第五章基因組序列注釋詳解演示文稿第一頁，共88頁。優(yōu)選第五章基因組序列注釋第二頁，共88頁。<2weeks~$1,0000.010.101.0010.00100.001,000.0010,000.00100,000.00$MThroughput

(Gb)CostofperHumanGenomeInnovationofNGSthroughput3Gb6Gb20-30Gb0204060801001202402007200820092010199020012012200720100.001Moore’sLaw更低的價格使得基于測序的科研和臨床應(yīng)用越來越被接受13years~$3,000,000,000200Gb-300Gb測序技術(shù)的發(fā)展帶來測序價格的下降第三頁，共88頁。Illumina/Solexa/GIIxGeneticAnalyzer50~95GB/runIllumina/Solexa/HiSeq200GB/runRoche/454GenomeSequencerFLX500Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD4100GB/runAppliedBiosystemsSOLiD/HQ300GB/run成熟的二代測序技術(shù)平臺第四頁，共88頁。高通量測序服務(wù)未知基因組測序(Denovogenomesequencing)基因組重測序(Wholegenomeresequencing)實驗數(shù)據(jù)分析MatePair測序構(gòu)建Scaffold30X的覆蓋率

(454&(SolexaorSOLiD))序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組拼接（基于reference拼接）注釋(基因功能、代謝通路、比較基因組)SNP發(fā)現(xiàn)及注釋實驗數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率

(SolexaorSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析第五頁，共88頁。高通量測序服務(wù)外顯子捕獲測序(Targetexomecapture)全基因組甲基化測序(DNAmethylationsequencing)實驗數(shù)據(jù)分析>30X的覆蓋率

(SolexaorSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析實驗數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率(SolexaorSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）甲基化位點檢測及注釋第六頁，共88頁。高通量測序服務(wù)轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seqsequencing)microRNA測序(microRNAsequencing)實驗數(shù)據(jù)分析mRNA打斷、反轉(zhuǎn)錄、加接頭Denovo454構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜Reference

barcode建庫Solexa，SOLiD序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）表達(dá)豐度統(tǒng)計注釋(功能、代謝通路、表達(dá)差異比較)未知轉(zhuǎn)錄本的分析實驗數(shù)據(jù)分析microRNA提取、兩頭加接頭、反轉(zhuǎn)錄、建庫(SolexaorSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）已知microRNA豐度統(tǒng)計未知microRNA預(yù)測及豐度統(tǒng)計第七頁，共88頁。高通量測序服務(wù)元基因組測序(meta-genomesequencing)未知病毒檢測(Unknownvirusdetecting)實驗數(shù)據(jù)分析DNA提取、建庫序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）拼接、注釋(功能、代謝通路)豐度統(tǒng)計、比較元基因組實驗數(shù)據(jù)分析低量RNA、DNA處理、建庫與宿主、微生物、病毒數(shù)據(jù)庫比較未知病毒的發(fā)現(xiàn)及預(yù)測第八頁，共88頁。學(xué)習(xí)重點：1)基因注釋的方法2)基因功能的研究方法第九頁，共88頁。基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因？用什么方法研究基因的功能?計算機(jī)分析+實驗第十頁，共88頁。真核生物基因組的注釋蛋白質(zhì)編碼基因的注釋RNA基因的注釋重復(fù)序列的注釋假基因的注釋第十一頁，共88頁?；蚪M注釋SequenceGENESCANORFFinderGENEMARKGenePrediction…BlastnFastaHomologySearchTranscriptionRegulatoryRegionDomainIdentify(HMMER,BLIMPS)Transmembrane(TMAP,TMHMM)LocalizationSites(Psort)Physical&ChemicalPara(PI/MW,EXTCOEF)Post-translationalmodifications(NetNGlyc…)ProteinAnnotation…GeneOntologyPathwayPredictedGeneOrGene第十二頁，共88頁。第十三頁，共88頁。3.1尋找基因基因組序列查找基因。有兩種常見的方法：計算機(jī)分析尋找與基因有關(guān)的序列。通過對DNA序列進(jìn)行實驗分析，看其能否表達(dá)基因產(chǎn)物。

