ICS67.080.01

CCSB31

6528

巴音郭楞蒙古自治州地方標(biāo)準(zhǔn)

DB6528/T189—2023

加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范

ProcessingpeppervarietiesInDelfingerprintdatabaseconstruction

specification.

2023-08-01發(fā)布2023-08-15實施

巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB6528/T189—2023

目次

前言II

1范圍1

2規(guī)范性引用文件1

3術(shù)語和定義1

4InDel標(biāo)記鑒定程序2

5標(biāo)記類型及標(biāo)記來源2

6檢測方法2

7質(zhì)量保證2

DNA質(zhì)量2

引物序列2

酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑3

PCR擴(kuò)增反應(yīng)3

8樣品的來源及性質(zhì)3

品種來源3

樣品類型3

樣品分析數(shù)量3

9引物及流程的評估3

評估用的品種數(shù)量及名單的確定3

引物評估的取舍4

10不同來源數(shù)據(jù)的有效整合4

固定一套核心引物4

提供標(biāo)準(zhǔn)品的要求4

提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求4

確定引物等位基因BIN的要求4

異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式4

數(shù)據(jù)的編碼方式4

11構(gòu)建品種DNA指紋模式庫5

12構(gòu)建品種DNA指紋擴(kuò)展庫5

13數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的隨機(jī)盲測5

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。

本文件起草單位：新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園

藝所。

本文件主要起草人：張建文、張國儒、楊生保、唐亞萍、楊濤、李輝玲、帕提古麗·艾斯穆托拉、

火順利、董潔、葉遠(yuǎn)榮。

本文件實施應(yīng)用中的疑問，請咨詢新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

對本文件的修改意見或建議，請反饋至新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局（新疆庫爾勒市石化大

道64號小區(qū)）、新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（新疆庫爾勒市英下路巴州農(nóng)科院）、新疆維

吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所（新疆烏魯木齊市沙依巴克區(qū)新疆南昌路403號）、新疆巴音郭楞蒙

古自治州市場監(jiān)督管理局（新疆庫爾勒市延安路27-1號）。

新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院聯(lián)系電話郵編：841000

新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所聯(lián)系電話郵編：830091

新疆巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話郵編：841000

II

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加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了加工辣椒品種InDel標(biāo)記方法及標(biāo)記來源、檢測方法、質(zhì)量保證、樣品的來源及性質(zhì)、

引物及流程的評估、不同來源數(shù)據(jù)的有效整合、構(gòu)建品種DNA指紋模式庫、構(gòu)建品種DNA指紋擴(kuò)展庫、數(shù)

據(jù)庫數(shù)據(jù)的隨機(jī)盲測的要求。

本文件適用于加工辣椒品種鑒定及DNA指紋庫的建立。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

InDel標(biāo)記Insertion-deletion

根據(jù)基因組中插入缺失位點，設(shè)計一些擴(kuò)增這些插入缺失位點的PCR引物，這就InDel標(biāo)記。

DNA指紋DNAfingerprint

具有完全個體特異的DNA多態(tài)性，同個體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組

成的長度不等的雜交帶圖紋。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis

是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。

注：根據(jù)寡核苷酸的大小來分離，因此可將全長產(chǎn)物與不完整的短分子分開，適合變性蛋白的處理。

引物primer

是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延

伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3’-0H上，核苷酸以一酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的

3’-0H，必須是游離的。

核心引物coreprimers

指多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好、可作為DNA指紋鑒定優(yōu)先選用的一套引物。

注：包括基本核心引物和擴(kuò)展輔助核心引物。其中基本核心引物作為固定用于品種鑒定和建庫的引物，保證不同實

驗室數(shù)據(jù)具有可比性并可進(jìn)行數(shù)據(jù)整合。擴(kuò)展輔助核心引物相對固定，并可根據(jù)引物的最新研究結(jié)果和特殊鑒

定性狀進(jìn)行調(diào)整。

標(biāo)準(zhǔn)品種standardvariety

1

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DNA指紋庫構(gòu)建過程中作為譜帶分型的參照標(biāo)準(zhǔn)，并輔助判斷試驗的穩(wěn)定性和可靠性。

