QB/TXXXXX—XXXX

乳制品中乳糖的測定核磁共振波譜法

1范圍

本文件描述了乳制品中乳糖含量的核磁共振波譜檢測方法。

本文件適用于液體乳、奶片、奶酪、乳粉中乳糖的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

JY/T0578超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測試方法通則

JJF1448超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀校準規(guī)范

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4原理

在合適的測試條件下，一維核磁共振波譜峰面積與樣品中所對應的自旋核的數(shù)目成正比，同時，基

于核磁共振信號強度（峰面積）互易原理，即給定線圈中核磁共振信號強度與90°脈沖寬度成反比，分

別測定外標參考物質和待測樣品的一維核磁共振氫譜（1HNMR）及90°脈沖寬度，外標法測定樣品中乳

糖的含量。

5試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

試劑

5.1.1重水（D2O）：純度≥99.8%。

5.1.23-（三甲基硅烷基）氘代丙酸鈉[(CH3)3SiCD2CD2CO2Na，TSP-d4]。

5.1.3疊氮化鈉（NaN3）。

5.1.4濃鹽酸（HCl）。

5.1.5氫氧化鈉（NaOH）。

溶液配制

5.2.1TSP-d4重水溶液（10g/L）：稱取TSP-d4（5.1.2）0.5g（精確至0.1mg）和疊氮化鈉（5.1.3）5

mg（精確至0.1mg），用重水（5.1.1）溶解后，轉移至50mL容量瓶中，定容至刻度。

5.2.2鹽酸（2mol/L）：量取濃鹽酸（5.1.4）16.8mL，用水稀釋并定容至100mL，臨用現(xiàn)配。

5.2.3氫氧化鈉溶液（2mol/L)：稱取氫氧化鈉（5.1.5）40g（精確至1mg），用水溶解后，轉移至

500mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。

標準品

5.3.1檸檬酸（C?H?O?，CAS號：77-92-9）純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準品。

5.3.2乳糖（C12H22O11，CAS號：63-42-3）純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準品。

標準溶液配制

2

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5.4.1檸檬酸外標溶液（2g/L）：準確稱取檸檬酸（5.3.1）0.20g（精確至0.1mg），用水溶解后，

轉移至100mL容量瓶中，定容至刻度。于4℃冰箱密封保存，有效期1個月。

5.4.2乳糖標準儲備液（51.2g/L）：準確稱取乳糖（5.3.2）5.12g（精確至1mg），用水溶解后，轉

移至100mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。

5.4.3乳糖系列標準工作液：準確量取乳糖標準儲備液（5.4.2）5mL于10mL容量瓶中，用水定容至

刻度，搖勻后得到25.6g/L的乳糖標準溶液。使用以上相同方法，分別得到12.8g/L、6.4g/L、3.2g/L、

1.6g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L乳糖標準工作液。可根據(jù)樣品中乳糖含量適當調

整乳糖標準工作液濃度范圍及乳糖標準儲備液濃度。

6儀器設備

核磁共振波譜儀：氫（1H）共振頻率不低于400MHz；控溫精度不低于±0.1K。應按照JJF1448

的規(guī)定對1H譜靈敏度、1H譜分辨力、1H譜線型、1H譜定量重復性進行校準。

核磁共振樣品管：外徑5mm，同心且均勻；或由核磁共振波譜儀廠商提供、指定樣品管。

分析天平：感量為0.1mg和1mg。

磁力攪拌器。

pH計：分辨力為0.01。

移液器：量程為10μL~100μL和100μL~1000μL。

濾膜：0.45μm水相膜。

離心機：轉速≥8000r/min。

7分析步驟

上機樣品制備

7.1.1樣品處理

稱取液態(tài)樣品10.0g或固態(tài)樣品1.0g（精確至1mg）加入35mL水溶解，轉移至50mL燒杯中，于磁

力攪拌器（6.4）上攪拌30min，用鹽酸（5.2.2）或氫氧化鈉溶液（5.2.3）調pH至4.4~4.5，轉移至50mL

容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。取5mL定容后的溶液于10mL離心管中，以8000r/min離心10min，

