發(fā)育期海馬星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響：機制與啟示一、引言1.1研究背景與意義自閉癥，又稱孤獨癥譜系障礙（AutismSpectrumDisorder，ASD），是一類嚴重的神經發(fā)育障礙性疾病，其主要特征包括社交障礙、語言發(fā)展遲緩、重復刻板行為以及興趣狹窄等。近年來，自閉癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，據美國疾病控制與預防中心（CDC）最新數據顯示，每44名兒童中就約有1名被診斷為自閉癥譜系障礙，這一數據較以往有了顯著提高，凸顯了自閉癥問題的日益嚴峻性。在中國，根據中國殘疾人聯(lián)合會發(fā)布的相關報告，自閉癥患者已超過1000萬人，其中兒童患者數量眾多，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。自閉癥的發(fā)病機制至今尚未完全明確，目前認為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果。遺傳因素在自閉癥的發(fā)病中占據重要地位，研究表明，約70%-90%的自閉癥患者存在遺傳易感性，多個基因的突變或異常表達與自閉癥的發(fā)生相關。然而，環(huán)境因素如孕期感染、重金屬暴露、母親孕期心理壓力等也被證實對自閉癥的發(fā)病具有一定影響。盡管已有大量研究致力于揭示自閉癥的發(fā)病機制，但由于大腦神經發(fā)育的復雜性以及自閉癥癥狀的多樣性，目前對于自閉癥的發(fā)病機制仍存在許多未知。星形膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)中數量最多的細胞類型，在大腦的正常發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著至關重要的作用。它不僅為神經元提供物理支持和營養(yǎng)物質，還參與調節(jié)神經遞質代謝、維持離子穩(wěn)態(tài)以及參與血腦屏障的形成。在大腦發(fā)育過程中，星形膠質細胞對神經元的遷移、分化和突觸形成具有重要的調控作用。例如，星形膠質細胞可以分泌多種神經營養(yǎng)因子，如腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）等，這些因子對于神經元的存活、生長和分化具有關鍵作用。此外，星形膠質細胞還通過與神經元之間的直接接觸或釋放細胞外囊泡等方式，調節(jié)神經元的活動和突觸可塑性。越來越多的研究證據表明，星形膠質細胞的功能異常與自閉癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。在自閉癥患者的大腦中，發(fā)現了星形膠質細胞形態(tài)和功能的改變，包括細胞數量的變化、細胞形態(tài)的異常以及相關蛋白表達的改變等。例如，有研究報道，自閉癥患者大腦顳葉、額葉等腦區(qū)的星形膠質細胞數量明顯減少，且其形態(tài)呈現出異常的肥大或萎縮。同時，星形膠質細胞中一些與神經遞質轉運、代謝相關的蛋白表達也發(fā)生了改變，如谷氨酸轉運體（GLT-1）的表達降低，導致谷氨酸在突觸間隙的清除障礙，進而影響神經元的正常功能。在動物實驗中，通過基因編輯技術干擾星形膠質細胞的正常功能，可誘導小鼠出現類似自閉癥的行為表現，進一步證實了星形膠質細胞與自閉癥之間的關聯(lián)。海馬作為大腦中與學習、記憶和情緒調節(jié)等功能密切相關的重要腦區(qū)，在自閉癥的發(fā)病機制研究中受到了廣泛關注。海馬中的神經元活動和突觸可塑性異常被認為是導致自閉癥患者認知和社交障礙的重要原因之一。而海馬星形膠質細胞在維持海馬神經元的正常功能中發(fā)揮著不可或缺的作用。它可以通過調節(jié)神經遞質的釋放和攝取，維持海馬神經元的興奮-抑制平衡；還可以通過釋放神經營養(yǎng)因子，促進海馬神經元的存活和突觸的形成與穩(wěn)定。因此，海馬星形膠質細胞的功能異?？赡軙ｑR神經元的正常功能產生嚴重影響，進而導致自閉癥樣行為的出現。本研究聚焦于發(fā)育期海馬星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響及機制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。從理論意義上講，深入探究星形膠質細胞在自閉癥發(fā)病機制中的作用，有助于我們進一步揭示自閉癥的神經生物學基礎，填補該領域在這方面的研究空白，為建立更加完善的自閉癥發(fā)病機制理論體系提供重要依據。通過研究發(fā)育期海馬星形膠質細胞激活與自閉癥樣行為之間的因果關系，以及其內在的分子和細胞機制，我們可以更加深入地理解大腦神經發(fā)育過程中細胞間相互作用的復雜性，以及這種相互作用異常如何導致神經發(fā)育障礙性疾病的發(fā)生。從臨床應用價值來看，本研究的結果有望為自閉癥的早期診斷和治療提供新的生物標志物和潛在的治療靶點。如果能夠明確海馬星形膠質細胞激活在自閉癥發(fā)病中的關鍵作用，那么可以將其相關的分子標志物或細胞特征作為自閉癥早期診斷的指標，實現自閉癥的早期篩查和干預，提高治療效果。此外，針對海馬星形膠質細胞的功能異常開發(fā)相應的治療策略，如通過藥物調節(jié)星形膠質細胞的活性或改善其與神經元之間的相互作用，可能為自閉癥的治療開辟新的途徑，為廣大自閉癥患者及其家庭帶來希望，減輕社會的負擔。1.2研究目的與假設本研究旨在深入探究發(fā)育期海馬星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響，并揭示其潛在的作用機制。具體而言，通過一系列實驗操作和檢測手段，明確海馬星形膠質細胞激活與自閉癥樣行為之間的因果關系，從分子、細胞和行為等多個層面解析其內在機制，為自閉癥的發(fā)病機制研究提供新的理論依據，同時也為自閉癥的臨床診斷和治療提供潛在的靶點和新思路?；谏鲜鲅芯磕康囊约耙延械南嚓P研究基礎，本研究提出以下假設：假設一：發(fā)育期海馬星形膠質細胞的激活會導致小鼠出現自閉癥樣行為。鑒于已有研究表明星形膠質細胞功能異常與自閉癥存在關聯(lián)，且海馬在自閉癥發(fā)病機制中具有重要作用，推測激活發(fā)育期海馬星形膠質細胞可能打破大腦正常的神經發(fā)育平衡，進而誘導小鼠產生類似自閉癥患者的社交障礙、重復刻板行為等癥狀。假設二：海馬星形膠質細胞激活可能通過影響神經元的結構和功能，導致小鼠自閉癥樣行為的出現。星形膠質細胞與神經元之間存在密切的相互作用，它可以為神經元提供營養(yǎng)支持、調節(jié)神經遞質代謝以及參與突觸的形成和可塑性調節(jié)。因此，當海馬星形膠質細胞被激活后，可能會干擾神經元的正常發(fā)育和功能，例如影響神經元的樹突棘密度、突觸傳遞效率等，從而引發(fā)自閉癥樣行為。假設三：海馬星形膠質細胞激活可能通過調節(jié)神經遞質系統(tǒng)，影響小鼠的神經活動，進而導致自閉癥樣行為。神經遞質在大腦的信息傳遞和神經調節(jié)中起著關鍵作用，而星形膠質細胞參與了神經遞質的攝取、代謝和釋放調節(jié)。假設海馬星形膠質細胞激活會改變神經遞質如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）等的穩(wěn)態(tài)，打破神經元的興奮-抑制平衡，最終導致小鼠出現自閉癥樣行為。1.3研究方法和技術路線1.3.1實驗動物選用健康的C57BL/6小鼠作為實驗動物，購自正規(guī)的實驗動物供應商。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗開始前，讓小鼠適應環(huán)境一周，以減少環(huán)境因素對實驗結果的影響。1.3.2主要實驗方法子宮內胚胎電轉（inuteroelectroporation，IUE）：在小鼠胚胎發(fā)育的特定時期（通常為E15.5-E16.5），對孕鼠進行麻醉處理。將含有目的基因（如用于激活星形膠質細胞的相關基因）的質粒溶液注射到胚胎的側腦室中，然后使用特制的電極對胚胎的海馬區(qū)域進行電轉操作。通過電場作用，使質粒DNA導入海馬星形膠質細胞中，從而實現對星形膠質細胞的激活。電轉后，將孕鼠縫合傷口，放回飼養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)，直至幼鼠出生。行為學檢測社交行為測試：采用三箱社交實驗，實驗裝置由三個大小相同且相互連通的透明箱子組成。將實驗小鼠先放入中間箱子適應5分鐘，然后在一側箱子中放入陌生小鼠A，另一側箱子為空。記錄實驗小鼠在裝有陌生小鼠A的箱子和空箱子中的停留時間，以及與陌生小鼠A的互動時間，以此評估小鼠的社交偏好。