ICSCCS07.080CAVT/CAS體標(biāo)準(zhǔn)SelectionofEggBasedSeasonalInfluenzaRepresentativeI 32規(guī)范性引用文件 33術(shù)語和定義 34縮略語 35疫苗候選代表株基本要求 45.1基本信息 45.2分離培養(yǎng)基質(zhì) 45.3活性和傳代史信息 45.4單一毒株培養(yǎng)物 45.5同源臨床樣本細(xì)胞分離株 46疫苗候選代表株的抗原性 46.1疫苗相似株的抗原性 46.2新變異疫苗候選代表株的抗原性 46.3疫苗候選代表株與同源樣本細(xì)胞分離株抗原性相似 57疫苗候選代表株基因特性 57.1疫苗相似株基因特性 57.2新變異疫苗候選代表株基因特性 57.3疫苗候選代表株序列單一 58疫苗候選代表株生長特性 58.1HA滴度 58.2HA蛋白產(chǎn)量 59疫苗候選代表株篩選原則 5附錄A（資料性）雙向血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)示例 附錄B（規(guī)范性）疫苗候選代表株篩選原則 7 8T/CAV023—2025T/CAS1054—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提出。本文件由中國疫苗行業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布?xì)w口。本文件起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、中國食品藥品檢定研究院、湖北省疾病預(yù)防控制中心、山東省疾病預(yù)防控制中心、廣東省疾病預(yù)防控制中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心、四川省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防控制中心、河南省疾病預(yù)防控制中心、安徽省疾病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心、中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心。本文件主要起草人：辛麗、王大燕、韓俊、白紅巖、黃維娟、唐靜、李希妍、黃維金、成艷輝、隗合江、曾曉旭、楊磊、董婕、劉佳、劉倜、劉琳琳、潘明、茅海燕、李柏生、滕崢、雷霞、趙雪、趙升、郭前方、王鵬、孫林、肖寧。3季節(jié)性流感病毒蛋基疫苗候選代表株篩選本文件規(guī)定了季節(jié)性流感病毒蛋基疫苗候選代表株篩選原則，明確了疫苗候選代表株分離培養(yǎng)基質(zhì)和生長特性評(píng)價(jià)技術(shù)細(xì)節(jié)，細(xì)化了抗原性和基因特性的篩選標(biāo)準(zhǔn)。本文件適用于全國疾控系統(tǒng)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，指導(dǎo)流感監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)工作人員開展臨床樣本的分離培養(yǎng)和鑒定、疫苗候選代表株的篩選和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，規(guī)范季節(jié)性流感病毒蛋基疫苗候選代表株的篩選標(biāo)準(zhǔn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS285流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)全國流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1疫苗候選代表株representativevaccinecandidatevirus經(jīng)篩選擬用于制備下一個(gè)季節(jié)性流感流行季重配疫苗株的野生型親本毒株，預(yù)期為下一流感流行季流行代表株。3.2候選疫苗株candidatevaccinevirus經(jīng)過基因重配構(gòu)建、被WHO推薦、可用于疫苗企業(yè)生產(chǎn)的雞胚高產(chǎn)重配疫苗株。3.3雞胚分離株eggpropagatedvirus臨床樣本經(jīng)雞胚分離培養(yǎng)且能夠在雞胚中持續(xù)傳代的流感病毒分離株，為野生型毒株。3.4細(xì)胞分離株cellpropagatedvirus臨床樣本經(jīng)MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)且在細(xì)胞中能夠持續(xù)傳代的流感病毒分離株，為野生型毒株。3.5HA滴度hemagglutinationtiter紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)判定的病毒滴度。3.6HI滴度hemagglutinationinhibitiontiter血凝抑制試驗(yàn)判定的抗體滴度4縮略語下列縮略語適用于本文件。