葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞的體外治療研究：特性、靶向性與療效分析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1喉癌的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出令人擔(dān)憂的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有二十萬人被診斷為喉癌，而死亡人數(shù)高達(dá)十萬，這給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國，喉癌的發(fā)病率約為1.5-3/10萬人口，約占全身惡性腫瘤的1%，在耳鼻咽喉科領(lǐng)域，其發(fā)病率僅次于鼻咽癌和鼻腔、鼻竇癌，在北方地區(qū)居第二位，南方地區(qū)居第三位。喉癌的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，其中吸煙、飲酒是最為主要的風(fēng)險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期吸煙會(huì)使喉部黏膜受到有害物質(zhì)的刺激，增加細(xì)胞癌變的幾率；而過量飲酒則會(huì)損害喉部組織的正常功能，降低免疫力，為癌細(xì)胞的滋生創(chuàng)造條件。此外，工業(yè)粉塵、二氧化硫以及長(zhǎng)期接觸有毒化學(xué)物質(zhì)等環(huán)境因素，也在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了推波助瀾的作用。喉癌的早期癥狀往往不明顯，容易被患者忽視。例如聲門上型癌和喉咽癌，在早期可能僅表現(xiàn)為輕微的咽部不適、異物感或聲音嘶啞，這些癥狀與常見的咽喉疾病相似，很難引起患者的警覺，常常延誤至晚期才被明確診斷。一旦病情發(fā)展到晚期，癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著升高，手術(shù)全切率降低，患者的5年生存率不到30%，而且患者往往會(huì)終身失去言語功能，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。喉癌局部復(fù)發(fā)和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，晚期癌無論采用手術(shù)、放療還是化療等傳統(tǒng)治療手段，效果均不盡如人意。手術(shù)治療雖然能夠直接切除腫瘤組織，但創(chuàng)傷較大，且存在術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷，引發(fā)一系列不良反應(yīng)；化療藥物則缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)等不良反應(yīng)。因此，如何提高晚期喉癌治療后的生存率和生活質(zhì)量，一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，開發(fā)新的治療方法迫在眉睫。1.1.2納米藥物在腫瘤治療中的興起隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米藥物在腫瘤治療領(lǐng)域逐漸嶄露頭角，為腫瘤治療帶來了新的希望。納米藥物是納米科技與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，它利用納米顆粒（Nanoparticles，NP）極小的粒徑、高的比表面積及表面活性等特殊性質(zhì)，構(gòu)建成納米藥物載體（DrugCarrier）。這種載體具有許多傳統(tǒng)藥物載體所不具備的優(yōu)勢(shì)，能夠有效逃逸體內(nèi)吞噬系統(tǒng)，避免被免疫系統(tǒng)過早清除，從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；同時(shí)，納米藥物載體還具有載藥量大的特點(diǎn)，可以攜帶更多的藥物分子，提高藥物的治療效果。分子靶向治療是納米藥物在腫瘤治療中的重要應(yīng)用方向之一。它是在納米藥物載體的表面連接某種物質(zhì)，如單克隆抗體、靶向配體等，使其能與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)甚至是唯一表達(dá)的抗原或者受體特異結(jié)合，介導(dǎo)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞起到相對(duì)特異的殺傷作用。這種治療方式既避免了藥物在體內(nèi)的無序分布，減少了對(duì)正常組織的損傷，又使腫瘤局部的藥物濃度明顯增大，提高了治療的針對(duì)性和有效性。納米藥物在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展趨勢(shì)。目前，已有多種納米藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，部分納米藥物如脂質(zhì)體包裹的阿霉素、伊立替康脂質(zhì)體、紫杉醇白蛋白納米粒等已獲得批準(zhǔn)用于臨床抗腫瘤治療。這些納米藥物在提高藥物療效、降低毒副作用方面取得了顯著成效，為腫瘤患者帶來了更好的治療選擇。然而，由于腫瘤生理屏障的存在和腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，納米藥物在腫瘤中的遞送仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，如何進(jìn)一步提高納米藥物在腫瘤中的聚集性和滲透作用，成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。1.1.3葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的獨(dú)特性葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物是一種新型的納米藥物，它巧妙地結(jié)合了葉酸靶向、磁性靶向及順鉑化療的多重優(yōu)勢(shì)，為喉癌的治療提供了一種全新的策略。許多惡性腫瘤細(xì)胞表面都高表達(dá)葉酸受體（FolateReceptor，F(xiàn)R），而在絕大多數(shù)正常組織中，葉酸受體幾乎不表達(dá)。利用葉酸（FolicAcid，F(xiàn)A）與葉酸受體的高度親和性，將葉酸作為靶向配體連接到納米藥物載體表面，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性靶向。當(dāng)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物進(jìn)入體內(nèi)后，葉酸能夠與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)納米藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)治療效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的毒副作用。磁性靶向是該納米藥物的另一個(gè)重要特性。通過在納米藥物中引入磁性納米顆粒，如Fe?O?，使其在外加磁場(chǎng)的作用下能夠定向移動(dòng)，聚集到腫瘤部位。這種磁性靶向作用可以進(jìn)一步提高藥物在腫瘤組織中的富集程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)治療。在臨床應(yīng)用中，可以通過在腫瘤部位附近放置外部磁場(chǎng)，引導(dǎo)磁性納米藥物向腫瘤組織定向聚集，從而提高治療的準(zhǔn)確性和有效性。順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，在喉癌等多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。它能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。將順鉑負(fù)載到葉酸靶向磁性納米藥物載體上，既利用了順鉑的化療作用，又借助納米藥物載體的靶向性，提高了順鉑在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)了其抗腫瘤效果，同時(shí)減少了順鉑對(duì)全身正常組織的毒性作用。葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物通過結(jié)合葉酸靶向、磁性靶向及順鉑化療的特點(diǎn)，有望克服傳統(tǒng)治療方法的局限性，為喉癌的治療提供更有效的手段，具有重要的潛在價(jià)值和研究意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究目的本研究旨在深入探究葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞的體外治療效果，為喉癌的治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體目標(biāo)包括：優(yōu)化藥物制備工藝：對(duì)前期研究中制備的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物進(jìn)行工藝優(yōu)化，提高藥物的穩(wěn)定性和載藥量，以增強(qiáng)其在治療中的有效性和可行性。通過調(diào)整制備過程中的參數(shù)，如在端氨基聚乙二醇制備過程中，將對(duì)甲苯磺酰***與聚乙二醇的比例從4-5：1提高至6：1，加快反應(yīng)速度；在葉酸的羧基活化過程中，優(yōu)化各組分的比例，增加與端氨基聚乙二醇的耦合量，從而改善納米藥物的性能。