接著，將陌生小鼠A換成陌生小鼠B，再次記錄實驗小鼠與陌生小鼠B的互動情況，以評估小鼠的社交新奇偏好。重復刻板行為測試：采用大理石掩埋實驗，在小鼠飼養(yǎng)籠中均勻放置一定數量（如20顆）的大理石，讓小鼠自由活動30分鐘。30分鐘后，觀察并記錄被小鼠掩埋的大理石數量，掩埋數量越多，表明小鼠的重復刻板行為越嚴重。曠場實驗：將小鼠置于一個空曠的正方形場地中，場地周圍有一定高度的圍欄，防止小鼠逃脫。在場地中央和四周設置多個感應區(qū)域，通過視頻跟蹤系統(tǒng)記錄小鼠在5-10分鐘內的活動軌跡、運動距離、在中央區(qū)域的停留時間等參數。通過分析這些參數，可以評估小鼠的運動能力、焦慮水平以及探索行為。生化檢測免疫熒光染色：取小鼠海馬組織，制作冰凍切片或石蠟切片。將切片進行抗原修復、封閉處理后，依次加入針對星形膠質細胞標志物（如GFAP）、神經元標志物（如NeuN）以及其他相關蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片后，加入相應的熒光標記二抗，室溫孵育1-2小時。最后，用DAPI染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析星形膠質細胞的激活情況以及相關蛋白的表達定位。蛋白質免疫印跡（Westernblot）：提取小鼠海馬組織的總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結合。接著，加入針對目的蛋白（如與神經遞質代謝、突觸可塑性相關的蛋白）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3-5次，每次10-15分鐘，然后加入相應的HRP標記二抗，室溫孵育1-2小時。最后，用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析目的蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取小鼠海馬組織的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物對目的基因（如與星形膠質細胞功能、神經遞質合成相關的基因）進行qRT-PCR擴增。在PCR反應體系中加入SYBRGreen熒光染料，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，計算目的基因的相對表達量，以評估相關基因的轉錄水平。數據統(tǒng)計和分析：使用GraphPadPrism等統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析。實驗數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若存在顯著差異，則進一步進行Tukey'sposthoc檢驗。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。1.3.3技術路線本研究的技術路線圖如圖1-1所示。首先，通過子宮內胚胎電轉技術將激活星形膠質細胞的質粒導入小鼠胚胎海馬星形膠質細胞中，獲得實驗組小鼠，同時設置對照組小鼠。待小鼠出生并飼養(yǎng)至合適年齡后，對兩組小鼠進行全面的行為學檢測，包括社交行為測試、重復刻板行為測試和曠場實驗等，以評估小鼠是否出現自閉癥樣行為。然后，對小鼠進行安樂死，取海馬組織進行生化檢測，包括免疫熒光染色、蛋白質免疫印跡和實時熒光定量PCR等，從分子和細胞水平分析星形膠質細胞激活對海馬神經元結構和功能、神經遞質系統(tǒng)等方面的影響。最后，綜合行為學和生化檢測結果，深入探討發(fā)育期海馬星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響及機制。[此處插入技術路線圖]圖1-1技術路線圖圖1-1技術路線圖二、文獻綜述2.1自閉癥譜系障礙概述2.1.1自閉癥的定義與診斷標準自閉癥，即孤獨癥譜系障礙（ASD），是一類具有高度異質性的神經發(fā)育障礙性疾病，其核心特征表現為持續(xù)的社交溝通和社交互動缺陷，以及局限的、重復的行為模式、興趣或活動?；颊咴谏缃磺榫持型y以理解他人的意圖、情感和社交信號，缺乏正常的眼神交流、面部表情和身體語言的運用，導致社交互動困難。例如，自閉癥兒童可能很少主動與他人進行眼神對視，對他人的呼喚反應遲鈍，在集體活動中表現出明顯的社交退縮行為。同時，他們常伴有重復性的動作，如拍手、搖晃身體、旋轉物品等，興趣范圍狹窄，對特定的事物或活動表現出過度的專注和強烈的執(zhí)著。目前，國際上廣泛應用的自閉癥診斷標準主要包括美國精神醫(yī)學學會出版的《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第五版（DSM-5）和世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《國際疾病分類》第十一版（ICD-11）。在DSM-5中，自閉癥的診斷需滿足以下條件：在多種環(huán)境中持續(xù)性地顯示出社交溝通和社交互動的缺陷，如社交與情感的交互性存在障礙，表現為從異常的社交接觸和不能正常來回對話，到減少分享興趣、情緒或情感以及不能發(fā)起或回應社會互動；社會交往中非語言交流行為的缺陷，涵蓋從語言和非語言交流的整合困難，到異常的眼神接觸和身體語言，再到完全缺乏面部表情和非語言交流；發(fā)展、維持和理解人際關系的缺陷，包括從難以調整自己的行為以適應各種社交情境，到難以結交朋友和對同伴缺乏興趣。同時，必須存在局限的、重復的行為模式、興趣或活動，如刻板或重復的軀體運動、使用物體或言語，過度堅持常規(guī)，言語或非言語行為有儀式化的模式，高度受限的、固定的興趣，這些興趣在強度和專注度上是異常的，對感覺輸入的過度反應或反應不足，或對環(huán)境中的感覺因素有不尋常的興趣。并且這些癥狀必須在早期發(fā)育階段出現（通常在3歲之前），且這些癥狀導致個體在社交、職業(yè)或目前其他重要功能方面有臨床意義的損害。ICD-11中對自閉癥的診斷強調個體在社會溝通、情感互動以及靈活性和適應性方面的障礙。社會溝通障礙表現為在各種情境下理解和使用語言、非語言交流以及與他人進行有效溝通的能力受損；情感互動障礙體現為在社交情境中體驗、表達和回應情感的方式異常，難以建立和維持情感聯(lián)系；靈活性和適應性障礙則表現為個體在面對環(huán)境變化、轉換活動或應對新情境時存在困難，行為模式較為僵化，難以調整。這些障礙會對個體的日常生活和參與社會活動的能力產生顯著影響，且癥狀通常在兒童早期出現，隨著年齡增長可能會有所變化，但會持續(xù)存在并影響個體的發(fā)展和功能。除了上述診斷標準，臨床上還常結合一些輔助診斷工具，如孤獨癥診斷觀察量表（ADOS）和孤獨癥診斷訪談量表修訂版（ADI-R）。ADOS是一種標準化的觀察評估工具，通過設置一系列結構化和半結構化的活動場景，觀察個體在社交互動、溝通、游戲和想象等方面的行為表現，對其自閉癥癥狀進行量化評估。ADI-R則是一種半結構化訪談量表，通過與家長或主要照顧者進行深入訪談，收集個體從出生到當前的發(fā)育史、行為表現、社交能力等信息，為自閉癥的診斷提供全面的資料。這些輔助工具能夠幫助專業(yè)人員更準確、客觀地評估個體是否患有自閉癥，提高診斷的可靠性和準確性。2.1.2自閉癥的流行病學特征自閉癥的全球發(fā)病率呈現出逐漸上升的趨勢，引起了廣泛的關注。根據世界衛(wèi)生組織（WHO）的數據，全球自閉癥譜系障礙的患病率大致在每1000人中有16例。在美國，近年來自閉癥的發(fā)病率增長顯著，最新數據顯示每44名兒童中就約有1名被診斷為自閉癥譜系障礙。在歐洲、亞洲等其他地區(qū)，自閉癥的總患病率范圍為2/1000-25/1000，或約為1/500-1/40。在中國，雖然目前缺乏全面、精確的全國性流行病學調查數據，但部分地區(qū)的研究表明，自閉癥的發(fā)病率與國際水平相近。例如，2020年復旦附屬兒科醫(yī)院進行的《中國孤獨癥流行病學的調查研究》顯示，我國自閉癥的患病率約為0.7%，現存患者總數超1000萬，其中0-14歲兒童患者數量約200萬。自閉癥發(fā)病率上升的原因是多方面的。首先，診斷標準的不斷更新和完善是一個重要因素。隨著對自閉癥認識的深入，診斷標準逐漸拓寬，使得更多過去可能未被識別或誤診的患者能夠得到準確診斷。例如，早期的自閉癥診斷標準較為嚴格，可能只關注到典型的、癥狀嚴重的患者，而現在的標準涵蓋了更廣泛的癥狀表現，包括一些非典型的、癥狀較輕的患者，從而導致統(tǒng)計出的發(fā)病率上升。