注：以一套典型的遺傳基礎(chǔ)廣泛的高度純合自交系為試材，對擬建庫的引物進(jìn)行DNA指紋分析，就可確定代表每個

引物不同譜帶的標(biāo)準(zhǔn)品種名單。

標(biāo)準(zhǔn)DNAstandardDNA

由一個實驗室統(tǒng)一按規(guī)定的DNA提取方法一次性提取足量的標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA，經(jīng)DNA指紋分析驗證其

真實的指紋帶型后統(tǒng)一發(fā)放。

4InDel標(biāo)記鑒定程序

通過設(shè)計特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳（或聚丙烯酰胺凝膠電泳）

和放射自顯影（或銀染），可檢測到在簡單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA區(qū)域的多態(tài)性。

5標(biāo)記類型及標(biāo)記來源

采用InDel標(biāo)記作為加工辣椒DNA指紋庫構(gòu)建的標(biāo)記方法。

6檢測方法

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)合銀染檢測最小分辨率可達(dá)到1bp。

7質(zhì)量保證

DNA質(zhì)量

純度要求:OD260/OD280在1.8～2.0之間。

引物序列

應(yīng)明確引物是否采用熒光標(biāo)記，如采用熒光標(biāo)記，應(yīng)明確采用何種熒光標(biāo)記以及是否采用加尾序列。

根據(jù)加工辣椒建庫的具體情況，以變性聚丙烯酰胺凝膠電泳熒光檢測系統(tǒng)的數(shù)據(jù)作為建庫的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，

并規(guī)定不同引物應(yīng)標(biāo)記的熒光類型，所有建庫標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)均是采用無加尾序列的引物獲得的。目前已

篩選的引物序列見表1：

表117對引物序列表

引物編號標(biāo)記名稱上游引物下游引物

InDel16CIDH119AGGAACTAAAAAGTGGTTTTGGGTTCACACACGTCCAACCCAAT

InDel33CIDH108ACAATCGAAGGGGAGCCTTGTCCTCTGTTTCATGATTCCGACT

InDel41CIDH116AGGAGAAAAAGAAAGAACAACCACACGAAGCCCTTCACATTAACGT

InDel63CIDH110ACTCTTGGAAGATGGGGTTCACCGAAGTAAAATAGGAAAATTGCCA

InDel88CIDH107AGCCCAATAGAAAGATTGCTCACGCTGAATTTTGAAATATTTAGTCTGG

InDel137CIDH128ACAAGGAGAAAAGGGGCCTTCTGTATCTCGGCTTAAAGGGGT

InDel146CIDH109GGAACCCGACCACCAGAAAATCGCGGGGACTATTTACCCT

Inde1172CIDH135GGTGGGACCAAAGAGAGTTTTGAACAAGCAAAAGCCAAGA

2

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表117對引物序列表（續(xù)）

引物編號標(biāo)記名稱上游引物下游引物

InDel200CIDH135ACTCACAGTCCTTAAACTTACAAAACTTGCCACTATAAATCCATCACCGA

InDel201CIDH136AGGCACCAGTTAGCTCGAAAAGCGCATCTCAATCTATGTCGA

InDel206CIDH113CCTGGAGGCTATGCACCATTATTTGCAGCCACCCAGCATA

InDel209CIDH116CGCTACGAGTGGTACCTGACTGGGGATTGCTTCATTGGTGT

InDel211CIDH118TCAGTTGTGTCCTGAACCCTACATGCAGAACAAATAGCCCT

InDel215CIDH122ACCGTTGACACTTCCATGCTAATCCCCACGTGCAGTTCAT

InDel219CIDH126CCGAGCATTGAGACCGAGTTAAGCTTTCTGATCCACCCCC

InDel228CIDH135TGACACGTGACATTCAGCGTTGACCTACAAACACACTGCTCA

InDel234CIDH113AAAAAGGGCAGCTCGGTGTAGAACCCCCTGAAGAGAAGGC

酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑

對構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫時采用的試劑指定供貨廠家及規(guī)格。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)

統(tǒng)一采用相同的反應(yīng)程序及反應(yīng)體系。

8樣品的來源及性質(zhì)

品種來源

品種來源應(yīng)可靠，建庫品種主要來自：

——新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域試驗和品種審定委員會審定的品種以及品種權(quán)保護(hù)部門保護(hù)的品

