2026屆新高考生物熱點沖刺復習

雙脫氧核苷酸法DNA測序必修二教材52頁課本中的DNA測序選擇性必修三教材96頁課本中的DNA測序

在高考生物中，雙脫氧核苷酸法（又稱鏈終止法）是DNA測序的經(jīng)典方法，由弗雷德里克?桑格（FrederickSanger）發(fā)明，因此也被稱為桑格測序法。該方法的原理和過程是考試中可能涉及的重點，以下從核心原理、實驗過程、結果解讀等方面詳細說明：認識NTP、dNTP和ddNTP一、核心原理雙脫氧核苷三磷酸能替代脫氧核苷三磷酸參與反應，且具有終止DNA鏈合成的效果。認識NTP、dNTP和ddNTPdNTP和

ddNTP3’-5’-磷酸二酯鍵3’-磷酸單酯鍵5’-磷酸單酯鍵1’2’3’4’5’3’5’5’-磷酸單酯鍵即將形成的3’-磷酸單酯鍵剛形成的3’-磷酸單酯鍵5’-磷酸單酯鍵3’-5’-磷酸二酯鍵焦磷酸(PPi)dNTPdNTP是DNA合成的原料1.dNTP是DNA合成的原料2.dNTP是DNA聚合酶的底物3.dNTP為DNA合成提供能量2Pi3’-磷酸單酯鍵5’-磷酸單酯鍵3’-5’-磷酸二酯鍵焦磷酸(PPi)dNTP3’-5’-磷酸二酯鍵3’-5’-磷酸二酯鍵dNTP是DNA合成的原料1.dNTP是DNA合成的原料2.dNTP是DNA聚合酶的底物3.dNTP為DNA合成提供能量2Pio1’2’3’4’5’3’ddNTPddNTP是DNA合成的終結者dNTP焦磷酸(PPi)2Pi一、雙脫氧核苷酸法的核心原理

雙脫氧核苷酸法的關鍵在于利用雙脫氧核苷酸（ddNTP）與普通脫氧核苷酸（dNTP）的結構差異：

普通dNTP的脫氧核糖第3位碳原子（3'-C）上有一個羥基（-OH），是DNA鏈延伸時核苷酸連接的位點（下一個dNTP的5'-磷酸與之形成磷酸二酯鍵）。

雙脫氧核苷酸（ddNTP）的3'-C上沒有羥基（-OH），只有一個氫原子（-H），因此當ddNTP摻入正在合成的DNA鏈時，會導致鏈延伸終止（無法再連接下一個核苷酸）。

通過在DNA合成體系中加入少量的4種ddNTP（分別標記不同的熒光或放射性同位素），可以隨機終止不同長度的DNA鏈，最終通過分離這些片段即可讀取DNA序列。一、雙脫氧核苷酸法的核心原理雙脫氧核苷酸法，又叫Sanger的雙脫氧鏈終止法：雙脫氧鏈終止法最終因其更適合于序列分析的自動化而逐漸占據(jù)了顯著的優(yōu)勢地位。1.模板與引物準備

以待測單鏈DNA為模板，加入一段與模板鏈3'端互補的引物（引物可標記放射性或熒光）。2.合成反應體系

將模板、引物分為4組，每組加入（4+1）：4種dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP，作為DNA合成的原料）；1種ddNTP（如第一組加ddATP，第二組加ddTTP，以此類推），濃度遠低于dNTP（確保隨機終止）；DNA聚合酶（催化鏈延伸）3.鏈延伸與終止