其次，社會認知度的提高也使得更多家長和專業(yè)人員對自閉癥的癥狀更加敏感，能夠更早地發(fā)現和識別潛在的患者。隨著社會對自閉癥的宣傳和教育不斷加強，公眾對自閉癥的認識逐漸加深，家長在發(fā)現孩子出現異常行為時會更及時地尋求專業(yè)評估和診斷。此外，環(huán)境因素的變化也可能對自閉癥的發(fā)病率產生影響。雖然目前環(huán)境因素與自閉癥發(fā)病之間的具體因果關系尚未完全明確，但一些研究提示，孕期母親接觸有害物質（如重金屬、化學物質等）、孕期感染、環(huán)境污染、電磁輻射等可能與自閉癥的發(fā)生風險增加有關。自閉癥在性別分布上存在明顯差異，男性患者的數量顯著多于女性，通常男性與女性的發(fā)病率之比約為3-4:1。這種性別差異的原因可能與多種因素有關。從遺傳學角度來看，研究發(fā)現某些與自閉癥相關的基因可能在男性和女性中的表達或作用方式存在差異。一些基因可能在男性中更容易導致自閉癥的發(fā)生，或者男性對某些基因突變的耐受性較低，從而使得男性更容易受到影響。此外，激素水平的差異也可能起到一定作用。雄激素在男性胎兒的大腦發(fā)育過程中起著重要作用，它可能影響大腦的結構和功能發(fā)育，使得男性大腦在某些方面對自閉癥相關的神經發(fā)育異常更為敏感。而雌激素則可能對女性大腦具有一定的保護作用，降低自閉癥的發(fā)生風險。另外，女性自閉癥患者的癥狀表現可能相對更為隱匿，或者其社交和溝通能力在一定程度上能夠通過其他方式進行補償，導致部分女性患者未被及時診斷出來，這也可能是統(tǒng)計數據中男性患者比例偏高的原因之一。2.1.3自閉癥的病因與發(fā)病機制研究現狀自閉癥的病因和發(fā)病機制極為復雜，目前普遍認為是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結果，但具體的發(fā)病機制仍未完全闡明。遺傳因素在自閉癥的發(fā)病中占據重要地位，大量研究表明自閉癥具有高度的遺傳度。家族遺傳研究顯示，自閉癥患者的親屬中患自閉癥或其他精神發(fā)育障礙的風險明顯高于普通人群。同卵雙胞胎的研究發(fā)現，同卵雙胞胎中如果一方患有自閉癥，另一方患自閉癥的概率可高達70%-90%，而異卵雙胞胎的這一概率則顯著降低。通過全基因組關聯(lián)研究（GWAS）、拷貝數變異（CNV）分析等遺傳學技術，目前已經發(fā)現了多個與自閉癥相關的基因。這些基因涉及多個生物學過程，如神經發(fā)育、神經遞質代謝、突觸功能、免疫調節(jié)等。例如，脆性X智力低下1基因（FMR1）的突變與脆性X綜合征相關，而脆性X綜合征患者常伴有自閉癥癥狀；結節(jié)性硬化癥相關基因（TSC1和TSC2）的突變也與自閉癥的發(fā)生密切相關，結節(jié)性硬化癥患者中約有1/3合并自閉癥。然而，自閉癥并非由單個基因的突變所導致，而是多個基因的共同作用以及基因與環(huán)境因素之間復雜的相互作用的結果，這使得自閉癥的遺傳機制研究極具挑戰(zhàn)性。環(huán)境因素對自閉癥的發(fā)病也具有不可忽視的影響。孕期因素是環(huán)境因素中研究較多的領域，孕期母親的感染、接觸有害物質、心理壓力等都可能增加胎兒患自閉癥的風險。例如，孕期母親感染風疹病毒、巨細胞病毒、弓形蟲等病原體，可能引發(fā)胎兒的免疫反應和炎癥反應，影響胎兒大腦的正常發(fā)育，從而增加自閉癥的發(fā)病風險。母親孕期接觸重金屬（如鉛、汞等）、有機污染物（如多氯聯(lián)苯、農藥等）以及藥物（如丙戊酸等）也與自閉癥的發(fā)生存在關聯(lián)。此外，母親孕期的心理壓力，如長期處于焦慮、抑郁等不良情緒狀態(tài)下，可能會影響體內激素水平和免疫功能，進而對胎兒大腦發(fā)育產生不利影響。出生后的環(huán)境因素，如兒童早期的營養(yǎng)狀況、暴露于環(huán)境污染、腸道微生物群失衡等，也可能在自閉癥的發(fā)病中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現，兒童早期營養(yǎng)不良或缺乏某些關鍵營養(yǎng)素（如維生素D、脂肪酸等）可能影響大腦的正常發(fā)育；暴露于空氣污染、電磁輻射等環(huán)境因素可能干擾神經細胞的正常功能；腸道微生物群失衡可能通過影響腸道屏障功能、免疫調節(jié)和神經遞質代謝等途徑，對大腦功能產生間接影響，與自閉癥的發(fā)生發(fā)展相關。關于自閉癥的發(fā)病機制，目前存在多種假說。神經發(fā)育異常被認為是自閉癥發(fā)病的重要基礎，在自閉癥患者的大腦發(fā)育過程中，出現了神經元遷移異常、分化異常、突觸形成和修剪異常等現象。研究發(fā)現，自閉癥患者大腦的某些腦區(qū)，如額葉、顳葉、海馬等，存在神經元數量和分布的改變，以及神經纖維連接的異常。這些神經發(fā)育異?？赡軐е麓竽X神經網絡的功能失調，影響信息的傳遞和整合，進而引發(fā)自閉癥的核心癥狀。神經遞質失衡也是自閉癥發(fā)病機制的重要研究方向之一，大腦中的神經遞質如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羥色胺（5-HT）等在調節(jié)神經元的活動和信息傳遞中起著關鍵作用。在自閉癥患者中，發(fā)現了神經遞質系統(tǒng)的異常，如谷氨酸能系統(tǒng)功能亢進，導致神經元過度興奮；GABA能系統(tǒng)功能不足，無法有效抑制神經元的活動，打破了大腦神經元的興奮-抑制平衡，可能與自閉癥患者的社交障礙、重復刻板行為等癥狀相關。5-HT水平的異常也與自閉癥的發(fā)病有關，約1/3-1/2的自閉癥患者存在血液中5-HT水平升高的現象，5-HT參與調節(jié)情緒、睡眠、認知等多種生理心理過程，其異?？赡苡绊懽蚤]癥患者的情緒調節(jié)和行為表現。免疫異常在自閉癥的發(fā)病機制中也備受關注，越來越多的研究表明，自閉癥患者存在免疫系統(tǒng)的異常激活和炎癥反應。在自閉癥患者的血液和腦脊液中，檢測到多種炎癥因子水平升高，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。免疫系統(tǒng)的異?？赡芡ㄟ^多種途徑影響大腦的發(fā)育和功能，如炎癥因子可能干擾神經細胞的正常代謝和信號傳導，影響神經遞質的合成和釋放，導致神經發(fā)育異常和神經功能障礙。此外，免疫細胞還可能直接攻擊神經細胞，破壞神經組織的完整性，進一步加重自閉癥的病理過程。2.2星形膠質細胞的生物學特性2.2.1星形膠質細胞的形態(tài)與結構星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中體積最大、數量最多的一類神經膠質細胞，在哺乳動物大腦中廣泛分布，約占大腦細胞總數的50%以上。其名稱源于獨特的形態(tài)，胞體呈星形，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起，這些突起伸展并充填在神經細胞的胞體及其突起之間，起到支持和分隔神經細胞的作用。星形膠質細胞的胞體直徑通常為3-5微米，核呈圓球形，常位于細胞中央。用經典的銀染色法可清晰顯示此類膠質細胞呈星形。在電鏡下觀察，星形膠質細胞中游離核糖核蛋白體和粗面內質網均較少，糖原顆粒豐富，有大量的稱為膠質絲（glialfilament）的原纖維。在用尼氏法等一般染色組織切片中，其核比其他膠質細胞的核大，呈圓形或卵圓形，常染色質多，異染色質少而分散，故染色淺，核仁不明顯。胞質中沒有尼氏體，但具有一般的細胞器，如線粒體、高爾基體等，這些細胞器為細胞的正常代謝和功能活動提供必要的物質和能量基礎。胞質中含有大量交錯排列的原纖維，伸入到胞突中并與胞突平行行走，是構成細胞骨架的主要成分。原纖維的超微結構是一種中間絲，稱為膠質絲，其直徑介于微管（25μm）和微絲（6μm）之間，由相對分子質量為47000-50000的蛋白質組成，此類蛋白質被稱作為膠原原纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidprotein，GFAP）。利用細胞免疫法證明GFAP僅存在于星形膠質細胞的胞體中，因此可利用GFAP的特異性抗體來檢測星形膠質細胞，GFAP的表達水平變化也常被用于反映星形膠質細胞的激活狀態(tài)。根據突起的形態(tài)和胞質絲的數量，星形膠質細胞可分為纖維狀星形膠質細胞和原漿性星形膠質細胞兩類。纖維狀星形膠質細胞的突起較為細長，分支較少，表面平滑，同時胞質中含有大量的膠質絲，主要分布于腦和脊髓的白質區(qū)域。白質主要由神經纖維組成，纖維狀星形膠質細胞的這些特點有助于其在白質中為神經纖維提供穩(wěn)定的物理支持和保護，維持神經纖維的正常結構和功能。原漿性星形膠質細胞的突起更粗壯，分支較多，表面相對粗糙，而胞質內的膠質絲則較少，這類細胞主要存在于腦和脊髓的灰質區(qū)域內?