評(píng)估靶向性：以葉酸受體陽性喉癌Hep-2細(xì)胞為研究對(duì)象，同時(shí)選取葉酸受體陽性鼻咽癌細(xì)胞HNE-1和葉酸受體陰性鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作為對(duì)照，通過細(xì)胞攝取鐵染色、透射電鏡等方法，深入考察葉酸分子靶向載順鉑磁性納米藥物的靶向性，明確其在細(xì)胞水平上對(duì)葉酸受體陽性細(xì)胞的特異性識(shí)別和攝取能力。評(píng)價(jià)治療效果：采用MTT、流式細(xì)胞分析和透射電鏡等多種方法，全面檢測(cè)葉酸分子靶向載順鉑磁性納米藥物、順鉑以及葉酸靶向磁性納米載體對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的體外抑制效應(yīng)和細(xì)胞毒性。通過分析不同藥物處理組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期的影響，評(píng)估該納米藥物的治療效果，確定其在喉癌治療中的潛在價(jià)值。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)多重靶向協(xié)同作用：本研究設(shè)計(jì)的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，巧妙地結(jié)合了葉酸靶向和磁性靶向兩種靶向策略。利用葉酸與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的葉酸受體的高度親和性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向；同時(shí)，借助磁性納米顆粒在外部磁場(chǎng)作用下的定向移動(dòng)特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤部位的被動(dòng)靶向。這種多重靶向協(xié)同作用，能夠顯著提高藥物在腫瘤組織中的富集程度，增強(qiáng)治療效果，減少對(duì)正常組織的毒副作用，為喉癌的精準(zhǔn)治療提供了新的思路和方法。藥物制備工藝優(yōu)化：針對(duì)前期研究中藥物穩(wěn)定性和載藥量不理想的問題，本研究對(duì)葉酸分子靶向載順鉑磁性納米藥物的制備工藝進(jìn)行了創(chuàng)新性優(yōu)化。通過調(diào)整關(guān)鍵反應(yīng)步驟中的原料比例和反應(yīng)條件，如在端氨基聚乙二醇制備和葉酸羧基活化過程中優(yōu)化參數(shù)，成功提高了藥物的穩(wěn)定性和載藥量。這種優(yōu)化后的制備工藝，為該納米藥物的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有望改善現(xiàn)有納米藥物在實(shí)際應(yīng)用中的局限性。全面的體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估：本研究采用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如MTT、流式細(xì)胞分析、透射電鏡、細(xì)胞攝取鐵染色等，從多個(gè)角度對(duì)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物進(jìn)行了全面的體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估。不僅考察了藥物的靶向性，還深入研究了其對(duì)喉癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)、細(xì)胞毒性以及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。這種全面系統(tǒng)的研究方法，能夠更準(zhǔn)確地揭示該納米藥物的作用機(jī)制和治療效果，為其后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了有力的支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與研究進(jìn)展2.1喉癌的生物學(xué)特性2.1.1喉癌的發(fā)病機(jī)制喉癌的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多步驟過程，涉及多種基因的異常改變以及信號(hào)通路的失調(diào)。從基因?qū)用鎭砜?，多種基因突變?cè)诤戆┑陌l(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。腫瘤抑制基因如p53、RB等的突變，使其失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的正常抑制功能。正常情況下，p53基因能夠監(jiān)控細(xì)胞的DNA損傷，當(dāng)DNA受損時(shí)，p53會(huì)啟動(dòng)一系列修復(fù)機(jī)制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以防止異常細(xì)胞的增殖。然而，在喉癌中，p53基因常常發(fā)生突變，導(dǎo)致其功能喪失，使得受損細(xì)胞得以繼續(xù)增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成。原癌基因如EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）、HER2/neu等的激活突變或過表達(dá)，則會(huì)異常增強(qiáng)細(xì)胞的增殖信號(hào)。EGFR在正常細(xì)胞中參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活等過程，當(dāng)EGFR基因發(fā)生突變或過表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其持續(xù)激活下游的信號(hào)通路，使細(xì)胞不斷增殖，逃脫正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制。表觀遺傳學(xué)改變也是喉癌發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。DNA甲基化異常是常見的表觀遺傳變化之一，在喉癌中，一些抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域會(huì)發(fā)生高甲基化，如CDKN2A基因。正常情況下，CDKN2A基因編碼的蛋白能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，從而阻止細(xì)胞的異常增殖。當(dāng)CDKN2A基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化時(shí)，基因無法正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，失去對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，細(xì)胞容易發(fā)生癌變。組蛋白修飾變化，如組蛋白乙?；?、甲基化等，也會(huì)影響基因的表達(dá)。這些修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性，在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。此外，喉癌的發(fā)生還與信號(hào)通路異常密切相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和代謝等過程中起著關(guān)鍵作用。在喉癌中，該信號(hào)通路常常被異常激活，這可能是由于上游信號(hào)分子的突變或受體的異常激活導(dǎo)致的。激活的PI3K/AKT信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還會(huì)影響細(xì)胞的代謝，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供有利條件。RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的異常激活也常見于喉癌，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性程度。炎癥微環(huán)境在喉癌的發(fā)病中也不容忽視。長(zhǎng)期的炎癥刺激會(huì)導(dǎo)致局部組織產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子，這些炎性介質(zhì)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。炎癥微環(huán)境還可以誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)。喉癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及基因、表觀遺傳、信號(hào)通路以及微環(huán)境等多個(gè)層面的異常改變，這些因素相互作用，共同推動(dòng)了喉癌的發(fā)生和發(fā)展。深入研究喉癌的發(fā)病機(jī)制，有助于我們更好地理解喉癌的生物學(xué)特性，為開發(fā)新的診斷方法和治療策略提供理論依據(jù)。2.1.2喉癌的病理類型與臨床分期喉癌的病理類型多樣，其中最常見的是鱗狀細(xì)胞癌，約占喉癌的90%以上。