HA：血凝素（Hemagglutinin）HI：血凝抑制（HemagglutinationInhibition）HPLC：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography）MDCK：馬丁-達(dá)比犬腎（MadinDarbyCanineKidney）NA：神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase）4T/CAV023—2025T/CAS1054—2025NGS：下一代測(cè)序技術(shù)（NextGenerationSequencing）RealtimeRT-PCR：實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RealtimeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）SPF：無特定病原體（SpecificPathogenFree）WHO：世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization）5疫苗候選代表株基本要求5.1基本信息疫苗候選代表株基本信息完整，包括但不限于毒株名稱、病例流行病學(xué)基本信息（病例發(fā)病時(shí)間、樣本采集時(shí)間、現(xiàn)住址、年齡、性別等）、毒株分離培養(yǎng)時(shí)間和毒株分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室信息等。5.2分離培養(yǎng)基質(zhì)5.2.1蛋基疫苗候選代表株應(yīng)采用SPF雞胚作為基質(zhì)進(jìn)行毒株培養(yǎng)，且毒株的分離及后續(xù)傳代培養(yǎng)均須在SPF雞胚中完成。5.2.2病毒分離培養(yǎng)方法參考《全國流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》和WS285流感病毒雞胚分離培養(yǎng)方法。5.3活性和傳代史信息5.3.1疫苗候選代表株應(yīng)具有生長、繁殖活性并可持續(xù)在SPF雞胚內(nèi)傳代培養(yǎng)，且傳代史明確、可溯源。5.3.2在同等6、7、8條目條件下，應(yīng)選擇雞胚內(nèi)傳代代次較少的毒株作為蛋基疫苗候選代表株。5.4單一毒株培養(yǎng)物5.4.1疫苗候選代表株應(yīng)是單一流感毒株培養(yǎng)物，無外源因子污染，包括其他亞型/譜系流感病毒或同亞型/譜系中其他毒株的污染。5.4.2其他亞型/譜系流感病毒污染，可通過RealtimeRT-PCR的方法排除，具體實(shí)驗(yàn)方法參考《全國流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》和WS285流感病毒核酸檢測(cè)；同亞型/譜系中其他毒株污染，可通過NGS測(cè)序排除，具體實(shí)驗(yàn)方法參考《全國流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》流感病毒基因組測(cè)序。5.5同源臨床樣本細(xì)胞分離株5.5.1應(yīng)存在與蛋基疫苗候選代表株配對(duì)的、源自同一份臨床樣本的MDCK細(xì)胞分離株，用于抗原分析和鑒定。5.5.2若同源臨床樣本MDCK細(xì)胞分離株未能成功分離培養(yǎng)，且無其他可替代的蛋基疫苗候選代表株，可選擇與該候選代表株抗原性和基因特性相同的細(xì)胞分離株作為蛋基疫苗候選代表株的配對(duì)毒株，用于抗原分析和鑒定。6疫苗候選代表株的抗原性6.1疫苗相似株的抗原性6.1.1為提高候選疫苗株產(chǎn)量等目的，制備疫苗原型毒株抗原性類似的候選疫苗株時(shí)，可選擇與疫苗原型毒株抗原性類似的毒株作為疫苗候選代表株。6.1.2疫苗相似株與WHO推薦的疫苗原型毒株抗原性一致，即疫苗相似株對(duì)疫苗原型毒株免疫雪貂血清的HI滴度與疫苗原型毒株自身HI滴度一致或僅發(fā)生4倍及以內(nèi)降低。6.2新變異疫苗候選代表株的抗原性6.2.1新變異疫苗候選代表株是潛在的下一季流感疫苗株，可作為疫苗候選代表株用于候選疫苗株重配。6.2.2當(dāng)新變異疫苗候選代表株與WHO推薦的疫苗原型毒株之間存在抗原差異，即新變異疫苗候選代5表株對(duì)疫苗原型毒株免疫雪貂血清的HI滴度較疫苗原型毒株自身HI滴度降低8倍及以上時(shí)，可判定該毒株發(fā)生了新的抗原變異。6.3疫苗候選代表株與同源樣本細(xì)胞分離株抗原性相似6.3.1為了確保疫苗候選代表株在雞胚傳代過程中不發(fā)生或較少發(fā)生可改變抗原性的突變，疫苗候選代表株應(yīng)滿足同一樣本的雞胚分離株與細(xì)胞分離株的雙向HI滴度差異小于等于2倍。雙向血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果示例參見附錄A。6.3.2在特殊情況下，若無法滿足6.3.1條目要求（如H3N2亞型流感病毒因發(fā)生雞胚適應(yīng)性突變而改變抗原性），疫苗候選代表株可選擇同一樣本雞胚分離株與細(xì)胞分離株的雙向HI滴度差異小于等于4倍的毒株。雙向HI檢測(cè)結(jié)果示例參見附錄A。7疫苗候選代表株基因特性7.1疫苗相似株基因特性7.1.1篩選現(xiàn)有疫苗相似株作為疫苗候選代表株時(shí)，除滿足6.1條目關(guān)于疫苗相似株抗原性的要求外，還需要符合相似株基因特性要求。7.1.2毒株經(jīng)過基因測(cè)序和進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示HA基因與疫苗原型毒株的HA基因位于同一進(jìn)化分支，且無重要抗原位點(diǎn)的突變。7.2新變異疫苗候選代表株基因特性7.2.1篩選新變異毒株作為疫苗候選代表株時(shí)，需新變異毒株的抗原性和/或基因特性與疫苗原型毒株相異。