DNA聚合酶從引物開始延伸鏈，當ddNTP隨機摻入時，鏈延伸終止。最終每組反應會產(chǎn)生一系列以特定ddNTP為末端的、不同長度的DNA片段（例如，含ddATP的組中，所有片段的3'端都是A）。4.片段分離與檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳或capillaryelectrophoresis（毛細管電泳）分離4組反應的DNA片段（按長度從小到大排列）。由于片段長度差異反映了核苷酸的位置，通過讀取片段末端的ddNTP類型（結合電泳遷移順序），即可確定模板DNA的堿基序列。二、雙脫氧核苷酸法的實驗過程1.電泳后，片段越短，遷移速度越快，離起點越遠。2.從凝膠底部（最短片段）到頂部（最長片段）讀取堿基順序，即為待測DNA的互補鏈序列3.需注意與模板鏈的關系。例如：若電泳結果從下到上的條帶對應的ddNTP依次為G、A、T、T，則待測DNA的互補鏈序列為5'-GATT-3'，

模板鏈序列為3'-CTAA-5'。三、雙脫氧核苷酸法的結果解讀雙脫氧核苷酸法在DNA測序中的應用

雙脫氧核苷酸法的優(yōu)點在于其準確性高、可靠性好，并且可以對較長的DNA片段進行測序。然而，該方法也存在一些局限性，例如需要較高的技術水平和設備條件，以及測序速度相對較慢等。

總之，雙脫氧核苷酸法是一種重要的DNA測序技術，它在生物學研究、醫(yī)學診斷、法醫(yī)學鑒定等領域都有廣泛的應用價值。1．（2024·湖南·高考）最早的雙脫氧測序法是PCR反應體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸（dATP），繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列，結果如圖所示。下列敘述正確的是（）

A．上述PCR反應體系中只加入一種引物

B．電泳時產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢

C．5'-CTACCCGTGAT-3'為對照個體的一段序列

D．患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)镚四、精選精練AC1．（2024·湖南·高考）【答案】AC【分析】2、雙脫氧測序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸（dNTP）存在的情況下，如果在四管反應系統(tǒng)中再分別加入四種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），DNA鏈合成反應過程中ddNTP與dNTP處于一種競爭狀態(tài)，即新合成DNA鏈既可能摻入正常dNTP，也可能摻入ddNTP并使新合成鏈終止延伸。這樣在每個反應系統(tǒng)中形成的產(chǎn)物是一系列長度不等的多核苷酸片段，這些片段具有相同的起點，即引物的5'端，但有不同的ddNTP終端。在結束反應后，用四個泳道進行電泳，分別分離各組反應體系中不同長度的DNA片段，檢測DNA片段終止末端位置的堿基種類，從自顯影圖譜中直接讀取到與模板相匹配的新的鏈序?！驹斀狻緼、利用雙脫氧測序法時，PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；

B、電泳時，產(chǎn)物的片段越大，遷移速率越慢。B錯誤；

C、依據(jù)分析中雙脫氧測序法的原理，可以確定每個泳道中的條帶（DNA片段）的3'終端的堿基，如+ddATP的泳道中出現(xiàn)的條帶（DNA片段）的3'終端堿基就是A。另外由于每個片段的起始點相同，但終止點不同，因此可以通過比較片段的長度來確定DNA序列中每個位置上的堿基；圖示電泳方向為從上→下，即對應的DNA片段為長→短，則對應的DNA測序結果為3'→5'，如對照個體的電泳結果最短的條帶為+ddCTP泳道組的條帶，則說明該DNA片段5'端第一個堿基為C；因此對照個體的測序結果為5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的測序結果為5'-CTACCTGTGAT-3'，C正確；