；屹|富含神經元的胞體，原漿性星形膠質細胞的復雜分支突起能夠與眾多神經元胞體緊密接觸，更好地參與神經元的代謝支持、信號調節(jié)等活動。此外，星形膠質細胞突起的末端常膨大形成腳板（footplate）或終足（endfoot），有些腳板貼附在鄰近的毛細血管壁上，因此這些腳板又被稱為血管足或血管周足。通過血管足，星形膠質細胞與血管內皮細胞緊密相連，參與血腦屏障的形成，對維持大腦內環(huán)境的穩(wěn)定起到關鍵作用。某些星形細胞突起還附著在腦脊髓軟膜和室管膜的下膜上，把軟膜、室管膜與神經元分隔開，為神經元營造相對獨立且穩(wěn)定的微環(huán)境。相鄰的星形膠質細胞之間通過縫隙連接相互聯(lián)系，使細胞之間能夠進行離子和小分子物質的交換，實現細胞間的信號傳遞和同步活動，協(xié)調星形膠質細胞群體對神經元的支持和調節(jié)功能。2.2.2星形膠質細胞的功能物質代謝與營養(yǎng)支持：星形膠質細胞在神經元的物質代謝和營養(yǎng)供應方面發(fā)揮著不可或缺的作用。它通過其豐富的突起與毛細血管和神經元緊密相連，形成了一個高效的物質運輸網絡。從毛細血管攝取葡萄糖、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質，并將這些物質轉運給神經元，為神經元的正常生理活動提供能量和物質基礎。星形膠質細胞能夠儲存和代謝糖原，當神經元能量需求增加時，星形膠質細胞可將儲存的糖原分解為葡萄糖，釋放到細胞外間隙供神經元利用。它還參與神經元代謝產物的清除，如將神經元產生的乳酸等代謝廢物轉運回毛細血管，維持神經元周圍微環(huán)境的清潔和穩(wěn)定。在發(fā)育過程中，星形膠質細胞分泌的多種神經營養(yǎng)因子，如腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）等，對于神經元的存活、生長和分化具有關鍵的促進作用。這些神經營養(yǎng)因子可以與神經元表面的受體結合，激活細胞內的信號通路，調節(jié)神經元的基因表達和蛋白質合成，從而影響神經元的形態(tài)和功能發(fā)育。離子平衡調節(jié)：維持神經元周圍的離子平衡對于神經元的正常電活動至關重要，而星形膠質細胞在這一過程中扮演著重要角色。它對胞外鉀離子具有空間緩沖作用，當神經元興奮時，大量鉀離子外流到細胞外間隙，導致局部鉀離子濃度升高。星形膠質細胞能夠迅速攝取這些多余的鉀離子，通過其細胞內的離子轉運機制將鉀離子儲存起來或轉運到其他區(qū)域，從而維持神經元周圍鉀離子濃度的穩(wěn)定。如果星形膠質細胞的鉀離子緩沖功能受損，會導致細胞外鉀離子濃度異常升高，使神經元的興奮性發(fā)生改變，引發(fā)神經系統(tǒng)功能紊亂。星形膠質細胞還參與調節(jié)細胞外液中的鈣離子、鈉離子等其他離子的濃度，通過細胞膜上的離子通道和轉運體，維持離子的動態(tài)平衡，為神經元的正常電生理活動創(chuàng)造適宜的離子環(huán)境。神經遞質調節(jié)：星形膠質細胞深度參與神經遞質的代謝和調節(jié)過程，對神經元之間的信號傳遞起著重要的調控作用。它能夠攝取和代謝多種神經遞質，如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羥色胺（5-HT）等。以谷氨酸為例，谷氨酸是大腦中主要的興奮性神經遞質，在突觸傳遞中發(fā)揮重要作用。星形膠質細胞通過其表面的谷氨酸轉運體（如GLT-1、GLAST等），高效攝取突觸間隙中多余的谷氨酸，將其轉化為谷氨酰胺，然后再轉運回神經元，重新合成谷氨酸，實現谷氨酸的循環(huán)利用。這種對谷氨酸的攝取和代謝過程，不僅能夠清除突觸間隙中多余的谷氨酸，防止其對神經元產生興奮性毒性，還能調節(jié)谷氨酸的濃度，維持突觸傳遞的正常功能。如果星形膠質細胞對谷氨酸的攝取能力下降，會導致突觸間隙中谷氨酸堆積，使神經元過度興奮，可能引發(fā)癲癇、神經退行性疾病等神經系統(tǒng)疾病。星形膠質細胞還可以釋放一些神經遞質或神經調質，如D-絲氨酸、ATP等，對神經元的活動進行調節(jié)。D-絲氨酸作為一種重要的神經調質，能夠與神經元表面的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體結合，調節(jié)NMDA受體的活性，進而影響神經元的興奮性和突觸可塑性。突觸可塑性調節(jié)：突觸可塑性是指突觸的結構和功能可隨著神經元活動和環(huán)境因素的變化而發(fā)生改變的特性，它是學習、記憶和大腦發(fā)育等高級神經功能的基礎。星形膠質細胞在突觸可塑性的調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用。它通過與神經元之間的直接接觸或釋放各種信號分子，影響突觸的形成、發(fā)育和成熟。在發(fā)育過程中，星形膠質細胞分泌的一些細胞外基質成分和信號分子，能夠引導神經元軸突的生長和突觸的形成，促進神經元之間建立正確的連接。在成年大腦中，星形膠質細胞參與調節(jié)突觸的強度和效能。當神經元活動時，星形膠質細胞能夠感知神經元釋放的神經遞質和其他信號分子，并做出相應的反應。它可以通過釋放神經營養(yǎng)因子、神經調質等物質，增強或抑制突觸的傳遞效能，調節(jié)突觸可塑性。例如，在長時程增強（LTP）和長時程抑制（LTD）等突觸可塑性模型中，星形膠質細胞釋放的D-絲氨酸、BDNF等物質，能夠調節(jié)突觸后神經元的興奮性和突觸傳遞的效率，對LTP和LTD的誘導和維持起到重要作用。此外，星形膠質細胞還可以通過調節(jié)突觸周圍的離子濃度和神經遞質濃度，間接影響突觸可塑性。2.2.3星形膠質細胞在神經系統(tǒng)發(fā)育中的作用支持神經元的發(fā)育：在神經系統(tǒng)發(fā)育的早期階段，星形膠質細胞為神經元的發(fā)育提供了重要的物理支持和營養(yǎng)環(huán)境。它通過其豐富的突起形成一個三維的網絡結構，為神經元的遷移和生長提供了腳手架。神經元在遷移過程中，沿著星形膠質細胞的突起延伸方向移動，最終到達它們在大腦中的特定位置。例如，在大腦皮層的發(fā)育過程中，新生的神經元從腦室區(qū)產生后，沿著放射狀膠質細胞（一種特殊的星形膠質細胞）的突起向皮層表面遷移，逐漸形成大腦皮層的分層結構。如果星形膠質細胞的結構或功能受損，會導致神經元遷移異常，影響大腦皮層的正常發(fā)育，可能引發(fā)如腦裂畸形、灰質異位等神經系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病。如前所述，星形膠質細胞還分泌多種神經營養(yǎng)因子和細胞外基質成分，為神經元的存活、生長和分化提供必要的營養(yǎng)物質和信號支持。這些神經營養(yǎng)因子和細胞外基質成分能夠促進神經元軸突和樹突的生長，調節(jié)神經元的形態(tài)發(fā)生和分化。調節(jié)神經元的遷移：神經元的遷移是神經系統(tǒng)發(fā)育過程中的一個關鍵步驟，它決定了神經元在大腦中的正確位置分布，對于大腦功能的正常發(fā)揮至關重要。星形膠質細胞在神經元遷移過程中發(fā)揮著重要的引導和調節(jié)作用。放射狀膠質細胞作為一種特殊類型的星形膠質細胞，從腦室區(qū)延伸至軟腦膜表面，形成放射狀的纖維支架。神經元沿著這些放射狀纖維支架遷移，從而從腦室區(qū)向大腦皮層等部位移動。放射狀膠質細胞通過其表面的黏附分子和信號分子，與遷移的神經元相互作用，引導神經元的遷移方向。例如，放射狀膠質細胞表面的Reelin蛋白能夠與神經元表面的受體結合，激活細胞內的信號通路，調節(jié)神經元的遷移速度和方向。此外，星形膠質細胞還可以通過分泌一些趨化因子和排斥因子，調節(jié)神經元的遷移路徑。這些趨化因子和排斥因子能夠吸引或排斥遷移中的神經元，使其按照預定的路線遷移到正確的位置。在大腦發(fā)育過程中，如果星形膠質細胞分泌的這些信號分子出現異常，會導致神經元遷移紊亂，引起大腦結構和功能的異常。促進神經元的分化：在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中，星形膠質細胞對神經元的分化起著重要的促進作用。它通過與神經元之間的細胞間相互作用以及分泌的各種信號分子，調節(jié)神經元的基因表達和分化進程。星形膠質細胞分泌的一些細胞因子和生長因子，如成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）等，能夠激活神經元內的信號轉導通路，促進神經元向特定的亞型分化。這些信號分子可以調節(jié)神經元中與分化相關的基因表達，促使神經元表達特定的神經遞質合成酶、離子通道和受體等，從而獲得特定的功能。