第十四頁，共88頁。3.1.1根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特征搜尋基因基因不是核苷酸的隨機(jī)排列而是具有明顯特征：基因的編碼區(qū)是可讀框。可能的六種ORF第十五頁，共88頁。1.根據(jù)開放讀碼框預(yù)測基因a.起始密碼子ATG：第一個ATG的確定則依據(jù)Kozak規(guī)則：Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，所謂Kozak規(guī)則，即第一個ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計規(guī)律。第十六頁，共88頁。若將第一個ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。第十七頁，共88頁。b.終止密碼子

終止密碼子:TAA,TAG,TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次；GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次；由于多數(shù)基因ORF均多于50個密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是ORF不少于100個密碼子。第十八頁，共88頁。細(xì)菌基因組的ORF閱讀相對比較簡單，錯誤的概率較少，但單純的ORF掃描對高等真核生物DNA效果不佳。內(nèi)含子使ORF掃描復(fù)雜化第十九頁，共88頁。內(nèi)含子的出現(xiàn)給計算機(jī)判讀基因帶來不少問題，對ORF掃描的基本程序的編寫要考慮以下幾個問題：1）密碼子偏倚；2）外顯子—內(nèi)含子邊界；3）上游調(diào)控序列。第二十頁，共88頁。1）密碼子偏愛性編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA，GCC或GCT，而GCG很少使用。特定種屬有特征性的密碼子偏愛，這些序列在編碼區(qū)常常出現(xiàn)，非編碼區(qū)只保持平均的堿基分布水平。第二十一頁，共88頁。上游外顯子-內(nèi)含子邊界的共有序列在真正基因中發(fā)現(xiàn)的真實序列之間的關(guān)系。2）外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征如：內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見的順序為5’-AG↓GTTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；第二十二頁，共88頁。第二十三頁，共88頁。3）上游控制順序幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。另外個別生物的基因組特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有CpG島。大多數(shù)CpG島都位于管家基因和大部分組織專一性表達(dá)基因的5’側(cè)翼區(qū)以及基因的第一個外顯子區(qū)。

第二十四頁，共88頁。

3.1.2同源基因查詢通過已存入數(shù)據(jù)庫中的基因序列與待查的基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基序列及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。第二十五頁，共88頁。同源有如下幾種情況：A.DNA序列某些片段完全相同；B.開放讀碼框排列類似，如有等長外顯子；C.開放讀碼框翻譯成的氨基酸序列的相同；D.模擬多肽高級結(jié)構(gòu)相似。第二十六頁，共88頁。

同源查詢當(dāng)在氨基酸水平進(jìn)行比較時，兩個序列之間缺少同源性就更明顯。第二十七頁，共88頁。

同源性,一致性和相似性1）同源性(homology)基因系指起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的基因成員。分布在不同物種間的同源基因又稱直向同源基因。同一物種的同源基因則稱共生同源基因（水平基因）,水平基因由重復(fù)后趨異產(chǎn)生?；蛲葱灾挥小笆恰焙汀胺恰钡膮^(qū)別,無所謂百分比.第二十八頁，共88頁。2)一致性(identity)：指同源DNA順序的同一堿基位置的相同的堿基成員,或者蛋白質(zhì)的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成員,可用百分比表示.3)相似性(similarity)：指同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例?？扇〈被嵯抵妇哂邢嗤再|(zhì)如極性氨基酸或非極性氨基酸的成員,它們之間的代換不影響蛋白質(zhì)(或酶)的生物學(xué)功能。第二十九頁，共88頁。相似性與一致性249MFN-MAIPFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG232ILTSLTLPFSAGAYAQALNQQQTTV

IS--TS

GS注:紅色為一致性氨基酸,藍(lán)色為可取代氨基酸,白色為趨異氨基酸.一致性氨基酸百分比為紅色氨基酸所占的比例,相似性氨基酸百分比為紅色和藍(lán)色氨基酸相加所占的比例.第三十頁，共88頁。基因注釋軟件1)目前基因注釋程序的編寫主要依據(jù)兩種信息內(nèi)涵:

1.signalterms(信號指令),如起始密碼,終止密碼,終止信號,剪接受體位與供體位序列,多聚嘧啶順序,分支點等保守的順序組成;2.contentterms(內(nèi)容指令),如密碼子使用偏好.對結(jié)構(gòu)緊湊的小基因組上述注釋軟件效果不錯,但對大基因組特別是超長基因的注釋有很大困難.在一個長度數(shù)十或數(shù)百kb的內(nèi)含子中,存在許多可能誤判的信號指令.2)常用的注釋軟件如GenScan主要偏重于內(nèi)容指令,而FgeneSH則著重于信號指令.由于每種生物都有種屬專一性的密碼子偏好,也存在某些非保守的信號指令,因此在超長基因注釋中常出現(xiàn)正向錯誤(false-positive,多注釋)或負(fù)向錯誤(false-negetive,少注釋).

引自:Naturereviewsgenetics,4:741-749,2003.第三十一頁，共88頁。不同注釋軟件之間的效率Performanceofthreepopulargenepredictionprogramson42semiartificialgenomicsequencescontaining178knownhumangenesequences(900exons).Sensitivityispercentageofexonsthatarepredictedcorrectly.Selectivityispercentageofpredictedexonsthatarecorrect.ReproducedwithchangesfromYadaetal.,2002ColdSpringHarborGenomeSequencingandBiologyMeeting,May7-11,2002.FGENESHisbyfarthemostaccurateofthreeprograms.效率與準(zhǔn)確率比較------------------------------------------------------------------------------------------programsensitivityspecificitymissedexon(%)wrongexon(%)------------------------------------------------------------------------------------------FGENESH77.165.79.623.2GenScan66.544.912.040.9HMMGene69.536.615.555.5------------------------------------------------------------------------------------------引自:/berry.phtml

第三十二頁，共88頁。人類基因注釋標(biāo)準(zhǔn)Knowngene:與人類已知cDNA和蛋白質(zhì)順序同源的基因.Novelgene:與脊椎動物cDNA或其它物種蛋白質(zhì)同源的基因.Noveltranscripts:與novel基因相似,但缺少明確的ORF.Putativegene:有同源EST支持,但缺少cDNA或ORF.Predictedgene:數(shù)據(jù)庫中至少有一個外顯子支持,但缺少cDNA或明確的ORF.Pseudogene(假基因):與已知蛋白質(zhì)有50%的同源性,但cDNA殘缺,在其它位點存在正常的同源基因的順序.引自:Nature414:865-871,2001(人類22號染色體注釋)第三十三頁，共88頁。人類基因總數(shù)可能是永遠(yuǎn)解不開的迷?1.人類基因總數(shù)的預(yù)測有三種方法:cDNA和ESTs順序,計算機(jī)注釋,比較基因組學(xué)(保守的ORF).2.已報道的人類基因總數(shù)的版本:1)Celara:27894HGR:29304(Esemble)(2000)

Celara與HGR的注釋基因有7000個不同,相同的為20000左右,加上不同的注釋約34000個.2)Esemble注釋:24847(2003年)EnsemblisajointprojectbetweenEMBL-EBIandtheSangerInstitutetodevelopasoftwaresystemwhichproducesandmaintainsautomaticannotationoneukaryoticgenomes.3)EBI:27462(2003,nature423:576)4)Genscan:

65452

許多人傾向于不可能知道人類基因組精確的基因數(shù).第三十四頁，共88頁。幾種模式生物注釋的基因總數(shù)大腸桿菌(E.coli):4800酵母(yeast):6200線蟲(nematode):19000果蠅(fly):13600擬南芥(Arabidopsis):25000水稻(rice):60000玉米(maize):59000老鼠(mouse):30000第三十五頁，共88頁。功能域注釋1)任何基因編碼的蛋白質(zhì)都由一些在高級結(jié)構(gòu)水平具有特征性的功能域組成,如引導(dǎo)肽,受體區(qū),激酶區(qū),DNA或RNA結(jié)合域等。2)功能域具有很強(qiáng)的保守性,關(guān)鍵的氨基酸組成及其排列位置是相當(dāng)衡定的,是鑒定功能域的主要標(biāo)識。3)功能域是目前確定基因功能的主要依據(jù)之一.4)已由許多專門的功能域注釋軟件,可用于基因組序列的注釋。第三十六頁，共88頁。什么是功能域(domain)?定義:1)Regionofaproteinwithadistincttertiarystructure(e.g,globularorrodlike)andcharacterristicactivity;homolgousdomainsmayoccurindifferentprotein.(引自“MolecularCellBiology”)2)Acontinuouspartoftheaminoacidsequenceofaproteinthatcanbeequatedwithaparticularfuction.(引自“GeneVII”)3)Portionofaproteinthathasatertiarystructureofitsown.Inlargerproteinseachdomainisconnectedtootherdomainbyshortflexibleregionsofpolypeptide.(引自“MolecularBiologyofTheCell”)第三十七頁，共88頁。同源功能域注釋第三十八頁，共88頁。3.1.3實驗確認(rèn)基因1.Northern雜交確定DNA片段是表達(dá)序列：Northern雜交第三十九頁，共88頁。注意事項：a.當(dāng)某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接時，由于連接的外顯子不同，會產(chǎn)生好幾條長度不一的雜交帶，如果該基因是某一基因家族的成員也會出現(xiàn)多個信息；b.考慮組織專一性和發(fā)育階段的問題；c.基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問題如果豐度較低，用擬Northern雜交和動物雜交（Zoo-blotting）分析。

第四十頁，共88頁。擬Northern雜交——

根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。

動物園雜交——

根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。如果某一物種的DNA序列與來自另一親緣物種的DNA片段雜交產(chǎn)生陽性信號，該區(qū)段可能含有1個或多個基因，這種方法又稱為動物園雜交。第四十一頁，共88頁。動物園雜交（Zooblotting)第四十二頁，共88頁。2.由EST或cDNA指認(rèn)基因目前在數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)測序的物種的EST和cDNA序列的數(shù)量正在呈指數(shù)增長。EST和cDNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，可以確切無疑的代表相應(yīng)基因成員的存在。

尋找目的序列的EST證據(jù)第四十三頁，共88頁。cDNA：CDS：ORF：EST：第四十四頁，共88頁。3.獲取基因全長cDNA序列A.構(gòu)建cDNA文庫，用目的基因DNA片段篩選文庫。B.根據(jù)已知片段設(shè)計引物，RACE技術(shù)得到基因的全長cDNA序列。

第四十五頁，共88頁。4.確定DNA順序中基因的位置A.通過對全長cDNA序列的測序、對比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B.通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；第四十六頁，共88頁。3.2基因功能預(yù)測確認(rèn)DNA序列中的基因序列后，下一個問題就是探索它的功能，這是基因組研究的重點所在，也是一個難點。信息分析+實驗生物學(xué)第四十七頁，共88頁。影響途徑？影響器官？基因類型？底物？細(xì)胞內(nèi)分布？空間結(jié)構(gòu)？基因功能的含義第四十八頁，共88頁。基因水平轉(zhuǎn)錄水平蛋白水平第四十九頁，共88頁?；蚬δ苎芯糠椒ǎ荷镄畔W(xué)方法第五十頁，共88頁。第五十一頁，共88頁。第五十二頁，共88頁。3.2.1計算機(jī)預(yù)測基因功能原理：主要依據(jù)同源性比較，同源性反應(yīng)出進(jìn)化關(guān)系。方法：既存數(shù)據(jù)庫的比較分析。

分析的基礎(chǔ)是:如果一個新測序的基因與另一個原來已測序的基因相似，那么就揭示他們可能有進(jìn)化上的關(guān)系，并且新基因的功能很可能與已知基因的功能相同，或至少是相似。第五十三頁，共88頁。3.2.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在功能預(yù)測中的意義同一物種或不同物種中具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可將其劃歸在同一蛋白質(zhì)家族。第五十四頁，共88頁。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析第五十五頁，共88頁。果蠅甲蟲蜜蜂第五十六頁，共88頁?；蚬δ苎芯糠椒ǎ簩嶒灧椒ǖ谖迨唔?，共88頁。第五十八頁，共88頁。無論研究什么生物現(xiàn)象，都需要做一件事：改變基因1）Lossfunction：降低基因或刪除基因Givefunction:提高基因的表達(dá)3.3基因功能的檢測第五十九頁，共88頁。3.1.3基因失活是基因功能分析的主要手段使特定基因失活的最簡單方法是用一段無關(guān)DNA片段將其破壞。兩個DNA分子具有相似序列，重組能引起分子片段進(jìn)行互換。第六十頁，共88頁。