D、對比患者和對照個體的測序結果可知，患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)門，D錯誤。四、精選精練2．（2024齊齊哈爾一模）雙脫氧核苷酸測序法可以準確讀取和分析DNA序列，雙脫氧核苷酸是DNA測序的第一代方法。雙脫氧核苷酸在2、3號位碳上都脫氧，而磷酸二酯鍵的形成需要3號碳上提供羥基，雙脫氧核苷酸沒有這個羥基，所以一旦DNA子鏈加入某一個雙脫氧核苷酸（ddNTP）則聚合反應終止。在人工合成的反應體系中包含有適量的GCGATGACTAG的單鏈模板、某一種雙脫氧核苷酸（ddATP或ddTTP、ddGTP、ddCTP）和四種正常脫氧核苷酸，反應終止時合成出不同長度的子鏈。下列相關敘述錯誤的是（）A．在一個反應體系中合成DNA，需要添加引物及耐高溫的DNA聚合酶B．ddNTP與dNTP競爭的延長位置是核苷酸鏈的3'端C．加入胸腺嘧啶雙脫氧核苷酸（ddTTP）的反應體系中最多獲得3條長短不同的子鏈D．測定GCGATGACTAG序列中各種堿基數(shù)量需要構建四個反應體系四、精選精練C【答案】C【分析】DNA復制時根據(jù)堿基互補配對原則和半保留復制原理進行復制。據(jù)題意可知，當模板上的堿基雙脫氧核苷酸配對時終止復制?！驹斀狻緼、在人工合成體系中，需適量的單鏈模板并添加引物及耐高溫的DNA聚合酶，A正確；B、DNA子鏈沿著5'端向3'端延伸，因此ddNTP與dNTP競爭的延長位置是核苷酸鏈的3'端，B正確；C、DNA的單體是脫氧核糖核苷酸，當模板上的堿基雙脫氧核苷酸配對時終止復制，故GCGATGACTAG的單鏈模板可產(chǎn)生4條長度不同的子鏈，C錯誤；D、定CGATGACTAG序列中各種堿基數(shù)量需要構建ddATP或ddTTP、ddGTP、ddCTP四個反應體系，D正確。四、精選精練2．（2024齊齊哈爾一模）雙脫氧核苷酸測序法可以準確讀取和分析DNA序列，雙脫氧核苷酸是DNA測序的第一代方法。雙脫氧核苷酸在2、3號位碳上都脫氧，而磷酸二酯鍵的形成需要3號碳上提供羥基，雙脫氧核苷酸沒有這個羥基，所以一旦DNA子鏈加入某一個雙脫氧核苷酸（ddNTP）則聚合反應終止。在人工合成的反應體系中包含有適量的GCGATGACTAG的單鏈模板、某一種雙脫氧核苷酸（ddATP或ddTTP、ddGTP、ddCTP）和四種正常脫氧核苷酸，反應終止時合成出不同長度的子鏈。下列相關敘述錯誤的是（）A．在一個反應體系中合成DNA，需要添加引物及耐高溫的DNA聚合酶B．ddNTP與dNTP競爭的延長位置是核苷酸鏈的3'端C．加入胸腺嘧啶雙脫氧核苷酸（ddTTP）的反應體系中最多獲得3條長短不同的子鏈D．測定GCGATGACTAG序列中各種堿基數(shù)量需要構建四個反應體系四、精選精練C【答案】C【分析】DNA復制時根據(jù)堿基互補配對原則和半保留復制原理進行復制。據(jù)題意可知，當模板上的堿基雙脫氧核苷酸配對時終止復制?！驹斀狻緼、在人工合成體系中，需適量的單鏈模板并添加引物及耐高溫的DNA聚合酶，A正確；B、DNA子鏈沿著5'端向3'端延伸，因此ddNTP與dNTP競爭的延長位置是核苷酸鏈的3'端，B正確；C、DNA的單體是脫氧核糖核苷酸，當模板上的堿基雙脫氧核苷酸配對時終止復制，故GCGATGACTAG的單鏈模板可產(chǎn)生4條長度不同的子鏈，C錯誤；D、定CGATGACTAG序列中各種堿基數(shù)量需要構建ddATP或ddTTP、ddGTP、ddCTP四個反應體系，D正確。四、精選精練3．（2022·河北·模擬預測）dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四種物質的統(tǒng)稱，常在PCR中做原料。ddNTP是非天然的雙脫氧核苷三磷酸，有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4種。DNA合成時，在DNA聚合酶作用下，若連接上的是雙脫氧核苷酸，子鏈延伸終止；若連接上的是脫氧核苷酸，子鏈延伸繼續(xù)。dNTP與ddNTP的結構如下圖所示，下列敘述錯誤的是（）