例如，在海馬神經元的分化過程中，星形膠質細胞分泌的BDNF可以促進神經元向谷氨酸能神經元或γ-氨基丁酸能神經元分化，調節(jié)海馬神經元的組成和功能。星形膠質細胞還可以通過與神經元形成緊密的聯(lián)系，提供局部的微環(huán)境信號，影響神經元的分化。這種細胞間的直接接觸和相互作用能夠傳遞重要的分化信號，引導神經元沿著正確的方向分化。維持神經元的存活：在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中，大量的神經元會經歷程序性死亡，只有那些能夠獲得足夠營養(yǎng)支持和生存信號的神經元才能存活下來。星形膠質細胞在維持神經元的存活方面發(fā)揮著關鍵作用。它通過分泌多種神經營養(yǎng)因子，如BDNF、NGF、神經營養(yǎng)素-3（NT-3）等，為神經元提供必要的生存信號。這些神經營養(yǎng)因子可以與神經元表面的特異性受體結合，激活細胞內的抗凋亡信號通路，抑制神經元的程序性死亡。例如，BDNF與神經元表面的TrkB受體結合后，能夠激活PI3K-Akt和MAPK等信號通路，促進神經元的存活和生長。如果缺乏星形膠質細胞分泌的神經營養(yǎng)因子，神經元的存活率會顯著降低。星形膠質細胞還可以通過調節(jié)神經元周圍的微環(huán)境，為神經元的存活提供適宜的條件。它能夠攝取和清除神經元周圍的有害物質，維持離子平衡和神經遞質穩(wěn)態(tài)，減少對神經元的損傷，從而有助于神經元的存活。2.3星形膠質細胞與自閉癥的關聯(lián)研究進展2.3.1臨床研究證據在自閉癥患者的大腦研究中，眾多臨床研究揭示了星形膠質細胞存在多方面的異常表現，這些異常與自閉癥的發(fā)病機制密切相關。在形態(tài)方面，研究發(fā)現自閉癥患者大腦中星形膠質細胞的形態(tài)發(fā)生了顯著改變。通過對自閉癥患者大腦組織切片的觀察，發(fā)現其星形膠質細胞的突起數量、長度和分支模式與正常對照組存在明顯差異。部分腦區(qū)，如顳葉、額葉等與社交、語言和認知功能密切相關的區(qū)域，星形膠質細胞的突起呈現出異常的減少或增多。一些研究報道顯示，自閉癥患者顳葉皮層的星形膠質細胞突起長度明顯縮短，分支減少，導致其與神經元之間的連接和相互作用受到影響。這種形態(tài)上的改變可能會破壞大腦神經網絡的正常結構和功能連接，進而影響信息的傳遞和整合，導致自閉癥患者出現社交障礙、語言發(fā)育遲緩等癥狀。在數量上，自閉癥患者大腦中的星形膠質細胞數量也發(fā)生了變化。多項研究表明，在自閉癥患者的多個腦區(qū)，包括大腦皮層、海馬、小腦等，星形膠質細胞的數量較正常人群有所減少。例如，有研究對自閉癥患者的大腦進行尸檢分析，發(fā)現海馬區(qū)的星形膠質細胞數量顯著降低，這可能會影響海馬在學習、記憶和情緒調節(jié)等方面的功能，與自閉癥患者的認知和社交缺陷有關。然而，也有部分研究報道在某些腦區(qū)存在星形膠質細胞數量增加的情況，這種差異可能與研究對象的個體差異、自閉癥的亞型以及疾病的發(fā)展階段等因素有關。從功能角度來看，自閉癥患者大腦中的星形膠質細胞功能存在明顯異常。首先，在神經遞質代謝方面，星形膠質細胞對神經遞質的攝取、代謝和釋放調節(jié)功能受損。如前所述，谷氨酸是大腦中重要的興奮性神經遞質，正常情況下，星形膠質細胞通過其表面的谷氨酸轉運體攝取突觸間隙中多余的谷氨酸，以維持谷氨酸的穩(wěn)態(tài)。但在自閉癥患者中，研究發(fā)現谷氨酸轉運體（如GLT-1）的表達顯著降低，導致谷氨酸在突觸間隙的清除障礙，使其濃度升高。過高的谷氨酸濃度可能會對神經元產生興奮性毒性，影響神經元的正常功能，引發(fā)神經元的過度興奮，與自閉癥患者的重復刻板行為、情緒不穩(wěn)定等癥狀相關。星形膠質細胞對γ-氨基丁酸（GABA）的代謝也出現異常，GABA作為大腦中主要的抑制性神經遞質，其代謝異常會打破大腦神經元的興奮-抑制平衡，進一步影響神經信號的傳遞和處理。星形膠質細胞在離子平衡調節(jié)方面的功能也受到影響。在自閉癥患者大腦中，星形膠質細胞對鉀離子、鈣離子等重要離子的攝取和轉運能力下降，導致細胞外離子濃度失衡。這種離子失衡會影響神經元的膜電位和興奮性，干擾神經元的正常電活動，從而對大腦的神經功能產生負面影響。此外，星形膠質細胞在維持血腦屏障的完整性方面也存在缺陷。研究發(fā)現，自閉癥患者大腦中血腦屏障的通透性增加，可能與星形膠質細胞與血管內皮細胞之間的相互作用異常有關。血腦屏障通透性的改變會使有害物質更容易進入大腦，破壞大腦內環(huán)境的穩(wěn)定，進一步損害神經元的功能。在炎癥反應和免疫調節(jié)方面，自閉癥患者大腦中的星形膠質細胞呈現出異常的激活狀態(tài)，分泌大量的炎癥因子。如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平升高，這些炎癥因子會引發(fā)局部的炎癥反應，損害神經元和神經膠質細胞，影響神經發(fā)育和神經功能。星形膠質細胞的免疫調節(jié)功能異常還可能導致免疫系統(tǒng)對自身神經組織產生攻擊，進一步加重自閉癥的病理過程。2.3.2動物模型研究成果為了深入探究星形膠質細胞與自閉癥之間的因果關系和內在機制，科研人員通過基因編輯、化學誘導等多種方法建立了一系列動物模型，這些模型在揭示自閉癥發(fā)病機制方面發(fā)揮了重要作用?；蚓庉嫾夹g是建立自閉癥動物模型的常用方法之一。通過敲除或突變與自閉癥相關的基因，可使動物模擬自閉癥患者的某些癥狀和病理特征。例如，利用CRISPR/Cas9技術敲除小鼠的MeCP2基因，MeCP2基因的突變與雷特綜合征相關，而雷特綜合征患者常伴有自閉癥癥狀。敲除MeCP2基因的小鼠表現出社交障礙、重復刻板行為以及學習記憶能力下降等類似自閉癥的行為。進一步研究發(fā)現，這些小鼠大腦中的星形膠質細胞功能出現異常，其對神經遞質的攝取和代謝能力受損，神經營養(yǎng)因子的分泌減少，影響了神經元的正常功能。通過對該模型的研究，揭示了MeCP2基因在星形膠質細胞與神經元相互作用中的重要作用，以及這種作用異常如何導致自閉癥樣行為的出現。在另一項研究中，通過基因編輯使小鼠星形膠質細胞中谷氨酸轉運體GLT-1基因表達下調。結果發(fā)現，這些小鼠出現了社交互動減少、重復刻板行為增加等自閉癥樣行為。由于GLT-1表達下調，導致星形膠質細胞對谷氨酸的攝取能力下降，突觸間隙中谷氨酸濃度升高，引起神經元的過度興奮。這一模型明確了星形膠質細胞谷氨酸轉運功能異常與自閉癥樣行為之間的直接聯(lián)系，為研究自閉癥的發(fā)病機制提供了重要線索?；瘜W誘導方法也被廣泛應用于建立自閉癥動物模型。例如，在孕期給母鼠注射丙戊酸（VPA），可誘導子代小鼠出現自閉癥樣行為。丙戊酸是一種臨床上常用的抗癲癇藥物，但在孕期使用可能會增加胎兒患自閉癥的風險。注射VPA的母鼠所產子代小鼠表現出社交缺陷、刻板行為以及對新環(huán)境的適應能力下降等癥狀。對這些小鼠大腦的研究發(fā)現，其星形膠質細胞發(fā)生了明顯的激活，炎癥因子表達增加，神經遞質系統(tǒng)紊亂。通過該模型的研究，探討了環(huán)境因素（如孕期藥物暴露）通過影響星形膠質細胞功能，進而導致自閉癥樣行為的發(fā)生機制。脂多糖（LPS）誘導的動物模型也為研究自閉癥與星形膠質細胞的關系提供了重要依據。給新生小鼠腹腔注射LPS，可模擬孕期感染的環(huán)境，誘導小鼠出現自閉癥樣行為。研究發(fā)現，LPS處理后的小鼠在社交行為、重復刻板行為等方面表現出異常，同時大腦中的星形膠質細胞被激活，釋放大量炎癥因子，破壞了大腦的神經微環(huán)境。通過對該模型的研究，揭示了孕期感染引發(fā)的炎癥反應如何通過激活星形膠質細胞，導致神經發(fā)育異常和自閉癥樣行為的出現。通過這些動物模型的研究，不僅驗證了臨床研究中關于星形膠質細胞與自閉癥關聯(lián)的發(fā)現，還進一步深入探究了其內在的分子和細胞機制。動物模型能夠在可控的實驗條件下進行各種干預和檢測，為研究人員提供了更深入了解自閉癥發(fā)病機制的平臺。通過對動物模型的研究，發(fā)現了許多潛在的治療靶點和干預策略。例如，針對星形膠質細胞功能異常，開發(fā)能夠調節(jié)星形膠質細胞活性、改善神經遞質代謝或抑制炎癥反應的藥物，為自閉癥的治療提供了新的思路和方向。動物模型研究還可以用于評估新的治療方法的有效性和安全性，為自閉癥的臨床治療提供重要的實驗依據。三、材料與方法3.1實驗動物本研究選用健康的C57BL/6小鼠作為實驗動物，該品系小鼠是目前神經科學研究中最為常用的品系之一。其遺傳背景清晰、基因純合度高，實驗結果具有良好的穩(wěn)定性和重復性，能有效減少實驗誤差，為研究提供可靠的動物模型。