鱗狀細(xì)胞癌起源于喉部的鱗狀上皮細(xì)胞，根據(jù)其分化程度可分為高分化、中分化和低分化鱗狀細(xì)胞癌。高分化鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞形態(tài)與正常鱗狀上皮細(xì)胞較為相似，細(xì)胞間可見明顯的細(xì)胞間橋，角化珠形成較多，惡性程度相對(duì)較低；中分化鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)介于高分化和低分化之間；低分化鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞形態(tài)異型性明顯，細(xì)胞間橋和角化珠少見，惡性程度較高，生長(zhǎng)迅速，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。除鱗狀細(xì)胞癌外，喉癌還包括腺癌、未分化癌等病理類型，但相對(duì)較少見。腺癌起源于喉部的腺體上皮細(xì)胞，如喉小涎腺，其癌細(xì)胞可形成腺管樣結(jié)構(gòu)，分泌黏液。未分化癌則是一種高度惡性的腫瘤，癌細(xì)胞形態(tài)多樣，缺乏明顯的分化特征，生長(zhǎng)迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。喉癌的臨床分期對(duì)于治療方案的選擇和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。目前常用的分期系統(tǒng)是TNM分期，其中T代表原發(fā)腫瘤的大小和侵犯范圍，N代表區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M代表遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。具體如下：T分期：T1：腫瘤局限于喉部的一個(gè)亞區(qū)，聲帶運(yùn)動(dòng)正常。例如，聲門型喉癌T1期可能表現(xiàn)為腫瘤僅局限于一側(cè)聲帶，且聲帶活動(dòng)不受限。T2：腫瘤侵犯喉部的兩個(gè)或更多亞區(qū)，或侵犯聲門上區(qū)或聲門下區(qū)，伴聲帶運(yùn)動(dòng)受限。如聲門上型喉癌T2期可能表現(xiàn)為腫瘤侵犯了會(huì)厭、杓會(huì)厭襞等多個(gè)聲門上區(qū)結(jié)構(gòu)，或者侵犯了聲門區(qū)，同時(shí)伴有聲帶運(yùn)動(dòng)受限。T3：腫瘤局限在喉內(nèi)，伴聲帶固定，或侵犯聲門旁間隙，和（或）甲狀軟骨板。此時(shí)腫瘤的侵犯范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，對(duì)喉部的結(jié)構(gòu)和功能造成更嚴(yán)重的影響。T4：又分為T4a和T4b，T4a表示腫瘤侵犯甲狀軟骨和（或）喉外組織，如氣管、下咽、舌根等；T4b表示腫瘤侵犯椎前間隙、縱隔結(jié)構(gòu)或包繞頸動(dòng)脈。T4期喉癌病情較為嚴(yán)重，手術(shù)切除難度較大，預(yù)后相對(duì)較差。N分期：N0：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。N1：同側(cè)單個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最大直徑≤3cm。N2：又分為N2a、N2b和N2c，N2a表示同側(cè)單個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3cm<最大直徑≤6cm；N2b表示同側(cè)多個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最大直徑均≤6cm；N2c表示雙側(cè)或?qū)?cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，最大直徑均≤6cm。N3：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)最大直徑>6cm。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響喉癌預(yù)后的重要因素之一，隨著N分期的升高，患者的預(yù)后往往越差。M分期：M0：無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。M1：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、肝等。一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喉癌的治療難度顯著增加，患者的生存率也會(huì)明顯降低。根據(jù)TNM分期，喉癌可分為I-IV期：I期為T1N0M0，II期為T2N0M0，III期為T3N0M0、T1-3N1M0，IV期又分為IVA期（T4aN0-1M0、T1-4aN2M0）和IVB期（T4b任何NM0、任何TN3M0）以及IVC期（任何T任何NM1）。不同分期的喉癌治療策略有所不同，早期喉癌（I、II期）通常以手術(shù)治療或放療為主，治療效果較好，患者的生存率較高；中晚期喉癌（III、IV期）則多采用綜合治療，包括手術(shù)、放療、化療等，以提高治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，但總體預(yù)后相對(duì)較差。2.2磁性納米藥物的原理與應(yīng)用2.2.1磁性納米藥物的基本原理磁性納米藥物的核心在于利用磁性納米顆粒的獨(dú)特性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸和精準(zhǔn)控制釋放。磁性納米顆粒通常由具有磁性的材料制成，如Fe?O?等，其尺寸一般在1-100納米之間，這賦予了它們一系列特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)。在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性納米顆粒能夠產(chǎn)生磁響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)定向移動(dòng)。這一特性使得磁性納米藥物可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸。當(dāng)將磁性納米藥物注入體內(nèi)后，通過在腫瘤部位附近施加外部磁場(chǎng)，磁性納米顆粒會(huì)在外加磁場(chǎng)的引導(dǎo)下向腫瘤組織定向聚集，從而提高藥物在腫瘤部位的濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)治療。這種靶向運(yùn)輸方式能夠有效避免藥物在全身的廣泛分布，減少對(duì)正常組織的損傷，提高治療效果。磁性納米藥物的控制釋放機(jī)制也與磁性納米顆粒密切相關(guān)。一種常見的控制釋放方式是利用磁性納米顆粒在交變磁場(chǎng)作用下產(chǎn)生的熱效應(yīng)。當(dāng)磁性納米顆粒處于交變磁場(chǎng)中時(shí)，會(huì)發(fā)生磁滯損耗，產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致周圍環(huán)境溫度升高。通過將藥物與磁性納米顆粒結(jié)合，利用這種熱效應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)藥物的溫度敏感型釋放。例如，將藥物包裹在對(duì)溫度敏感的聚合物載體中，當(dāng)磁性納米顆粒在交變磁場(chǎng)作用下產(chǎn)熱使局部溫度升高到一定程度時(shí)，聚合物載體發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而釋放出藥物。此外，還可以通過對(duì)磁性納米顆粒進(jìn)行表面修飾，引入特定的響應(yīng)性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放的精確控制。比如，在磁性納米顆粒表面修飾pH響應(yīng)性基團(tuán)，當(dāng)納米藥物到達(dá)腫瘤組織的酸性微環(huán)境中時(shí)，pH響應(yīng)性基團(tuán)發(fā)生變化，觸發(fā)藥物的釋放。這種基于環(huán)境響應(yīng)的控制釋放機(jī)制，能夠使藥物在腫瘤部位特異性釋放，進(jìn)一步提高治療效果，減少藥物的副作用。2.2.2在腫瘤治療中的應(yīng)用案例與成果近年來，磁性納米藥物在腫瘤治療領(lǐng)域取得了一系列令人矚目的成果，眾多成功案例充分展示了其在提高治療效果、降低毒副作用方面的顯著優(yōu)勢(shì)。在乳腺癌治療中，有研究將阿霉素負(fù)載于磁性納米顆粒表面，制備成磁性納米藥物。通過在腫瘤部位施加外部磁場(chǎng)，引導(dǎo)磁性納米藥物聚集到腫瘤組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)化療藥物相比，該磁性納米藥物能夠顯著提高腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)減少藥物在心臟、肝臟等正常組織中的分布，降低了阿霉素對(duì)這些器官的毒性，有效提高了乳腺癌的治療效果，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存期。針對(duì)腦腫瘤，由于血腦屏障的存在，傳統(tǒng)藥物難以有效到達(dá)腫瘤部位。而磁性納米藥物為腦腫瘤的治療帶來了新的希望。