A．dNTP做PCR的原料時也可為DNA復制提供能量，標記γ位的磷酸才可使DNA帶上標記

B．以dNTP和ddATP為原料、一種mRNA為模板可以合成多種長度的多肽鏈

C．dNTP和ddNTP都不能作為合成RNA的原料，dATP比ddATP的相對分子質量多16

D．ATP、dATP和ddATP中A的結構不都由腺嘌呤和脫氧核糖組成四、精選精練B【答案】B【分析】ATP的結構式可簡寫成A-P～P～P，式中A代表腺苷，T代表3個，P代表磷酸基團。通常斷裂和合成的是第二個特殊的化學鍵。一個ATP分子中含有一個腺苷、3個磷酸基團、2個特殊的化學鍵。ATP的一個特殊化學鍵水解，形成ADP，兩個特殊化學鍵水解，形成AMP?！驹斀狻緼、由圖可知，dNTP做PCR的原料時，有兩個特殊化學鍵斷裂，故也可為DNA復制提供能量，γ位的磷酸是合成DNA所需的脫氧核苷酸的一部分，因此，標記γ位的磷酸可使DNA帶上標記，A正確；B、以mRNA為模板合成DNA時，在相關酶的作用下，若連接上的是雙脫氧核苷酸，子鏈延伸終止，若連接上的是脫氧核苷酸，子鏈延伸繼續(xù)，因此，以dNTP和ddATP為原料、一種mRNA為模板可以合成多種長度的DNA，B錯誤；C、由于dNTP和ddNTP中都只含有A、T、C、G四種堿基，并且五碳糖都不是核糖，因此，都不能作為合成RNA的原料，由圖可知，dATP比ddATP多一個O，相對分子質量多16，C正確；D、ATP、dATP和ddATP中A的結構不相同，dATP中A由腺嘌呤和脫氧核糖組成，ATP中的A由腺嘌呤和核糖組成，D正確。四、精選精練4．（24高三遼寧撫順·期末）Sanger測序法是第一代基因測序方法，測序原理如圖所示，其中ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP(統(tǒng)稱為ddNTP)為雙脫氧核苷酸，其2、3號碳原子上沒有氧原子。下列相關說法錯誤的是（

）A．被測模板的序列應該為5'—CTAAGCTCGACT—3'B．ddNTP可以連接到延伸的子鏈中，但此后子鏈將無法延伸C．帶有標記的子鏈中最長的類型會出現(xiàn)在第一組實驗中D．電泳結果共出現(xiàn)了12條長短不同的條帶，但被測模板實際堿基數(shù)要超過12個四、精選精練A【答案】A【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的?！驹斀狻緼、讀取的測序結果為5'—GATTCGAGCTGA—3'，所以被測模板的序列應為3'—CTAAGCTCGACT—5'，A錯誤；B、ddNTP的2、3號碳上都脫氧，ddNTP的3號碳上沒羥基，參與聚合反應后無法與游離脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵，因此ddNTP一旦參與聚合反應，則DNA單鏈延伸即終止，B正確；C、由圖可知，以被測模板為模板，第一組合成的帶有標記子鏈類型最長，C正確；D、電泳結果共出現(xiàn)了12條長短不同的條帶，因為子鏈的合成需要引物，所以被測模板實際堿基數(shù)要超過12個，D正確。四、精選精練5．（2023·吉林長春·三模）閱讀資料1、資料2，回答下列問題?！举Y料1】接種新冠疫苗可降低新冠患者出現(xiàn)重癥的危險。我國科學家把腺病毒中負責復制的關鍵基因剪切掉，但保留其侵染人體細胞的能力。隨后，將其與逆轉錄獲得的新冠病毒S蛋白（介導新冠病毒感染細胞的關鍵成分）基因整合，構建出了兩種病毒的融合型病毒——重組腺病毒DNA疫苗?！举Y料2】新冠病毒核酸測序能夠監(jiān)測新變異毒株的出現(xiàn)，具體做法是：先提取新冠病毒RNA，利用RT-PCR技術（即將病毒RNA逆轉錄后再進行PCR擴增）獲取目標DNA區(qū)域；隨后進行DNA測序，通常采用雙脫氧核苷酸測序法，其原理是：雙脫氧核苷酸（ddNTP）的2'、3'碳原子都不含羥基，在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應。在四個單獨的PCR反應體系中，分別額外摻入ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP，使DNA復制隨機終止，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，然后進行凝膠電泳分離檢測，從而分析獲得目標DNA區(qū)域的堿基序列。四、精選精練5．(1)資料1中，構建出兩種病毒的融合型病毒這一步驟在基因工程中被稱為