實驗小鼠購自[供應商名稱]，該供應商具備專業(yè)的實驗動物繁育資質和嚴格的質量控制體系，確保所提供小鼠的健康狀況和遺傳穩(wěn)定性。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的特定無病原體（SPF）環(huán)境中，維持12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)節(jié)律，保證小鼠生理狀態(tài)的穩(wěn)定。小鼠自由攝食和飲水，所提供的飼料和飲用水均符合實驗動物營養(yǎng)和衛(wèi)生標準。在實驗開始前，讓小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應一周，使其熟悉環(huán)境，減少因環(huán)境變化帶來的應激反應，確保實驗結果不受外界因素干擾。為滿足實驗需求，進行小鼠的繁殖工作。選取8-10周齡、健康且體重適宜的雌雄小鼠，按照1:1的比例合籠飼養(yǎng)。每日清晨進行陰道涂片檢查，以確定是否受孕。若發(fā)現精子，則將當天記為胚胎發(fā)育的第0.5天（E0.5）。懷孕母鼠單獨飼養(yǎng)，給予充足的食物、水和適宜的環(huán)境，保障孕期母鼠的健康和胚胎的正常發(fā)育。3.2主要實驗材料與儀器設備試劑質粒DNA：用于子宮內胚胎電轉的質粒，包含激活星形膠質細胞的相關基因，如膠質纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子驅動的特定基因表達元件。質粒由本實驗室構建并保存，通過分子克隆技術將目的基因插入到合適的載體中，經過測序驗證確保基因序列的正確性。在使用前，利用無內毒素質粒提取試劑盒（如Qiagen公司的PlasmidMaxiKit）進行大量提取和純化，以滿足實驗需求。麻醉劑：戊巴比妥鈉，購自Sigma-Aldrich公司。用于對孕鼠進行麻醉，以便進行子宮內胚胎電轉手術。使用時，將戊巴比妥鈉用生理鹽水配制成合適濃度（通常為1%-2%）的溶液，通過腹腔注射的方式給予孕鼠，劑量根據孕鼠體重進行調整，一般為50-70mg/kg。免疫熒光染色相關試劑：多聚甲醛（PFA），購自國藥集團化學試劑有限公司，用于固定小鼠海馬組織。將PFA配制成4%的溶液，在固定組織時，將組織浸泡在該溶液中4℃過夜，以保持組織的形態(tài)和抗原性。正常山羊血清，購自VectorLaboratories公司，用于封閉非特異性結合位點。在免疫熒光染色過程中，將正常山羊血清稀釋后（通常為5%-10%）滴加在組織切片上，室溫孵育30-60分鐘。TritonX-100，購自Sigma-Aldrich公司，用于增加細胞膜的通透性，使抗體能夠更好地進入細胞內。將TritonX-100配制成0.1%-0.3%的溶液，在抗原修復步驟后，將切片浸泡在該溶液中10-15分鐘。DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），購自Invitrogen公司，用于染細胞核。將DAPI稀釋成合適濃度（如1μg/ml），在染色的最后一步，將切片與DAPI溶液孵育5-10分鐘，然后用PBS沖洗，在熒光顯微鏡下觀察時，細胞核會被染成藍色。蛋白質免疫印跡相關試劑：RIPA裂解液（Radio-ImmunoprecipitationAssaybuffer），購自碧云天生物技術有限公司，用于提取小鼠海馬組織的總蛋白。RIPA裂解液中含有多種蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解和修飾。在提取蛋白時，將海馬組織在冰上用RIPA裂解液勻漿，然后在4℃下離心，取上清即為總蛋白溶液。BCA蛋白定量試劑盒（BicinchoninicAcidProteinAssayKit），購自ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白濃度。該試劑盒利用BCA試劑與蛋白質中的銅離子結合形成紫色絡合物，通過比色法測定吸光度，從而計算出蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自Bio-Rad公司，用于制備SDS-PAGE凝膠，以分離不同分子量的蛋白質。按照試劑盒說明書的步驟，將各種試劑混合均勻，倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后即可使用。PVDF膜（PolyvinylideneFluoridemembrane），購自Millipore公司，用于蛋白質的轉膜。在SDS-PAGE電泳結束后，將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上，以便后續(xù)進行抗體孵育和檢測。脫脂牛奶，用于封閉PVDF膜上的非特異性結合位點。將脫脂牛奶配制成5%的溶液，在轉膜后，將PVDF膜浸泡在該溶液中室溫孵育1-2小時。ECL化學發(fā)光試劑（EnhancedChemiluminescencereagent），購自ThermoFisherScientific公司，用于檢測與目的蛋白結合的抗體。當HRP標記的二抗與一抗結合后，加入ECL化學發(fā)光試劑，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下，會產生熒光信號，從而檢測出目的蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR相關試劑：Trizol試劑，購自Invitrogen公司，用于提取小鼠海馬組織的總RNA。Trizol試劑能夠迅速裂解細胞，使RNA與蛋白質和DNA分離，然后通過氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，獲得高純度的總RNA。逆轉錄試劑盒，如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），用于將總RNA逆轉錄為cDNA。該試劑盒中含有逆轉錄酶、引物、dNTPs等成分，能夠高效地將RNA逆轉錄為cDNA，同時還能去除基因組DNA的污染。SYBRGreen熒光染料，購自Roche公司，用于實時熒光定量PCR反應。在PCR反應體系中加入SYBRGreen熒光染料，它能夠與雙鏈DNA結合，在PCR擴增過程中，隨著DNA的擴增，熒光信號會逐漸增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，就可以計算出目的基因的相對表達量。PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據目的基因的序列設計特異性引物，引物的設計遵循相關的引物設計原則，如引物長度、GC含量、Tm值等，以確保引物的特異性和擴增效率?？贵w兔抗GFAP抗體：購自DAKO公司，GFAP是星形膠質細胞的特異性標志物，該抗體用于免疫熒光染色和蛋白質免疫印跡實驗中，檢測星形膠質細胞的激活情況和GFAP的表達水平。在免疫熒光染色中，稀釋比例通常為1:200-1:500；在蛋白質免疫印跡實驗中，稀釋比例為1:1000-1:2000。鼠抗NeuN抗體：購自Millipore公司，NeuN是神經元的特異性標志物，用于免疫熒光染色，以標記神經元，觀察神經元的形態(tài)和分布情況。稀釋比例一般為1:200-1:400。兔抗GluR1抗體：購自Abcam公司，GluR1是谷氨酸受體1，參與谷氨酸能神經傳遞和突觸可塑性。在蛋白質免疫印跡實驗中，用于檢測海馬組織中GluR1的表達水平，稀釋比例為1:1000-1:1500。兔抗GABAARα1抗體：購自SantaCruzBiotechnology公司，GABAARα1是γ-氨基丁酸A型受體的α1亞基，在抑制性神經傳遞中起重要作用。用于蛋白質免疫印跡實驗，檢測其在海馬組織中的表達水平，稀釋比例為1:800-1:1200。HRP標記的山羊抗兔IgG抗體：購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于蛋白質免疫印跡實驗中，與一抗（兔抗抗體）結合，通過HRP催化ECL化學發(fā)光試劑產生熒光信號，從而檢測目的蛋白。稀釋比例為1:2000-1:5000。FITC標記的山羊抗兔IgG抗體：購自Invitrogen公司，用于免疫熒光染色實驗中，與兔抗GFAP抗體等一抗結合，在熒光顯微鏡下，FITC會發(fā)出綠色熒光，從而標記出相應的抗原。稀釋比例為1:100-1:200。儀器設備手術顯微鏡：型號為LeicaM205C，購自Leica公司。用于子宮內胚胎電轉手術，在手術過程中，能夠提供清晰的視野，便于準確地將質粒DNA注射到胚胎的側腦室中，并進行電轉操作。其高分辨率和放大倍數可以幫助實驗人員觀察胚胎的細微結構，確保手術的精確性。