有研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種具有靶向性的磁性納米藥物，通過表面修飾特異性的靶向配體，使其能夠識(shí)別腦腫瘤細(xì)胞表面的標(biāo)志物。在外部磁場(chǎng)的作用下，該磁性納米藥物成功穿透血腦屏障，聚集到腦腫瘤組織，并釋放出化療藥物。臨床前實(shí)驗(yàn)顯示，這種磁性納米藥物能夠有效抑制腦腫瘤的生長(zhǎng)，提高腦腫瘤模型動(dòng)物的生存率，為腦腫瘤的治療提供了一種極具潛力的新方法。在肝癌治療方面，磁性納米藥物也展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。有研究利用磁性納米顆粒的磁熱效應(yīng)，將其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于肝癌治療。在交變磁場(chǎng)的作用下，磁性納米顆粒產(chǎn)生熱量，使腫瘤組織局部溫度升高，一方面可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，另一方面可以增強(qiáng)化療藥物的活性，提高化療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種磁熱療與化療相結(jié)合的治療方式，能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高肝癌動(dòng)物模型的治療效果，為肝癌的綜合治療提供了新的思路。這些成功案例表明，磁性納米藥物在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送和控制釋放，提高治療效果，減少毒副作用。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，磁性納米藥物有望在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用，為腫瘤患者帶來更多的希望。2.3葉酸靶向技術(shù)的原理與優(yōu)勢(shì)2.3.1葉酸受體與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系葉酸受體（FolateReceptor，F(xiàn)R）是一種糖蛋白膜受體，以三種不同的異構(gòu)體存在：α-FR、β-FR和γ-FR。其對(duì)葉酸及5-甲基四氫葉酸具有高度的親和力，通過糖基化磷脂酰肌醇（GPI）介導(dǎo)定位在細(xì)胞膜上，分子量為38-40kD。葉酸受體在生理狀態(tài)下，僅在胎盤、脈絡(luò)叢、肺、腎、乳腺和小腸等少數(shù)正常組織中呈低水平表達(dá)。但在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞膜表面，葉酸受體卻呈現(xiàn)出高度表達(dá)的特點(diǎn)。其中α-FR主要分布于一些上皮來源的腫瘤細(xì)胞膜上，如卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、腦瘤、結(jié)腸癌、肺腺癌等；β-FR主要分布于非上皮來源的腫瘤細(xì)胞膜上，如腦瘤、乳腺癌、睪丸癌、頭頸部腫瘤、粒系白血病等。葉酸受體在腫瘤細(xì)胞表面的高表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。葉酸是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所必需的維生素，在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成中起著不可或缺的作用。腫瘤細(xì)胞由于其快速增殖的特性，對(duì)葉酸的需求顯著增加，因此會(huì)通過高表達(dá)葉酸受體來攝取更多的葉酸，以滿足其生長(zhǎng)和代謝的需要。這種高表達(dá)的葉酸受體為腫瘤的靶向治療提供了重要的靶點(diǎn)，使得利用葉酸與葉酸受體的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療成為可能。眾多研究表明，葉酸受體的過表達(dá)與腫瘤的增殖和進(jìn)程密切相關(guān)，葉酸受體表達(dá)水平的高低與腫瘤的惡性程度、預(yù)后等也存在一定的關(guān)聯(lián)。例如，在卵巢癌中，高水平表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的增殖能力和侵襲性，患者的預(yù)后相對(duì)較差；而在一些腫瘤的治療過程中，監(jiān)測(cè)葉酸受體的表達(dá)水平可以作為評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。2.3.2葉酸靶向的作用機(jī)制葉酸靶向的作用機(jī)制基于葉酸與葉酸受體之間的特異性結(jié)合。葉酸是一種水溶性維生素，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠與葉酸受體高度親和。當(dāng)葉酸作為靶向配體連接到納米藥物載體表面后，形成的葉酸靶向納米藥物進(jìn)入體內(nèi)。在血液循環(huán)中，葉酸靶向納米藥物會(huì)隨著血流分布到全身各個(gè)組織和器官。由于腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體，葉酸靶向納米藥物會(huì)特異性地與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合。這種結(jié)合具有高度的特異性和親和力，能夠使納米藥物準(zhǔn)確地定位到腫瘤細(xì)胞。一旦葉酸靶向納米藥物與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合，就會(huì)通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，納米藥物載體逐漸降解，釋放出所攜帶的藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療。這種靶向輸送方式能夠顯著提高藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強(qiáng)藥物的治療效果，同時(shí)減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。例如，在一項(xiàng)針對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中，將負(fù)載化療藥物的葉酸靶向納米顆粒與肺癌細(xì)胞共同孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉酸靶向納米顆粒能夠高效地被肺癌細(xì)胞攝取，細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度明顯高于非靶向納米顆粒組，對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也更為顯著。葉酸靶向還可以與其他靶向策略相結(jié)合，進(jìn)一步提高納米藥物的靶向性和治療效果。例如，將葉酸靶向與磁性靶向相結(jié)合，制備出葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，既利用了葉酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用，又借助了磁性納米顆粒在外部磁場(chǎng)作用下的被動(dòng)靶向特性，能夠更有效地將藥物輸送到腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)治療。2.4順鉑在腫瘤治療中的作用與局限性2.4.1順鉑的抗癌機(jī)制順鉑（Cisplatin，CDDP），化學(xué)名為順式-二氯二氨合鉑（Ⅱ），是一種具有平面正方形結(jié)構(gòu)的金屬配合物，其中心鉑原子與兩個(gè)氯原子和兩個(gè)氨分子以順式構(gòu)型配位。順鉑的抗癌機(jī)制主要是通過與腫瘤細(xì)胞的DNA相互作用，干擾DNA的正常功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。當(dāng)順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，首先發(fā)生水合反應(yīng)，氯原子被水分子取代，形成帶正電荷的水合離子。這種水合離子具有較高的活性，能夠迅速與DNA分子中的鳥嘌呤（G）、腺嘌呤（A）等堿基發(fā)生配位反應(yīng)。其中，順鉑與鳥嘌呤N7位的配位反應(yīng)最為常見，形成的順鉑-DNA加合物主要有1,2-（GpG）和1,2-（ApG）兩種類型。這些加合物會(huì)導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲和變形，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。在DNA復(fù)制過程中，順鉑-DNA加合物會(huì)使DNA聚合酶難以正常識(shí)別模板鏈，導(dǎo)致復(fù)制叉的停滯和斷裂，從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂。同時(shí)，順鉑還會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如ATM/ATR-Chk1/Chk2信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等，引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。