西弗吉尼亞大學(xué)真菌評估標(biāo)準(zhǔn)手冊1.引言本手冊旨在為西弗吉尼亞大學(xué)（WVU）的真菌研究、生態(tài)監(jiān)測、植物病害管理及相關(guān)領(lǐng)域提供標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的真菌評估方法。手冊整合形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定與生態(tài)學(xué)分析，確保真菌分類鑒定的一致性與可靠性，支撐校園及阿巴拉契亞區(qū)域的生物多樣性研究、病害防控與生態(tài)修復(fù)工作。2.評估范圍2.1適用對象類群：子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門及壺菌門的真菌（含酵母、霉菌、大型子實體真菌）；場景：校園及周邊生態(tài)系統(tǒng)的真菌多樣性調(diào)查、植物/動物病原真菌診斷、實驗室分離菌株分類、菌根/內(nèi)生真菌共生關(guān)系評估；數(shù)據(jù)類型：形態(tài)學(xué)特征、分子序列數(shù)據(jù)、生態(tài)關(guān)聯(lián)信息。2.2排除場景極端生境（如深海熱泉、火山口）的未知類群（需結(jié)合電鏡、宏基因組技術(shù)時，本手冊提供基礎(chǔ)參考）；超微結(jié)構(gòu)依賴的類群（如微孢子蟲），需補充透射電鏡分析。3.分類體系與評估框架3.1分類依據(jù)參考《真菌詞典（第11版）》（*Ainsworth&Bisby’sDictionaryoftheFungi*）的分類系統(tǒng)，結(jié)合WVU在阿巴拉契亞地區(qū)的研究積累，將真菌分為病原真菌（危害植被/作物）、共生真菌（菌根、內(nèi)生菌）、腐生真菌（物質(zhì)循環(huán)類群）三大功能類群，分類層級涵蓋門→綱→目→科→屬→種。3.2鑒定維度維度核心指標(biāo)參考標(biāo)準(zhǔn)-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------形態(tài)學(xué)宏觀：子實體類型（傘狀/盤狀/塊狀）、顏色（Munsell色卡）、大小（mm級）；

微觀：孢子形態(tài)（單胞/多隔）、孢子大?。ㄆ骄怠罉?biāo)準(zhǔn)差）、菌絲特征（鎖狀聯(lián)合、直徑）《真菌形態(tài)鑒定手冊》（WVU版）分子生物學(xué)ITS序列（核心條形碼）、LSU/SSU序列（疑難類群）；

序列相似度≥97%判定為同種，95-97%為近緣種NCBIGenBank、UNITE數(shù)據(jù)庫生態(tài)學(xué)宿主（植物種名、組織類型）、生境（森林/草地/建筑）、季節(jié)（月份）《阿巴拉契亞生態(tài)手冊》（WVU出版）致病性宿主重要性（瀕危物種/經(jīng)濟(jì)作物）、致病力（發(fā)病率、死亡率）風(fēng)險矩陣（附錄2）4.操作流程4.1樣品采集方法：區(qū)域調(diào)查采用“5點采樣法”（每100m2設(shè)1個樣點），病害調(diào)查采用“目標(biāo)采樣”（病變組織+健康對照）；記錄：經(jīng)緯度（GPS定位）、海拔、生境照片（WVU生態(tài)APP），樣品用無菌紙包裹，4℃保存≤48小時。4.2預(yù)處理與分離清除雜質(zhì)，子實體用70%乙醇表面消毒；菌絲體用PDA培養(yǎng)基（含抗生素）分離純化，25℃培養(yǎng)5-7天。4.3鑒定流程1.形態(tài)學(xué)初篩：通過“子實體類型-孢子特征”檢索表（附錄1）初步歸類；2.分子鑒定：CTAB法提取DNA，PCR擴(kuò)增ITS區(qū)域（引物：ITS1/ITS4，附錄3），測序后BLAST比對；3.綜合判定：結(jié)合形態(tài)、分子、生態(tài)數(shù)據(jù)，由2名研究員交叉驗證，分歧時提交“真菌分類委員會”評審。4.4數(shù)據(jù)記錄與報告表格模板：采集ID、形態(tài)描述、分子數(shù)據(jù)、鑒定結(jié)論（附錄4）；報告格式：摘要、材料與方法、結(jié)果（附顯微照片、序列比對圖）、討論（與同類研究比較）。5.質(zhì)量控制5.1人員資質(zhì)需通過WVU“真菌鑒定培訓(xùn)”（每年更新），考核通過后持證上崗。5.2設(shè)備校準(zhǔn)顯微鏡：每月校準(zhǔn)目鏡測微尺；PCR儀：每周驗證溫度梯度（±0.5℃）。5.3重復(fù)驗證每個樣品至少2次獨立PCR擴(kuò)增，形態(tài)學(xué)鑒定由2名研究員交叉驗證。5.4誤差處理分歧時提交“真菌分類委員會”（由植物病理、生態(tài)系教授組成）評審，必要時邀請校外專家會診。6.應(yīng)用案例6.1校園櫟樹枯萎病調(diào)查（2023）形態(tài)學(xué)：分生孢子梗黑色，孢子單胞、橢圓形（大?。?.2±1.5μm）；分子：ITS序列相似度99%（匹配*Ophiostomaulmi*）；評估：高風(fēng)險（宿主為校園古樹，發(fā)病率30%），建議噴施生物防治菌劑。6.2土壤真菌多樣性研究（2022）鑒定出32個屬，*Glomus*（菌根真菌）占比25%；應(yīng)用：為校園綠化的菌根接種提供物種清單，提升苗木成活率。附錄附錄1：形態(tài)學(xué)檢索表（簡化版）子實體類型孢子特征候選類群--------------------------------------------------------------------傘狀單胞、橢圓形*Agaricus*（蘑菇屬）盤狀多隔、線形*Peziza*（盤菌屬）塊狀無隔、球形*Scleroderma*（硬皮馬勃屬）附錄2：致病性風(fēng)險矩陣宿主重要性\致病力低（<10%發(fā)病率）中（10-50%發(fā)病率）高（>50%發(fā)病率）---------------------------------------------------------------------------瀕危物種/經(jīng)濟(jì)作物中風(fēng)險高風(fēng)險極高風(fēng)險常見植被低風(fēng)險中風(fēng)險高風(fēng)險附錄3：PCR引物序列ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’附錄4：數(shù)據(jù)記錄表模板（節(jié)選）采集ID宿主植物生境孢子大?。é蘭）ITS序列相似度鑒定結(jié)論----------------------------------------------------------------------------WVU001櫟樹校園森林8.2±1.599%*Ophiostomaulmi*推薦文獻(xiàn)*FungalSystematics:PrinciplesandPractice*（2020）WVU研究報告：《Appalac