電轉儀：型號為BTXECM830，購自HarvardApparatus公司。與手術顯微鏡配合使用，用于子宮內胚胎電轉。通過施加特定的電場，使質粒DNA導入胚胎海馬星形膠質細胞中。電轉儀可以精確控制電場強度、脈沖寬度和脈沖次數等參數，以實現高效的基因轉染。行為學測試設備三箱社交實驗裝置：自制，由三個大小相同且相互連通的透明有機玻璃箱子組成，每個箱子的尺寸為40cm×20cm×20cm。用于評估小鼠的社交行為，通過觀察小鼠在不同箱子中的停留時間和與陌生小鼠的互動情況，分析小鼠的社交偏好和社交新奇偏好。在實驗過程中，通過視頻跟蹤系統(tǒng)記錄小鼠的行為軌跡，以便后續(xù)進行數據分析。大理石掩埋實驗裝置：利用小鼠飼養(yǎng)籠，在籠中均勻放置20顆直徑約為1cm的大理石。用于測試小鼠的重復刻板行為，通過記錄小鼠在一定時間內掩埋大理石的數量，評估小鼠重復刻板行為的嚴重程度。實驗環(huán)境保持安靜，避免外界干擾。曠場實驗裝置：型號為XR-XZ301，購自上海欣軟信息科技有限公司。由一個正方形的開闊場地和視頻跟蹤系統(tǒng)組成，場地邊長為50cm，周圍有40cm高的圍欄。用于評估小鼠的運動能力、焦慮水平和探索行為。視頻跟蹤系統(tǒng)可以實時記錄小鼠在曠場中的活動軌跡、運動距離、在中央區(qū)域的停留時間等參數，通過軟件分析這些參數，了解小鼠的行為特征。熒光顯微鏡：型號為OlympusIX73，購自Olympus公司。用于免疫熒光染色切片的觀察和拍照。配備有不同波長的激發(fā)光和相應的濾光片，能夠激發(fā)FITC、DAPI等熒光染料發(fā)出熒光，并采集熒光圖像。其高分辨率和高靈敏度可以清晰地觀察到細胞的形態(tài)和熒光標記的分布情況，為實驗結果的分析提供準確的圖像資料。蛋白質電泳系統(tǒng)：型號為Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，購自Bio-Rad公司。包括電泳槽、電源等組件，用于SDS-PAGE電泳，分離不同分子量的蛋白質。該系統(tǒng)具有操作簡便、電泳速度快、分離效果好等優(yōu)點，能夠滿足實驗對蛋白質分離的要求。轉膜儀：型號為Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem，購自Bio-Rad公司。用于將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上。該轉膜儀采用半干轉的方式，具有轉膜效率高、時間短等優(yōu)點，能夠快速、有效地將蛋白質轉移到膜上，便于后續(xù)的抗體孵育和檢測?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)：型號為ChemiDocXRS+，購自Bio-Rad公司。用于檢測蛋白質免疫印跡實驗中的ECL化學發(fā)光信號。該系統(tǒng)具有高靈敏度和高分辨率，能夠捕捉到微弱的熒光信號，并生成清晰的圖像，通過軟件分析圖像，可以定量分析目的蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR儀：型號為RocheLightCycler480，購自Roche公司。用于實時熒光定量PCR反應，通過實時監(jiān)測PCR擴增過程中熒光信號的變化，精確地計算目的基因的相對表達量。該儀器具有反應速度快、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，能夠準確地檢測基因的表達變化。低溫高速離心機：型號為Eppendorf5424R，購自Eppendorf公司。用于提取蛋白和RNA過程中的樣品離心，能夠在低溫條件下（通常為4℃）以高轉速（最高可達16,000rpm）離心樣品，使蛋白質、RNA等物質與其他雜質分離，保證樣品的純度和完整性。移液器：包括不同量程的單道移液器（如2-20μl、20-200μl、200-1000μl）和多道移液器（如8道20-200μl），品牌為Eppendorf。用于精確移取各種試劑和樣品，確保實驗操作的準確性和重復性。移液器定期進行校準，以保證移液量的精度。3.3實驗方法3.3.1子宮內胚胎電轉技術（IUE）激活海馬星形膠質細胞子宮內胚胎電轉技術（IUE）是在胚胎發(fā)育過程中，將外源基因導入特定腦區(qū)細胞的有效方法。其原理是利用電場作用，使細胞膜通透性增加，從而使外源質粒DNA能夠進入細胞。在本實驗中，利用該技術將含有激活星形膠質細胞相關基因的質粒導入小鼠胚胎海馬星形膠質細胞，實現對海馬星形膠質細胞的激活。具體操作步驟如下：在小鼠胚胎發(fā)育至E15.5-E16.5時，對孕鼠進行腹腔注射1%-2%戊巴比妥鈉溶液（50-70mg/kg）進行麻醉。將孕鼠仰臥固定于手術臺上，腹部區(qū)域進行剃毛和消毒處理。沿腹部正中線切開皮膚和肌肉，暴露子宮，將子宮輕柔地移出腹腔，置于濕潤的紗布上，以保持其濕潤和溫度。使用微量注射器將含有激活星形膠質細胞相關基因（如GFAP啟動子驅動的特定基因表達元件）的質粒DNA溶液（濃度為1-2μg/μl）緩慢注射到胚胎的側腦室中，每個胚胎注射量約為1-2μl。注射完畢后，將一對特制的電極（電極間距約為1-2mm）小心地放置在胚胎海馬區(qū)域兩側的子宮壁外，電極的正極靠近注射部位。通過電轉儀（如BTXECM830）施加一系列電脈沖，參數設置為電場強度80-100V/cm，脈沖寬度50-100ms，脈沖次數5-7次，脈沖間隔1s。電轉過程中，密切觀察胚胎的反應，確保電轉操作的安全性和有效性。電轉結束后，將子宮小心地放回腹腔，縫合肌肉和皮膚，對傷口進行消毒處理。將孕鼠放回飼養(yǎng)籠中，給予適當的護理和保暖，待其蘇醒。術后，密切觀察孕鼠的健康狀況和行為表現，確保其正常妊娠和分娩。3.3.2行為學檢測社交行為檢測三箱社交實驗：實驗目的是評估小鼠的社交偏好和社交新奇偏好，以判斷其社交能力是否存在缺陷。實驗裝置為自制的三箱社交實驗裝置，由三個大小相同且相互連通的透明有機玻璃箱子組成，每個箱子尺寸為40cm×20cm×20cm。實驗前，將實驗小鼠放入中間箱子適應5分鐘。然后，在一側箱子中放入陌生小鼠A（與實驗小鼠年齡、性別相同，且來自不同窩），另一側箱子為空。打開中間箱子與兩側箱子的通道，讓實驗小鼠在三箱中自由穿梭10分鐘，同時使用視頻跟蹤系統(tǒng)記錄實驗小鼠的行為。記錄實驗小鼠在裝有陌生小鼠A的箱子和空箱子中的停留時間，以及與陌生小鼠A的互動時間（如嗅聞、追逐等行為的持續(xù)時間）。如果實驗小鼠在裝有陌生小鼠A的箱子中停留時間顯著長于空箱子，且與陌生小鼠A有較多的互動行為，表明其具有正常的社交偏好；反之，則提示社交能力受損。接著，將陌生小鼠A換成陌生小鼠B，再次讓實驗小鼠在三箱中自由活動10分鐘，記錄實驗小鼠與陌生小鼠B的互動情況。正常小鼠通常會對陌生小鼠B表現出更多的探索和互動行為，即具有社交新奇偏好；若實驗小鼠對陌生小鼠B的反應與陌生小鼠A無明顯差異，說明其社交新奇偏好受損。居住-入侵實驗：用于檢測小鼠的侵略行為和社交互動能力。實驗設備與三箱社交實驗類似，實驗鼠先在實驗場所內適應30分鐘。然后放入陌生鼠（非同窩同基因型入侵鼠，年齡、性別與實驗鼠相同），開始記錄從入侵者進入到發(fā)生交互行為的時間、有無攻擊行為、攻擊行為的次數以及持續(xù)時間等參數。如果實驗小鼠對陌生鼠表現出較少的攻擊行為，或從入侵者進入到發(fā)生交互行為的時間明顯延長，可能提示其社交互動和侵略行為存在異常。重復刻板行為檢測大理石掩埋實驗：旨在評估小鼠的重復刻板行為。利用小鼠飼養(yǎng)籠，在籠中均勻放置20顆直徑約為1cm的大理石。將實驗小鼠放入飼養(yǎng)籠中，讓其自由活動30分鐘。30分鐘后，觀察并記錄被小鼠掩埋的大理石數量，掩埋數量越多，表明小鼠的重復刻板行為越嚴重。在實驗過程中，保持實驗環(huán)境安靜，避免外界干擾，以確保實驗結果的準確性。溝通行為檢測超聲發(fā)聲檢測：用于檢測小鼠的溝通行為。將出生后7-10天的幼鼠從母鼠身邊短暫分離（一般為3-5分鐘），模擬幼鼠與母鼠分離的應激狀態(tài)。使用超聲麥克風（頻率響應范圍為20-100kHz）記錄幼鼠在分離期間發(fā)出的超聲信號，超聲信號的頻率范圍通常在30-80kHz之間。通過分析超聲發(fā)聲的次數、持續(xù)時間和頻率特征等參數，評估幼鼠的溝通能力。自閉癥樣行為的小鼠可能會出現超聲發(fā)聲次數減少、持續(xù)時間縮短或頻率異常等情況。3.3.3生化檢測神經元樹突棘密度檢測：樹突棘是神經元樹突上的微小突起，與突觸傳遞和神經元的信息整合密切相關，其密度的變化可反映神經元的結構和功能改變。采用高爾基染色法結合圖像分析技術檢測神經元樹突棘密度。具體步驟為：取小鼠海馬組織，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小時。