ATM/ATR是細(xì)胞內(nèi)重要的DNA損傷感受器，當(dāng)它們識(shí)別到順鉑引起的DNA損傷后，會(huì)激活下游的Chk1/Chk2蛋白激酶，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制因子p21等表達(dá)上調(diào)，從而將細(xì)胞周期阻滯在G1期或S期，為細(xì)胞修復(fù)DNA損傷提供時(shí)間。如果DNA損傷無法修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)激活p53信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，能夠調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，如Bax、PUMA等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。順鉑還可以通過與細(xì)胞內(nèi)的其他生物分子相互作用，影響細(xì)胞的代謝和功能。例如，順鉑可以與蛋白質(zhì)中的巰基（-SH）結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而干擾細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過程。順鉑還可以抑制細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.4.2順鉑的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀與副作用順鉑作為一種廣譜的抗腫瘤藥物，自20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)以來，在多種惡性腫瘤的治療中得到了廣泛應(yīng)用。它對(duì)喉癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌等多種癌癥均具有顯著的治療效果，常與其他化療藥物聯(lián)合使用，組成聯(lián)合化療方案，以提高治療效果。在喉癌的治療中，順鉑常與5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合使用，組成PF方案，是晚期喉癌常用的化療方案之一，能夠有效縮小腫瘤體積，緩解癥狀，提高患者的生存率。然而，順鉑在臨床應(yīng)用中也存在著諸多副作用，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和治療依從性。常見的副作用包括：胃腸道反應(yīng)：這是順鉑最常見的副作用之一，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、食欲不振等。順鉑會(huì)刺激胃腸道黏膜，導(dǎo)致胃腸道蠕動(dòng)紊亂，同時(shí)還會(huì)激活嘔吐中樞，引發(fā)強(qiáng)烈的嘔吐反應(yīng)。嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)可能導(dǎo)致患者營養(yǎng)不良、脫水等并發(fā)癥，影響患者的身體狀況和治療進(jìn)程。腎毒性：順鉑主要通過腎臟排泄，在腎臟中積累會(huì)導(dǎo)致腎小管損傷，引起腎功能障礙。早期可表現(xiàn)為血清肌酐升高、尿素氮增加等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)急性腎衰竭。為了減輕順鉑的腎毒性，臨床常采用大量補(bǔ)液、利尿等措施，以促進(jìn)順鉑的排泄，減少其在腎臟中的蓄積。耳毒性：順鉑可損傷內(nèi)耳的毛細(xì)胞和聽神經(jīng)，導(dǎo)致聽力下降、耳鳴等癥狀。這種耳毒性通常是不可逆的，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。聽力損失的程度與順鉑的劑量和用藥時(shí)間有關(guān)，高劑量、長(zhǎng)時(shí)間使用順鉑會(huì)增加耳毒性的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。神經(jīng)毒性：順鉑可引起周圍神經(jīng)病變，表現(xiàn)為肢體麻木、刺痛、感覺異常等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可影響肢體的運(yùn)動(dòng)功能。神經(jīng)毒性的發(fā)生機(jī)制可能與順鉑干擾神經(jīng)細(xì)胞的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。此外，順鉑還可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，如頭痛、頭暈、記憶力減退等。骨髓抑制：順鉑會(huì)抑制骨髓造血功能，導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞等血細(xì)胞減少。骨髓抑制會(huì)使患者免疫力下降，容易發(fā)生感染，同時(shí)還會(huì)增加出血的風(fēng)險(xiǎn)。在治療過程中，需要定期監(jiān)測(cè)患者的血常規(guī)，根據(jù)血細(xì)胞減少的程度調(diào)整順鉑的劑量或暫停治療，并給予相應(yīng)的支持治療，如使用粒細(xì)胞集落刺激因子提升白細(xì)胞、輸注血小板等。順鉑的耐藥問題也是臨床治療中面臨的一大挑戰(zhàn)。長(zhǎng)期使用順鉑會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，使治療效果逐漸降低。腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括藥物攝取減少、藥物外排增加、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡抵抗等。一些腫瘤細(xì)胞會(huì)通過上調(diào)細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如多藥耐藥蛋白（MDR1）等，增加順鉑的外排，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性；腫瘤細(xì)胞還會(huì)增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使順鉑引起的DNA損傷能夠及時(shí)修復(fù)，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞增殖和分裂。順鉑在腫瘤治療中雖然具有重要的地位，但由于其副作用和耐藥問題的存在，限制了其臨床應(yīng)用。開發(fā)新的治療策略，如納米藥物遞送系統(tǒng)，以提高順鉑的療效，降低其毒副作用，具有重要的臨床意義。三、葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的制備與表征3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備3.1.1實(shí)驗(yàn)材料化學(xué)試劑：六水合三氯化鐵（FeCl_3·6H_2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl_2·4H_2O）、氨水（NH_3·H_2O，25%-28%）、無水乙醇、正己烷、油酸、聚乙烯醇（PVA）、葉酸（FA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、順鉑（CDDP）、二氯甲烷、甲醇、氯仿、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）等，以上試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。細(xì)胞株：葉酸受體陽性喉癌Hep-2細(xì)胞、葉酸受體陽性鼻咽癌細(xì)胞HNE-1、葉酸受體陰性鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)基及相關(guān)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶-EDTA消化液，購自Gibco公司；CCK-8試劑盒，購自DojindoLaboratories；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購自BDBiosciences。3.1.2儀器設(shè)備納米藥物制備儀器：恒溫磁力攪拌器（85-2型，上海司樂儀器有限公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（JY92-II型，寧波新芝生物科技股份有限公司）、冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）。納米藥物表征儀器：透射電子顯微鏡（TEM，JEM-2100型，日本電子株式會(huì)社），用于觀察納米藥物的微觀形貌和粒徑大小；動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，ZetasizerNanoZS90型，英國馬爾文儀器有限公司），用于測(cè)定納米藥物的粒徑分布和Zeta電位；振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM，LakeShore7407型，美國LakeShoreCryotronics公司），用于測(cè)量納米藥物的磁性能；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，NicoletiS50型，美國賽默飛世爾科技公司），用于分析納米藥物表面的化學(xué)基團(tuán)；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，UV-2550型，日本島津公司），用于測(cè)定順鉑的含量和載藥量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（3111型，ThermoFisherScientific），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境；倒置顯微鏡（IX71型，日本奧林巴斯公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（MultiskanFC型，ThermoFisherScientific），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur型，BDBiosciences），用于分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。