取中間澄清溶液，使用0.45μm水相膜（6.7）過濾，取540μL濾液于核磁管中，加入60μLTSP-d4重水

溶液（5.2.1），混勻，待測。

7.1.2標準樣品配制

分別取900μL檸檬酸外標溶液（5.4.1）和乳糖系列標準工作液（5.4.3），分別加入100μLTSP-d4

重水溶液（5.2.1），渦旋振蕩1min，各取600μL分別于核磁管中，待測。

核磁共振分析參考條件

7.2.1樣品管不旋轉。

7.2.2檢測溫度：（300.0±0.1）K。

7.2.3空掃次數(shù)：4次。

7.2.4掃描次數(shù)：64次。

7.2.5譜寬：8000Hz。

7.2.6采樣點數(shù)：65536。

7.2.7接收增益：16。

7.2.8弛豫延遲時間：≥4s。

7.2.9水峰壓制脈沖序列：預飽和加相位循環(huán)。

儀器校準

必要時，按照JY/T0578的規(guī)定對探頭溫度進行校準。

核磁共振測定步驟

3

QB/TXXXXX—XXXX

7.4.1將裝有上機樣品的樣品管置于核磁共振波譜儀檢測腔內，設置樣品管不旋轉。

7.4.2設置待測樣品溫度為300.0K，測樣前應等待至少5min至儀器溫度穩(wěn)定。

7.4.3新建氫譜標準實驗文件。

7.4.4鎖場與調諧。

7.4.5勻場。

7.4.6測定樣品的90°脈沖寬度，并記錄結果。

7.4.7調用預飽和加相位循環(huán)的水峰壓制脈沖序列。

7.4.8根據(jù)前述（7.2）要求設定空掃次數(shù)、掃描次數(shù)、譜寬、采樣點數(shù)、接收增益、弛豫延遲時間，

設定90°脈沖寬度為前述測定值（7.4.6），根據(jù)水峰壓制效果優(yōu)化水峰壓制位置、壓制功率等，各樣品

測試時保持接收機增益值一致，可根據(jù)樣品濃度優(yōu)化掃描次數(shù)。

7.4.9采集核磁共振水峰壓制1H譜信號。

7.4.10保存儀器所測譜圖，并記錄儀器狀態(tài)和測量數(shù)據(jù)。

校正因子（CF）的計算

將裝有標準樣品的核磁管置于核磁共振波譜儀檢測腔內。根據(jù)前述（7.2）要求設定儀器條件，根

據(jù)前述（7.4）步驟進行測定。測得樣品和外標的定量峰積分面積和積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量，用計

算所得上機樣品中乳糖的質量濃度為橫坐標，乳糖系列標準工作液（5.4.3）濃度為縱坐標，繪制線性回

歸方程y=ɑx+β，以線性回歸方程的斜率ɑ作為校正因子（CF）。

樣品的測定

將裝有待測樣品的核磁管置于核磁共振波譜儀檢測腔內。根據(jù)前述（7.2）要求設定儀器條件，根

據(jù)前述（7.4）步驟進行操作。測得樣品和外標的定量峰積分面積和積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量，根據(jù)

校正因子（CF）計算得到待測樣品中乳糖的濃度。

8數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)預處理

將原始數(shù)據(jù)進行傅立葉變換、相位校正和基線校正，以TSP-d4中硅烷甲基的化學位移作為零點進行

定標。

定性分析

將乳糖和外標物檸檬酸的1HNMR譜（見附錄A）信號峰進行歸屬，得到乳糖和外標物檸檬酸的定

量相關參數(shù)（見附錄B）。

定量峰積分

根據(jù)定性分析（8.2）得到的定量相關參數(shù)，確定外標物檸檬酸和乳糖的定量峰積分面積。

9分析結果的表述

上機樣品中乳糖的濃度按式（1）計算:

=·········································(1)

????????????