剔

除

老

鼠

(1)

第六十一頁，共88頁。

剔

除

老

鼠(2)

第六十二頁，共88頁。美英三科學(xué)家因干細(xì)胞研究的貢獻(xiàn)獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎馬利歐·卡佩奇埃文斯奧利弗·史密斯第六十三頁，共88頁。3.2.3

基因

過表

達(dá)用

于功

能檢

測第六十四頁，共88頁。劃時代的基因靶向操作技術(shù)：

CRISPR/Cas9

經(jīng)典基因操作：Genetrap:化學(xué)誘變；同源重組：一般物種幾率低,10-6；EScell10-2突破性的發(fā)現(xiàn)：RNAi-Knockdown;不完全敲除，臨時性充滿夢想?yún)s幻滅的ZFN：難以完全找到匹配的3連子鋅指；Off-target嚴(yán)重

美國加州大學(xué)DaveSegal教授說：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”完美基因靶向操作：識別特異DNA序列+操作DNA的酶第六十五頁，共88頁。細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并進(jìn)行有效的靶向DNA剪切。CRISPR/Cas9SystemClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列.SorekR.etal.NatRevMicrobiol.2008，6(3):181-186第六十六頁，共88頁。CRISPR/Cas9作用機(jī)理BarrangouR.NatureBiotech.2012:30,836–838PAM：protospaceradjacentmotifs前間區(qū)序列鄰近基序，2–4nt；

TypeIITypeITypeIIICas9+sgRNACRISPR/Cas9RGN第六十七頁，共88頁。CRISPR/Cas9應(yīng)用第六十八頁，共88頁。3.4高通量基因功能的研究方法

同源重組并不是唯一的打斷基因的方法。另一種方法是用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)，通過向基因中插入轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子使其失活。人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座第六十九頁，共88頁。3.4.1突變庫構(gòu)建1)利用天然的DNA轉(zhuǎn)座子構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,當(dāng)轉(zhuǎn)座子活化時可被動轉(zhuǎn)座并隨機(jī)插入受體細(xì)胞基因組引起基因突變.2)觀測突變再生植株的表型變化,分離與克隆插入突變基因的結(jié)構(gòu)與功能.第七十頁，共88頁。植物DNA轉(zhuǎn)座子第七十一頁，共88頁。突變庫表達(dá)載體第七十二頁，共88頁。突變庫表達(dá)載體元件的功能1)

Ac-載體:轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體,由于缺少兩側(cè)反向重復(fù)邊界順序,不能主動轉(zhuǎn)座.2)DsE-載體:捕獲增強(qiáng)子表達(dá)載體.。兩側(cè)含轉(zhuǎn)座子Ac-Ds的邊界順序,在轉(zhuǎn)座酶作用下可被動轉(zhuǎn)座,插入到啟動子下游.第七十三頁，共88頁。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)很難瞄準(zhǔn)單個基因，因為轉(zhuǎn)座是一種隨機(jī)事件，它更適用于整體研究基因組的功能，通過檢查感興趣表型變化的后代來鑒定出具有相似功能的各類基因。第七十四頁，共88頁。3.4.2

RNAi與基因功能檢測RNAi是一種完全不同的基因失活方法，它并不打斷基因本身，而是破壞其mRNA。第七十五頁，共88頁。如何發(fā)現(xiàn)RNAiRNA干擾現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于1995年，Cornell大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues研究阻斷秀麗新隱桿線蟲中的par-1基因時，利用反義RNA(AntisenseRNA)技術(shù)特異性地阻斷par-1基因的表達(dá)，同時在對照實驗注射正義R