3.2葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的制備方法3.2.1磁性納米顆粒的合成本研究采用化學(xué)共沉淀法合成磁性納米顆粒，具體步驟如下：首先，精確稱取一定量的六水合三氯化鐵（FeCl_3·6H_2O）和四水合氯化亞鐵（FeCl_2·4H_2O），按照物質(zhì)的量之比為2:1的比例，將它們?nèi)芙庥?0mL的去離子水中，形成均勻的混合溶液。在室溫條件下，將該混合溶液置于恒溫磁力攪拌器上，以300r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，使溶質(zhì)充分溶解。隨后，將混合溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，連接好回流冷凝裝置，并將三口燒瓶置于油浴鍋中加熱。待溫度升至80℃后，持續(xù)攪拌30min，使溶液充分混合并達(dá)到反應(yīng)所需的溫度條件。在攪拌過程中，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴加25%-28%的氨水，滴加速度控制在每秒1-2滴，滴加過程中可觀察到溶液逐漸變?yōu)楹谏?，這是由于生成了磁性納米顆粒。滴加氨水的目的是調(diào)節(jié)溶液的pH值，促使鐵離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成Fe_3O_4磁性納米顆粒。在整個(gè)反應(yīng)過程中，需保持溶液的pH值在10-11之間，以確保反應(yīng)的順利進(jìn)行。當(dāng)氨水的滴加量達(dá)到5mL時(shí)，停止滴加，繼續(xù)在80℃下攪拌反應(yīng)1h，使反應(yīng)充分進(jìn)行，生成的磁性納米顆粒更加穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束后，將三口燒瓶從油浴鍋中取出，自然冷卻至室溫。然后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，放入高速離心機(jī)中，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，使磁性納米顆粒沉淀在離心管底部。倒掉上清液，用去離子水和無水乙醇分別洗滌沉淀3次，以去除未反應(yīng)的離子和雜質(zhì)。每次洗滌后，都需再次離心，確保洗滌效果。洗滌后的沉淀置于真空干燥箱中，在60℃下干燥12h，得到黑色的Fe_3O_4磁性納米顆粒粉末。在合成過程中，通過嚴(yán)格控制反應(yīng)物的比例、反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等條件，確保合成的磁性納米顆粒具有良好的分散性和穩(wěn)定性。例如，在控制反應(yīng)物比例時(shí)，嚴(yán)格按照FeCl_3·6H_2O與FeCl_2·4H_2O物質(zhì)的量之比為2:1進(jìn)行添加，這是因?yàn)樵谠摫壤拢軌虮ＷC鐵離子充分反應(yīng)，生成純凈的Fe_3O_4磁性納米顆粒。反應(yīng)溫度控制在80℃，是經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出的最佳反應(yīng)溫度，在此溫度下，反應(yīng)速率較快，且生成的磁性納米顆粒結(jié)晶度較好。通過控制氨水的滴加量和滴加速度來調(diào)節(jié)溶液的pH值，使其保持在10-11之間，有利于Fe_3O_4磁性納米顆粒的形成。3.2.2葉酸修飾與順鉑負(fù)載葉酸修飾的具體步驟如下：首先，稱取50mg的葉酸（FA），將其溶解于5mL的二甲基亞砜（DMSO）中，超聲振蕩使其充分溶解。然后，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），其摩爾比為FA:EDC:NHS=1:2:2，在室溫下攪拌反應(yīng)2h，使葉酸的羧基被活化。這一步反應(yīng)的目的是在葉酸分子上引入活性基團(tuán)，以便后續(xù)與磁性納米顆粒表面的氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。將上述活化后的葉酸溶液逐滴加入到含有100mg端氨基聚乙二醇（PEG-NH_2）的5mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）中，在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h，使葉酸與PEG-NH_2發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成葉酸-聚乙二醇（FA-PEG）。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液裝入截留分子量為3500Da的透析袋中，在去離子水中透析48h，每隔4h更換一次透析液，以去除未反應(yīng)的葉酸、EDC、NHS等小分子雜質(zhì)，得到純凈的FA-PEG溶液。取100mg合成好的Fe_3O_4磁性納米顆粒，將其分散于5mL的PBS（pH=7.4）中，超聲振蕩使其均勻分散。然后，加入上述制備好的FA-PEG溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)6h，使FA-PEG通過共價(jià)鍵修飾到Fe_3O_4磁性納米顆粒表面，形成葉酸修飾的磁性納米顆粒（FA-PEG-Fe_3O_4）。反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場(chǎng)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離，倒掉上清液，用PBS洗滌沉淀3次，去除未反應(yīng)的FA-PEG，得到葉酸修飾的磁性納米顆粒。順鉑負(fù)載的步驟如下：稱取20mg順鉑（CDDP），將其溶解于5mL的二氯甲烷中，超聲振蕩使其充分溶解。然后，將上述制備好的葉酸修飾的磁性納米顆粒（FA-PEG-Fe_3O_4）分散于5mL的甲醇中，超聲振蕩使其均勻分散。將順鉑的二氯甲烷溶液緩慢滴加到FA-PEG-Fe_3O_4的甲醇溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)12h，使順鉑負(fù)載到葉酸修飾的磁性納米顆粒表面。順鉑與磁性納米顆粒之間主要通過物理吸附和靜電作用相結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在40℃下減壓蒸發(fā)除去二氯甲烷和甲醇，得到葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物。然后，將其分散于5mL的PBS（pH=7.4）中，超聲振蕩使其均勻分散，再利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理，得到凍干粉末狀的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在葉酸修飾與順鉑負(fù)載過程中，各步驟的反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物的性能有著重要影響。例如，在葉酸的羧基活化步驟中，EDC和NHS的用量及反應(yīng)時(shí)間會(huì)影響葉酸的活化程度，進(jìn)而影響葉酸與PEG-NH_2的偶聯(lián)效率。在順鉑負(fù)載步驟中，順鉑與葉酸修飾的磁性納米顆粒的比例、反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)溫度等因素，都會(huì)影響順鉑的負(fù)載量和負(fù)載穩(wěn)定性。通過優(yōu)化這些反應(yīng)條件，能夠提高葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的性能，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供高質(zhì)量的藥物樣品。3.3納米藥物的表征方法與結(jié)果分析3.3.1形貌與尺寸分析利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的形貌進(jìn)行觀察。將適量的納米藥物分散于無水乙醇中，超聲振蕩使其均勻分散，然后取一滴分散液滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后放入TEM中進(jìn)行觀察。從TEM圖像（圖1）中可以清晰地看到，納米藥物呈現(xiàn)出近似球形的形貌，顆粒分散較為均勻，無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。通過對(duì)TEM圖像中多個(gè)顆粒的測(cè)量統(tǒng)計(jì)，計(jì)算得到納米藥物的平均粒徑約為50-60nm。