATGTGCCTCTGAAGTGGGTTGTGGCGACGGCGTGGGCAAGCCTCTGAAGTGGGTGGTGGTCGGAGCCGGGAAAACCTCTGAAGTGGGTGGTGGTGGGCGCTTGTGGCGTGGGCATAAGTGGGAACTGGCCGGCATTGGCATCCTGACCGTGCCTCTGAAGTGCTGATGTGGATCACACAGTGCCCTCTGAAGTGGAATCTGAACTGCTGCCCGTGCCACTGAAGTGGTCTCTGCTGCAGCACCTGATCGGCCTGCATGGGTCCTGGATGGCCTGGACGTGCTGCTCCCCCTGAAATGGTCCATCATMRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVRDKRVVVGADGVGKRDKRVVVGVGKRDKRVVVGACGVGKRDKRELAGIGILTVRDKRSLLMWITQCRDKRNVPVRDKRSLLQHLIGLRDKRVLDGLDVLLRDKRSIINATGAGGGCCCTGTGGGTCCTGGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGACATTTGGCGTGAGGGCCGATGATGAGGTGGATGTGAGAGACAAAAGAGTGGTGCCGACGGCGTGGGCAAGAGGGACAAGCGCGTGGTGGTCGGAGCCTGGCAAAAGAGACAAGAGAGTGGTCGTGGGCGCTTGTGGCGTGGGGATAAGCGGGAACTGGCCGGCATTGGCATCCTGACAGTGCGGGACACCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCAGAGATAAGCGGAACCTGAATCGTGCCTGTGCGGGACAAGAGATCTCTGCTCCAGCACCTGATCGGATAAGAGAGTGCTGGATGGCCTGGACGTGCTGCTGCGGGACAAGAGAAGCMRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVGGFGVVVGADGVGKGGFGVGKGGFGVVVGACGVGKGGFGELAGIGILTVGGFGSLLMWITOCGGFGNLNVPVGGFGSLLQHLIGLGGFGVLDGATGAGGGCCCTGTGGGTCCTGGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGACATTTGGCGTGAGGGCCGATGATGAGGTGGATGTGGGCGGCTTCGGCGTCGTGGCGACGGCGTGGGCAAGGGCGGCTTCGGCGTGGTGGTCGGAGCCGGGCAAGGGCGGCTTCGGCGTGGTGGTGGGCGCTTGTGGCGTGGGAGATTCGGAGAACTGGCCGGCATTGGCATCCTGACAGTGGGCGGATTCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCGGCGGATTTGGAAATCTGAACTGTGCCTGTGGGCGGCTTCGGTTCCCTGCTCCAGCACCTGATCGGCCTTTTGGCGTTCTGGATGGCCTGGACGTGCTGCTGGGCGGATTCGGCTCT[0070]1.2DC細(xì)胞培養(yǎng)和促成熟[0071](1)iDC細(xì)胞(Immaturedendriticcell)復(fù)蘇：從液氮罐中取出iDC細(xì)胞于37℃水浴鍋中，直至凍存液完全融化。吸取一定體積的AIM-V培養(yǎng)基(賽默飛)到離心管中，打開凍根據(jù)檢測結(jié)果，補(bǔ)充相應(yīng)培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至1.00E+06cells/mL。[0073](3)分裝準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)：將細(xì)胞懸液混勻后，分裝到培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記相應(yīng)編號后放入37.0℃,5.0%的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，收集mDC細(xì)胞(maturedendritic[0074]1.3電轉(zhuǎn)工藝細(xì)胞凍存[0075](1)用于電轉(zhuǎn)的mRNA為上述A146和對照A144、A148,所有mRNA除編碼區(qū)間隔肽(linker)元件序列不同外，其余序列均相同。每組mRNA的電轉(zhuǎn)劑量為100μg,電轉(zhuǎn)體系總體積為300μL,配置好的電轉(zhuǎn)體系轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，利用細(xì)胞電轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)。[0076](2)電轉(zhuǎn)后，用培養(yǎng)基稀釋電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度到1.00E+06cells/mL,稀釋好的細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞平板中，放置到37.0℃,5.0%的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液分裝至凍存管中并置于液氮庫保存?zhèn)溆谩0078]實(shí)施例2:DC細(xì)胞刺激Jurkat細(xì)胞抗原提呈能力檢測[0079]實(shí)驗(yàn)原理：Jurkat報(bào)告細(xì)胞是表達(dá)報(bào)告基因的穩(wěn)定Jurkat細(xì)胞系。報(bào)告基因載體孵育，當(dāng)抗原呈遞表面呈遞特異性抗原時(shí)，Jurkat細(xì)胞表面特異性TCR與相應(yīng)抗原結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子被激活并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)下游GFP報(bào)告基因的表達(dá)，Jurkat細(xì)胞GFP陽性率與GFP表達(dá)量與樹突狀細(xì)胞表面呈遞抗原量成正相關(guān)，從而可以精準(zhǔn)定量樹突狀細(xì)胞表面呈遞的抗原量。[0080](1)DC細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮庫取出電轉(zhuǎn)后凍存的細(xì)胞于37℃水浴鍋中，直至凍存液完全融化。吸取一定體積的AIM-V培養(yǎng)基到離心管中，打開凍存管蓋子，將凍存管中的iDC細(xì)胞[0081](2)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果取出實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，600rcf,室溫離心5min;棄除上清，根據(jù)各組的實(shí)驗(yàn)組數(shù)分別加入對應(yīng)體積的1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后備用。剩余DC補(bǔ)充相應(yīng)培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至1*10?cells/mL,放置到37.0℃,5.0%的CO?培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。11Jurkat細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別取出一定量的不同表位類型的Jurkat細(xì)胞懸液，1000rpm,[0083](4)共培養(yǎng)(Co-culture)5*10?細(xì)胞懸液加入96孔板混勻；陽性對照組除加DC細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞各5*10?以外，每孔還需加4μg對應(yīng)表位的抗原肽；陰性對照組每孔只加1