式中：????×??×??×??×??×??×??

cs——上機樣品中乳糖的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；

cQ——外標物檸檬酸溶液的質量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；

MQ——外標物檸檬酸的摩爾質量，MQ=192.14g/mol；

As——乳糖的定量峰積分面積；

AQ——外標物檸檬酸的定量峰積分面積；

HQ——外標物檸檬酸積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量；

4

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Hs——乳糖積分區(qū)域對應的氫原子數(shù)量；

NQ——檸檬酸外標溶液的上機掃描次數(shù)；

Ns——上機樣品的上機掃描次數(shù)；

1

Ps——上機樣品的H90°脈沖寬度；

1

PQ——外標物檸檬酸的H90°脈沖寬度；

Ts——上機樣品的檢測溫度，單位為開爾文（K）；

TQ——檸檬酸外標溶液的檢測溫度，單位為開爾文（K）；

ML——乳糖的摩爾質量，ML=342.30g/mol。

計算結果保留兩位小數(shù)。

樣品中乳糖的含量按式（2）計算:

·····················································(2)

??×?

式中：?=??×1000×CF

w——樣品中乳糖的含量，單位為克每千克（g/kg）；

cs——式（1）計算得到的乳糖濃度，單位為毫克每升（mg/L）；

V——樣品的定容體積，單位為毫升（mL）；

ms——樣品的質量，單位為克（g）；

1000——換算系數(shù);

CF——校正因子。

計算結果保留一位小數(shù)。

10精密度

在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算術平均值的10%。

11其他

當樣品為固體，本方法的檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；當樣品為液體，本方法的檢出限為

0.03g/kg，定量限為0.1g/kg。

5

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附錄A

（資料性）

乳糖和外標物檸檬酸1HNMR譜圖

乳糖的1HNMR譜圖見圖A.1；外標物檸檬酸的1HNMR譜圖見圖A.2。

標引序號說明：

1——乳糖的定量峰。

圖A.1乳糖1HNMR譜圖

標引序號說明：

1、3，2、4——外標物檸檬酸的定量峰。

圖A.2外標物檸檬酸1HNMR譜圖

B

A

C

B

6

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附錄B

（資料性）

乳糖和外標物檸檬酸核磁共振定量相關參數(shù)

乳糖和外標物檸檬酸的核磁共振定量相關參數(shù)見表B.1。

表B.1乳糖和外標物檸檬酸的核磁共振定量相關參數(shù)

化合物摩爾質量/δ（1H）（峰形，耦合常數(shù)）氫原子數(shù)量積分區(qū)域/Δδ檢測溫度/K

g·mol-1

乳糖342.304.45（d,J=7.8Hz)14.359~4.503

300.0

3.01（d,J=15.7Hz）22.921~3.143

檸檬酸192.14

2.84（d,J=15.7Hz）22.693~2.916

7

ICS67.050

CCSX04

QB

中華人民共和國輕工行業(yè)標準

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乳制品中乳糖的測定核磁共振波譜法

Determinationoflactoseindairyproducts—Nuclearmagneticresonance

spectroscopy

（報批稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中華人民共和國工業(yè)和信息化部??發(fā)布

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乳制品中乳糖的測定核磁共振波譜法

1范圍

本文件描述了乳制品中乳糖含量的核磁共振波譜檢測方法。

本文件適用于液體乳、奶片、奶酪、乳粉中乳糖的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

JY/T0578超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測試方法通則

JJF1448超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀校準規(guī)范

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4原理

在合適的測試條件下，一維核磁共振波譜峰面積與樣品中所對應的自旋核的數(shù)目成正比，同時，基

于核磁共振信號強度（峰面積）互易原理，即給定線圈中核磁共振信號強度與90°脈沖寬度成反比，分

別測定外標參考物質和待測樣品的一維核磁共振氫譜（1HNMR）及90°脈沖寬度，外標法測定樣品中乳

糖的含量。

5試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

試劑

5.1.1重水（D2O）：純度≥99.8%。

5.1.23-（三甲基硅烷基）氘代丙酸鈉[(CH3)3SiCD2CD2CO2Na，TSP-d4]。

5.1.3疊氮化鈉（NaN3）。

5.1.4濃鹽酸（HCl）。

5.1.5氫氧化鈉（NaOH）。

溶液配制

5.2.1TSP-d4重水溶液（10g/L）：稱取TSP-d4（5.1.2）0.5g（精確至0.1mg）和疊氮化鈉（5.1.3）5

mg（精確至0.1mg），用重水（5.1.1）溶解后，轉移至50mL容量瓶中，定容至刻度。

5.2.2鹽酸（2mol/L）：量取濃鹽酸（5.1.4）16.8mL，用水稀釋并定容至100mL，臨用現(xiàn)配。

5.2.3氫氧化鈉溶液（2mol/L)：稱取氫氧化鈉（5.1.5）40g（精確至1mg），用水溶解后，轉移至

500mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。

標準品

5.3.1檸檬酸（C?H?O?，CAS號：77-92-9）純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準品。