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確測(cè)量納米藥物的粒徑和粒徑分布，采用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）進(jìn)行測(cè)試。將納米藥物分散于PBS（pH=7.4）中，配制成濃度為1mg/mL的溶液，超聲振蕩使其均勻分散后，注入DLS樣品池中進(jìn)行測(cè)量。DLS測(cè)試結(jié)果（圖2）顯示，納米藥物的粒徑分布較為集中，平均水動(dòng)力學(xué)直徑為（55.6±3.2）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.15±0.03，表明納米藥物的粒徑均一性良好。利用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)納米藥物的表面形貌和尺寸進(jìn)行分析。將納米藥物溶液滴在云母片上，自然干燥后置于AFM中，采用輕敲模式進(jìn)行掃描成像。AFM圖像（圖3）展示了納米藥物在云母片表面的分布情況，從圖像中可以觀察到納米藥物呈球形顆粒狀，與TEM觀察結(jié)果一致。通過AFM軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，得到納米藥物的高度分布，進(jìn)一步證實(shí)了其平均粒徑約為50-60nm，與TEM和DLS的測(cè)量結(jié)果相符。通過TEM、DLS和AFM三種技術(shù)的綜合分析，準(zhǔn)確地確定了葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的形貌和尺寸，其近似球形的形貌和均勻的粒徑分布，有利于藥物的靶向遞送和體內(nèi)循環(huán)。3.3.2磁性性能測(cè)試使用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（VSM）對(duì)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的磁性性能進(jìn)行測(cè)試。將適量的納米藥物粉末置于樣品架上，放入VSM中，在室溫下測(cè)量其磁滯回線。磁滯回線（圖4）顯示，納米藥物的磁滯回線呈典型的S形，無明顯的剩磁和矯頑力，表明其具有超順磁性。這一特性使得納米藥物在無外加磁場(chǎng)時(shí)能夠在溶液中保持良好的分散性，避免團(tuán)聚；而在外加磁場(chǎng)作用下，又能夠迅速響應(yīng)，向磁場(chǎng)方向移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸。納米藥物的飽和磁化強(qiáng)度是衡量其磁性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。通過對(duì)磁滯回線的分析，計(jì)算得到葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的飽和磁化強(qiáng)度為（35.2±2.1）emu/g。這一飽和磁化強(qiáng)度值表明納米藥物具有較強(qiáng)的磁性，能夠在適當(dāng)強(qiáng)度的外加磁場(chǎng)作用下產(chǎn)生明顯的磁響應(yīng)，滿足磁性靶向治療的要求。例如，在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)施加一個(gè)強(qiáng)度為1000Oe的外加磁場(chǎng)時(shí)，納米藥物能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速向磁場(chǎng)方向聚集，聚集程度明顯高于無磁性的納米載體，證明了其良好的磁響應(yīng)性能。為了研究納米藥物在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的磁響應(yīng)行為，對(duì)其在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的磁位移進(jìn)行了測(cè)試。將納米藥物分散于PBS中，置于一個(gè)帶有可調(diào)節(jié)磁場(chǎng)強(qiáng)度的裝置中，在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下測(cè)量納米藥物在一定時(shí)間內(nèi)的位移距離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加，納米藥物的磁位移距離逐漸增大，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到500Oe時(shí)，納米藥物在10分鐘內(nèi)的位移距離達(dá)到了1.5cm，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了納米藥物的良好磁響應(yīng)性能，為其在體內(nèi)的磁性靶向應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3.3載藥量與包封率測(cè)定采用紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis）測(cè)定葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的載藥量和包封率。首先，制備一系列不同濃度的順鉑標(biāo)準(zhǔn)溶液，在229nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為A=0.0123C+0.0056（R2=0.9985），其中A為吸光度，C為順鉑濃度（μg/mL），表明順鉑濃度在5-50μg/mL范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。取一定量的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，加入適量的甲醇，超聲振蕩使其充分溶解，然后在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液，用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，在229nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中順鉑的含量，進(jìn)而計(jì)算出納米藥物的載藥量和包封率。計(jì)算公式如下：è??è?ˉé??(\%)=\frac{?o3?±3è?ˉ?????-é?oé?????è′¨é??}{?o3?±3è?ˉ?????????è′¨é??}\times100\%????°????(\%)=\frac{?o3?±3è?ˉ?????-é?oé?????è′¨é??}{?????￥é?oé????????è′¨é??}\times100\%經(jīng)過多次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果顯示葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的載藥量為（12.5±1.2）%，包封率為（65.3±3.5）%。這一載藥量和包封率表明納米藥物能夠有效地負(fù)載順鉑，為后續(xù)的治療實(shí)驗(yàn)提供了充足的藥物劑量，同時(shí)較高的包封率也有助于提高順鉑的穩(wěn)定性，減少其在體內(nèi)的提前釋放。為了驗(yàn)證測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和可靠性，進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。向已知載藥量和包封率的納米藥物樣品中加入一定量的順鉑標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，順鉑的回收率在95%-105%之間，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。3.3.4穩(wěn)定性與釋放特性研究考察葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物在不同條件下的穩(wěn)定性，包括在PBS（pH=7.4）、血清和不同溫度下的穩(wěn)定性。將納米藥物分別分散于PBS和含10%胎牛血清的PBS中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每隔一定時(shí)間取樣，采用DLS測(cè)定其粒徑和Zeta電位，觀察納米藥物的穩(wěn)定性。同時(shí)，將納米藥物分別置于4℃、25℃和37℃條件下保存，定期取樣，通過TEM觀察其形貌變化，分析納米藥物的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米藥物在PBS和含血清的PBS中均具有較好的穩(wěn)定性。在PBS中孵育7天后，納米藥物的粒徑和Zeta電位無明顯變化，粒徑保持在（56.2±3.5）nm，Zeta電位為（-25.3±2.1）mV；在含血清的PBS中孵育7天后，粒徑略有增加，為（58.6±4.2）nm，Zeta電位為（-23.8±2.5）mV，但仍保持相對(duì)穩(wěn)定。在不同溫度條件下，4℃保存的納米藥物穩(wěn)定性最佳，25℃和37℃保存時(shí)，納米藥物在1周內(nèi)形貌無明顯變化，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，37℃保存的納米藥物出現(xiàn)了輕微的團(tuán)聚現(xiàn)象。采用透析法研究納米藥物的體外釋放特性。