7.2.2毒株經(jīng)過基因測(cè)序和進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示HA基因與疫苗原型毒株的HA基因不在同一進(jìn)化分支，或發(fā)生重要抗原位點(diǎn)的突變。7.3疫苗候選代表株序列單一7.3.1疫苗候選代表株經(jīng)NGS測(cè)序的最低覆蓋深度不小于30X，測(cè)序結(jié)果顯示所有基因片段單一無雜合片段，且表面基因HA和NA上單個(gè)位點(diǎn)的堿基變異頻率小于10%。7.3.2若發(fā)現(xiàn)毒株基因片段存在雜合或表面基因HA和NA上存在雜合位點(diǎn)，可使用有限稀釋試驗(yàn)或空斑試驗(yàn)純化。8疫苗候選代表株生長特性8.1HA滴度8.1.1選擇合適的紅細(xì)胞滴定HA滴度，HA滴度應(yīng)不小于8。8.1.2若有多株雞胚分離株可供選擇，篩選傳代培養(yǎng)后HA滴度較高的雞胚分離株作為蛋基疫苗候選代表株。HA滴定方法參考《全國流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》和WS285紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。8.2HA蛋白產(chǎn)量當(dāng)多株雞胚分離株HA滴度相同時(shí)，可使用HPLC測(cè)定和比較HA蛋白的相對(duì)產(chǎn)量，篩選HA產(chǎn)量較高的毒株作為疫苗候選代表株。9疫苗候選代表株篩選原則基于本標(biāo)準(zhǔn)5-8條目的技術(shù)要求，疫苗候選代表株的篩選原則分為必要原則和補(bǔ)充原則，其具體分類及優(yōu)先順序詳見附錄B。依據(jù)疫苗候選代表株篩選原則的優(yōu)先順序和重要程度，將優(yōu)先等級(jí)分為A、B、C、D、E五個(gè)等級(jí)。A和B為必要原則，是疫苗候選代表株必須滿足的基本要求。C、D、E為補(bǔ)充原則，在多株疫苗候選代表株滿足必要原則時(shí)，根據(jù)補(bǔ)充原則進(jìn)一步篩選，篩選過程應(yīng)依據(jù)C～D～E的優(yōu)先等級(jí)順序開展。6T/CAV023—2025T/CAS1054—2025雙向血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)示例病毒A雞胚分離株免疫雪貂血清病毒A細(xì)胞分離株免疫雪貂血清病毒B雞胚分離株免疫雪貂血清病毒B細(xì)胞分離株免疫雪貂血清病毒C雞胚分離株免疫雪貂血清病毒C細(xì)胞分離株免疫雪貂血清病毒A雞胚分640////病毒A細(xì)胞分////病毒B雞胚分//640//病毒B細(xì)胞分////病毒C雞胚分////病毒C細(xì)胞分////結(jié)果解讀：病毒A：使用病毒A雞胚分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒A雞胚分離株的HI滴度為640，病毒A細(xì)胞分離株的HI滴度（320）較雞胚分離株HI滴度發(fā)生2倍降低；使用病毒A細(xì)胞分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒A細(xì)胞分離株的HI滴度為1280，病毒A雞胚分離株的HI滴度（640）較細(xì)胞分離株發(fā)生2倍降低。此時(shí)，病毒A的雙向HI滴度存在2倍差異。病毒B：使用病毒B雞胚分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒B雞胚分離株的HI滴度為640，病毒B細(xì)胞分離株的HI滴度（160）較雞胚分離株HI滴度發(fā)生4倍降低；使用病毒B細(xì)胞分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒B細(xì)胞分離株的HI滴度為1280，病毒B雞胚分離株的HI滴度（640）較細(xì)胞分離株發(fā)生2倍降低。此時(shí)，病毒B的雙向HI滴度存在4倍差異。病毒C：使用病毒C雞胚分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒C雞胚分離株的HI滴度為640，病毒C細(xì)胞分離株的HI滴度（80）較雞胚分離株HI滴度發(fā)生8倍降低；使用病毒C細(xì)胞分離株免疫雪貂血清開展HI檢測(cè)時(shí)，病毒C細(xì)胞分離株的HI滴度為1280，病毒C雞胚分離株的HI滴度（160）較細(xì)胞分離株發(fā)生8倍降低。此時(shí)，病毒C的雙向HI滴度存在8倍差異。疫苗候選代表株篩選原則優(yōu)先等級(jí)條目相關(guān)說明A基本信息/A分離培養(yǎng)基質(zhì)/A5.3.1活性和傳代信息/E5.3.2傳代代次要求級(jí)的條目下，仍有多株毒株可供選擇時(shí)，參考此條目篩選A單一毒株培養(yǎng)物/C5.5.1同源臨床樣本細(xì)胞分離株首選5.5.1，如若不能滿足，可選5.5.2D5.5.2非同源臨床樣本細(xì)胞分離株/B疫苗相似株抗原性6.1和6.2條目，滿足其中任意一條目B新變異疫苗候選代表株抗原性/C6.3.1疫苗候選代表株與同源樣本細(xì)胞分離株抗原性差異小于2倍首選6.3.1，若無法滿足，可選6.3.2。D6.3.2疫苗候選代表株與同源樣本細(xì)胞分離株抗原性差異小于或等/B疫苗相似株基因特性7.1和7.2，滿足其中任意一條目即可B新變異疫苗候選代表株基因特性/A表面基因無雜合位點(diǎn)需滿足7.3.1，若無法滿足，可以使用