。融合型病毒入侵人體細胞后，S蛋白基因在人體細胞內的遺傳信息傳遞過程為

（用文字和箭頭表示）。(2)接種重組腺病毒DNA疫苗后，人體長時間內仍可檢測到重組腺病毒DNA。請由此推測重組腺病毒DNA疫苗只需注射一針即可起到長期免疫保護作用的原因是

。(3)資料2，RT-PCR技術中使用的酶有

。PCR反應中的每次循環(huán)可分為變性、復性、

三步，其中復性的結果是

。(4)下圖為資料2中雙脫氧核苷酸測序電泳結果，據(jù)此可分析出目標DNA區(qū)域X的堿基序列為

（按5'→3'方向書寫）。四、精選精練5’—CTGACTT—3’基因表達載體的構建重組腺病毒DNA在人體細胞中持續(xù)表達抗原，可反復刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用（能夠表述出“DNA能表達抗原”得，“抗原刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用”得）逆轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶延伸兩種引物（通過堿基互補配對）與兩條單鏈DNA結合（答出引物與模板鏈結合或互補配對即可）【答案】(1)基因表達載體的構建(2)重組腺病毒DNA在人體細胞中持續(xù)表達抗原，可反復刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用（能夠表述出“DNA能表達抗原”得，“抗原刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用”得）(3)逆轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶延伸兩種引物（通過堿基互補配對）與兩條單鏈DNA結合（答出引物與模板鏈結合或互補配對即可）(4)5’—CTGACTT—3’【分析】基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。PCR技術是利用DNA雙鏈復制的原理，將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加?！驹斀狻浚?）構建出兩種病毒的融合型病毒在基因工程中被稱為基因表達載體的構建。S蛋白基因在人體細胞內經(jīng)轉錄與翻譯形成相應的蛋白質，其遺傳信息傳遞過程為（2）由于重組腺病毒DNA在人體細胞中持續(xù)表達抗原，可反復刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用，故接種重組腺病毒DNA疫苗后，人體長時間內仍可檢測到重組腺病毒DNA。四、精選精練（3）由題意可知，RT-PCR技術為將病毒RNA逆轉錄后再進行PCR擴增，故PCR技術中使用的酶有逆轉錄酶和耐高溫的DNA聚合酶。PCR的每個循環(huán)過程包括高溫變性、低溫復性、中溫延伸三個不同的事件：①變性：加熱使模板DNA在高溫下雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②復性；使溶液溫度降至50℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合。③延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷酸，按5'→3'方向復制出互補DNA。（4）由題意可知，雙脫氧核苷酸測序法的原理是：雙脫氧核苷酸（ddNTP）的2'、3'碳原子都不含羥基，在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應，DNA合成過程中子鏈延3'端向下延伸，并且過中遵循堿基互補配對原則，得到的結果如圖，可知目標DNA區(qū)域X的堿基序列應是5’—CTGA