將固定后的組織進行高爾基染色，將組織浸泡在Golgi-Cox染色液中，在暗處反應14-21天。染色完成后，將組織切成100-150μm的厚切片，使用振蕩切片機進行切片操作。在顯微鏡下選取合適的視野，拍攝海馬神經元樹突的圖像，每個樣本至少拍攝5-10個不同視野的圖像。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對拍攝的圖像進行分析，首先將圖像轉換為灰度圖像，然后通過調整閾值將樹突棘從背景中分離出來。利用軟件的計數工具，手動或自動計數樹突棘的數量，并測量樹突的長度。最后計算樹突棘密度，即樹突棘數量與樹突長度的比值，單位為個/μm。通過比較實驗組和對照組小鼠海馬神經元樹突棘密度的差異，分析星形膠質細胞激活對神經元樹突棘密度的影響。GAD67陽性神經元數量檢測：GAD67是γ-氨基丁酸（GABA）合成的關鍵酶，GAD67陽性神經元主要為GABA能神經元，其數量和功能的變化與大腦的抑制性神經傳遞密切相關。采用免疫熒光染色法檢測GAD67陽性神經元數量。取小鼠海馬組織，制作冰凍切片，厚度為10-15μm。將切片從冰凍切片機中取出，室溫放置5-10分鐘，使其溫度回升。將切片放入4%多聚甲醛溶液中固定15-20分鐘，以保持組織的形態(tài)和抗原性。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除固定液。用0.3%TritonX-100溶液處理切片10-15分鐘，增加細胞膜的通透性，使抗體能夠更好地進入細胞內。再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。用5%正常山羊血清封閉切片30-60分鐘，以減少非特異性結合。將兔抗GAD67抗體（稀釋比例為1:200-1:500）滴加在切片上，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。加入FITC標記的山羊抗兔IgG抗體（稀釋比例為1:100-1:200），室溫孵育1-2小時。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。用DAPI染核5-10分鐘，然后用PBS沖洗。將切片用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。在顯微鏡下，GAD67陽性神經元會發(fā)出綠色熒光，細胞核被DAPI染成藍色。隨機選取海馬不同區(qū)域（如CA1、CA3、DG區(qū)）的多個視野，計數GAD67陽性神經元的數量，每個樣本至少計數3-5個不同視野。通過比較實驗組和對照組小鼠海馬不同區(qū)域GAD67陽性神經元數量的差異，分析星形膠質細胞激活對GABA能神經元的影響。3.4數據統(tǒng)計與分析本研究使用GraphPadPrism9.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計與分析，該軟件功能強大，能夠滿足多種數據類型和統(tǒng)計分析需求，在科研領域廣泛應用。對于行為學檢測數據，如三箱社交實驗中實驗小鼠在不同箱子中的停留時間、與陌生小鼠的互動時間，大理石掩埋實驗中被掩埋的大理石數量，以及曠場實驗中小鼠的運動距離、在中央區(qū)域的停留時間等，均以平均值±標準差（Mean±SD）表示。兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，以判斷實驗組和對照組在這些行為學指標上是否存在顯著差異。若涉及多組數據的比較，如不同處理組小鼠在同一行為學測試中的數據，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。當方差分析結果顯示存在顯著差異時，進一步進行Tukey'sposthoc檢驗，以確定具體哪些組之間存在差異，明確不同處理對小鼠行為學的影響。在生化檢測數據方面，免疫熒光染色中神經元樹突棘密度和GAD67陽性神經元數量，以及蛋白質免疫印跡實驗中各目的蛋白的表達水平，同樣以平均值±標準差（Mean±SD）表示。對于這些數據的分析，若為兩組比較，采用獨立樣本t檢驗；若為多組比較，則采用單因素方差分析結合Tukey'sposthoc檢驗。實時熒光定量PCR檢測的目的基因相對表達量數據，經標準化處理后，以平均值±標準差（Mean±SD）表示，統(tǒng)計分析方法與上述一致。在數據分析過程中，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。當P<0.05時，認為實驗組與對照組之間在相應指標上存在顯著差異，表明實驗處理對小鼠的行為學或生化指標產生了影響；當P≥0.05時，則認為差異不具有統(tǒng)計學意義，即實驗處理對相應指標的影響不顯著。在進行統(tǒng)計分析前，先對數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，確保數據符合相應統(tǒng)計方法的適用條件，以保證分析結果的準確性和可靠性。四、實驗結果4.1子宮內胚胎電轉EGFR質粒對海馬星形膠質細胞的激活效果為了驗證子宮內胚胎電轉EGFR質粒對海馬星形膠質細胞的激活效果，在小鼠胚胎發(fā)育至E15.5-E16.5時，對孕鼠進行子宮內胚胎電轉手術，將含有EGFR質粒的溶液注射到胚胎側腦室，并進行電轉操作。待小鼠出生并飼養(yǎng)至合適年齡后，取海馬組織進行免疫熒光染色和蛋白質免疫印跡實驗。免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，電轉EGFR質粒組小鼠海馬區(qū)GFAP陽性的星形膠質細胞數量明顯增多，且細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。對照組中，星形膠質細胞形態(tài)較為規(guī)則，突起細長且分支較少；而電轉組中，星形膠質細胞胞體明顯增大，突起變得短粗且分支增多，呈現出典型的激活狀態(tài)下的形態(tài)特征。通過對GFAP陽性細胞的熒光強度進行定量分析，發(fā)現電轉組的熒光強度顯著高于對照組（P<0.01），這進一步表明電轉EGFR質粒能夠有效激活海馬星形膠質細胞，使其GFAP表達水平顯著升高。（圖4-1）[此處插入免疫熒光染色結果圖，包括對照組和電轉組小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細胞的熒光圖像，標尺為50μm]圖4-1免疫熒光染色檢測海馬星形膠質細胞激活情況圖4-1免疫熒光染色檢測海馬星形膠質細胞激活情況蛋白質免疫印跡實驗結果與免疫熒光染色結果一致。電轉EGFR質粒組小鼠海馬組織中GFAP蛋白的表達水平較對照組顯著上調（P<0.01）。通過對蛋白條帶的灰度值分析，定量地顯示了GFAP蛋白表達的增加幅度。這從蛋白質水平進一步證實了子宮內胚胎電轉EGFR質粒能夠成功激活海馬星形膠質細胞，導致其特征性蛋白GFAP的表達顯著增加。（圖4-2）[此處插入蛋白質免疫印跡實驗結果圖，包括對照組和電轉組小鼠海馬組織GFAP蛋白的免疫印跡條帶，下方標注分子量Marker和蛋白名稱]圖4-2蛋白質免疫印跡檢測海馬組織GFAP蛋白表達水平圖4-2蛋白質免疫印跡檢測海馬組織GFAP蛋白表達水平綜上所述，子宮內胚胎電轉EGFR質粒顯著激活了電轉側的海馬星形膠質細胞，無論是從細胞形態(tài)學特征還是蛋白質表達水平上，都表現出明顯的激活效果，為后續(xù)研究星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響奠定了基礎。4.2星形膠質細胞激活對小鼠自閉癥樣行為的影響4.2.1社交行為測試結果為了評估星形膠質細胞激活對小鼠社交行為的影響，采用三箱社交實驗對實驗組（電轉EGFR質粒激活海馬星形膠質細胞）和對照組小鼠進行檢測。實驗結果顯示，對照組小鼠在裝有陌生小鼠A的箱子中的停留時間顯著長于空箱子（P<0.01），與陌生小鼠A的互動時間也較多，表明對照組小鼠具有明顯的社交偏好。在社交新奇偏好測試中，對照組小鼠對陌生小鼠B的探索和互動時間明顯多于陌生小鼠A（P<0.05），說明對照組小鼠能夠區(qū)分不同的陌生小鼠，具有正常的社交新奇偏好。然而，實驗組小鼠的社交行為表現出明顯異常。在社交偏好測試中，實驗組小鼠在裝有陌生小鼠A的箱子和空箱子中的停留時間無顯著差異（P>0.05），與陌生小鼠A的互動時間也明顯少于對照組（P<0.01），這表明實驗組小鼠的社交偏好受損。在社交新奇偏好測試中，實驗組小鼠對陌生小鼠B和陌生小鼠A的互動時間無明顯差異（P>0.05），說明實驗組小鼠無法區(qū)分不同的陌生小鼠，社交新奇偏好缺失。（圖4-3