種；

——國家種質(zhì)資源庫；

——向育種單位直接征集。

樣品類型

主要包括種子或葉片。可以提供葉片等營養(yǎng)組織或提供符合要求的DNA樣品。

樣品分析數(shù)量

根據(jù)繁殖方式不同而有區(qū)別。由于加工辣椒材料具有多種繁殖方式，對完全純合的自交系材料和高

度一致的單交種材料規(guī)定每個品種分析3個～5個個體；對農(nóng)家種、綜合種、開放授粉品種、除單交種外

的其它類型雜交種（三交、雙交等），如果采用混合樣品，每個品種至少混樣3份，每份混樣至少混合

10個個體。

9引物及流程的評估

評估用的品種數(shù)量及名單的確定

3

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在控制合適的數(shù)量的情況下，材料應(yīng)具有代表性和比較廣泛的遺傳基礎(chǔ)。應(yīng)至少包括1～2套遺傳上

或形態(tài)上極為相似的材料以評估引物對近似品種的區(qū)分能力。

引物評估的取舍

10不同來源數(shù)據(jù)的有效整合

不同來源DNA指紋數(shù)據(jù)的有效整合問題是DNA指紋庫構(gòu)建過程中的重點，為了解決這一難題，通過對

大量的研究進(jìn)行總結(jié)歸納，提出以下幾種解決策略，這些策略可以結(jié)合起來進(jìn)行。

固定一套核心引物

17對引物作為構(gòu)建加工辣椒DNA指紋數(shù)據(jù)庫用的基本核心引物。

提供標(biāo)準(zhǔn)品的要求

標(biāo)準(zhǔn)品的要求如下：

——除了少數(shù)稀有譜帶類型不易找到標(biāo)準(zhǔn)品種時選用特殊自交系外，宜盡量選用國內(nèi)外已知的

常用自交系為標(biāo)準(zhǔn)品種；

——標(biāo)準(zhǔn)品種應(yīng)純合；

——標(biāo)準(zhǔn)品種應(yīng)容易擴(kuò)繁保種；

——標(biāo)準(zhǔn)品種由指定的單位統(tǒng)一擴(kuò)繁保種，統(tǒng)一發(fā)放；

——宜盡量用較少的品種代表較多種譜帶類型。

提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求

提供標(biāo)準(zhǔn)DNA的要求如下：

——DNA質(zhì)量符合要求，純度高，OD260/OD280在1.8～2.0之間；

——DNA經(jīng)過指紋分析反復(fù)驗證，證明能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出預(yù)期大小的譜帶；

——同一批次提取的DNA量要大，大于或等50ug。

確定引物等位基因BIN的要求

確定引物等位基因BIN的要求如下：

——應(yīng)包括主要的等位基因；

——如果稀有等位基因也包括在內(nèi)的話，應(yīng)標(biāo)注其為突變型；

——每個等位基因根據(jù)其表現(xiàn)特征，確定其擴(kuò)增片段大小的區(qū)間范圍。

異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式

異常帶型主要包括：稀有帶型、零帶型、弱帶型、缺失帶型等。

——對稀有帶型應(yīng)如實記錄，但應(yīng)標(biāo)注其為稀有帶型；

——對零帶型應(yīng)盡量避免，如果某引物出現(xiàn)的零帶型比率較高（＞5%），則該引物應(yīng)剔除；

——對弱帶型及缺失帶型應(yīng)盡可能通過重新擴(kuò)增將數(shù)據(jù)補(bǔ)齊。

數(shù)據(jù)的編碼方式

主要有3種：

4

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——根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對位置，確定不同的譜帶類型，并按擴(kuò)增片段從大到小的

順序編號。適用于儀器不具有直接讀取片段大小的功能的情況；

——根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，直接記錄不同譜帶片段大小。適用于儀器具有直接讀取片段大

小的功能且同一多態(tài)性位點上采用的引物固定的情況；

——將同一多態(tài)性位點設(shè)計的不同引物獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合。適用于在同一多態(tài)性位點同時設(shè)

計并使用了多個不同引物進(jìn)行數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的情況。數(shù)據(jù)整合采取如下兩種方案：