5.3.2乳糖（C12H22O11，CAS號：63-42-3）純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標準物質證書的標準品。

標準溶液配制

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5.4.1檸檬酸外標溶液（2g/L）：準確稱取檸檬酸（5.3.1）0.20g（精確至0.1mg），用水溶解后，

轉移至100mL容量瓶中，定容至刻度。于4℃冰箱密封保存，有效期1個月。

5.4.2乳糖標準儲備液（51.2g/L）：準確稱取乳糖（5.3.2）5.12g（精確至1mg），用水溶解后，轉

移至100mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。

5.4.3乳糖系列標準工作液：準確量取乳糖標準儲備液（5.4.2）5mL于10mL容量瓶中，用水定容至

刻度，搖勻后得到25.6g/L的乳糖標準溶液。使用以上相同方法，分別得到12.8g/L、6.4g/L、3.2g/L、

1.6g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L乳糖標準工作液?？筛鶕?jù)樣品中乳糖含量適當調

整乳糖標準工作液濃度范圍及乳糖標準儲備液濃度。

6儀器設備

核磁共振波譜儀：氫（1H）共振頻率不低于400MHz；控溫精度不低于±0.1K。應按照JJF1448

的規(guī)定對1H譜靈敏度、1H譜分辨力、1H譜線型、1H譜定量重復性進行校準。

核磁共振樣品管：外徑5mm，同心且均勻；或由核磁共振波譜儀廠商提供、指定樣品管。

分析天平：感量為0.1mg和1mg。

磁力攪拌器。

pH計：分辨力為0.01。

移液器：量程為10μL~100μL和100μL~1000μL。

濾膜：0.45μm水相膜。

離心機：轉速≥8000r/min。

7分析步驟

上機樣品制備

7.1.1樣品處理

稱取液態(tài)樣品10.0g或固態(tài)樣品1.0g（精確至1mg）加入35mL水溶解，轉移至50mL燒杯中，于磁

力攪拌器（6.4）上攪拌30min，用鹽酸（5.2.2）或氫氧化鈉溶液（5.2.3）調pH至4.4~4.5，轉移至50mL

容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。取5mL定容后的溶液于10mL離心管中，以8000r/min離心10min，

取中間澄清溶液，使用0.45μm水相膜（6.7）過濾，取540μL濾液于核磁管中，加入60μLTSP-d4重水

溶液（5.2.1），混勻，待測。

7.1.2標準樣品配制

分別取900μL檸檬酸外標溶液（5.4.1）和乳糖系列標準工作液（5.4.3），分別加入100μLTSP-d4

重水溶液（5.2.1），渦旋振蕩1min，各取600μL分別于核磁管中，待測。

核磁共振分析參考條件

7.2.1樣品管不旋轉。

7.2.2檢測溫度：（300.0±0.1）K。

7.2.3空掃次數(shù)：4次。

7.2.4掃描次數(shù)：64次。

7.2.5譜寬：8000Hz。

7.2.6采樣點數(shù)：65536。

7.2.7接收增益：16。

7.2.8弛豫延遲時間：≥4s。

7.2.9水峰壓制脈沖序列：預飽和加相位循環(huán)。

儀器校準

必要時，按照JY/T0578的規(guī)定對探頭溫度進行校準。

核磁共振測定步驟

3

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7.4.1將裝有上機樣品的樣品管置于核磁共振波譜儀檢測腔內，設置樣品管不旋轉。

7.4.2設置待測樣品溫度為300.0K，測樣前應等待至少5min至儀器溫度穩(wěn)定。

7.4.3新建氫譜標準實驗文件。

7.4.4鎖場與調諧。

7.4.5勻場。

7.4.6測定樣品的90°脈沖寬度，并記錄結果。

7.4.7調用