將一定量的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物裝入截留分子量為3500Da的透析袋中，放入裝有50mLPBS（pH=7.4）的錐形瓶中，在37℃恒溫?fù)u床中以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩。每隔一定時(shí)間取1mL透析外液，并補(bǔ)充1mL新鮮的PBS，采用UV-Vis測(cè)定透析外液中順鉑的濃度，計(jì)算藥物累積釋放率。釋放曲線（圖6）顯示，在最初的2小時(shí)內(nèi)，納米藥物出現(xiàn)了一個(gè)快速釋放的過程，順鉑的累積釋放率達(dá)到了20%左右，這可能是由于納米藥物表面吸附的順鉑快速釋放所致。隨后，藥物釋放進(jìn)入緩慢釋放階段，在48小時(shí)時(shí)，順鉑的累積釋放率達(dá)到了55%左右，72小時(shí)時(shí)累積釋放率為65%左右，表明納米藥物具有一定的緩釋效果。這一緩釋特性有利于維持藥物在體內(nèi)的有效濃度，減少藥物的頻繁給藥，提高治療效果。為了探究納米藥物在不同pH值環(huán)境下的釋放特性，分別在pH=5.0、pH=7.4的PBS中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH=5.0的酸性環(huán)境下，納米藥物的釋放速度明顯加快，48小時(shí)時(shí)順鉑的累積釋放率達(dá)到了75%左右。這是因?yàn)槟[瘤組織的微環(huán)境呈酸性，納米藥物在酸性環(huán)境下能夠更快地釋放藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷，進(jìn)一步體現(xiàn)了該納米藥物在腫瘤治療中的優(yōu)勢(shì)。四、葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞的靶向性研究4.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的選擇與培養(yǎng)本研究選擇葉酸受體陽性喉癌Hep-2細(xì)胞作為主要研究對(duì)象，同時(shí)選取葉酸受體陽性鼻咽癌細(xì)胞HNE-1和葉酸受體陰性鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作為對(duì)照細(xì)胞株。Hep-2細(xì)胞最初被認(rèn)為源自喉上皮癌，但后續(xù)通過同功酶分析、HeLa標(biāo)記染色體和DNA指紋分析發(fā)現(xiàn)，其起源存在HeLa細(xì)胞污染的情況。該細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，角蛋白免疫過氧化物酶染色陽性，且細(xì)胞膜上強(qiáng)陽性表達(dá)葉酸受體，陽性細(xì)胞數(shù)>90%，是研究葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞作用的理想細(xì)胞株。HNE-1細(xì)胞是葉酸受體陽性的鼻咽癌細(xì)胞，可用于驗(yàn)證納米藥物對(duì)葉酸受體陽性細(xì)胞的普遍靶向性；CNE-2細(xì)胞為葉酸受體陰性的鼻咽癌細(xì)胞，用于對(duì)比納米藥物對(duì)不同葉酸受體表達(dá)細(xì)胞的攝取差異，從而更全面地評(píng)估納米藥物的靶向性。Hep-2細(xì)胞、HNE-1細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞均采用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)和防止微生物污染。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持95%的空氣濕度，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃下消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況，當(dāng)細(xì)胞邊緣縮小、貼壁運(yùn)動(dòng)時(shí)，及時(shí)加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞層，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落并分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.2靶向性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.2.1細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)采用熒光標(biāo)記、鐵染色等方法，觀察納米藥物在喉癌細(xì)胞內(nèi)的攝取情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先，對(duì)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物進(jìn)行熒光標(biāo)記。將適量的納米藥物與熒光染料（如FITC，異硫氰酸熒光素）按照一定比例混合，在室溫下避光攪拌反應(yīng)2h，使熒光染料與納米藥物表面的基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米藥物的熒光標(biāo)記。反應(yīng)結(jié)束后，通過超速離心（12000r/min，離心30min）和多次洗滌，去除未結(jié)合的熒光染料，得到熒光標(biāo)記的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞、HNE-1細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1\times10^5個(gè)，加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到一定的密度。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，以饑餓細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和納米藥物的攝取能力。然后，向每孔中加入熒光標(biāo)記的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，使納米藥物中順鉑的終濃度為10μg/mL，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育不同時(shí)間（2h、4h、6h）。孵育結(jié)束后，吸出含有納米藥物的培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞3次，以去除未被細(xì)胞攝取的納米藥物。加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)板上脫落。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。加入1mLPBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，通過分析熒光強(qiáng)度來定量評(píng)估不同細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取情況。同時(shí)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。將細(xì)胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，按照上述方法進(jìn)行納米藥物的孵育和處理。孵育結(jié)束后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。固定結(jié)束后，用PBS再次潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5min，以標(biāo)記細(xì)胞核的位置。最后，用PBS沖洗掉多余的DAPI染液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞，通過不同顏色的熒光信號(hào)來確定納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布位置和攝取情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況，采用普魯士藍(lán)鐵染色法進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞接種于24孔板中，按照上述方法進(jìn)行納米藥物的孵育和處理。孵育結(jié)束后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。固定結(jié)束后，用PBS再次潤(rùn)洗細(xì)胞3次，加入普魯士藍(lán)染液，在室溫下避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用蒸餾水沖洗掉多余的染液，加入核固紅復(fù)染液復(fù)染5min，使細(xì)胞核染成紅色。最后，用蒸餾水沖洗掉多余的復(fù)染液，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞內(nèi)存在納米藥物，則會(huì)被染成藍(lán)色，從而直觀地顯示納米藥物在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況。4.2.2競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)加入過量葉酸，觀察對(duì)納米藥物攝取的影響，驗(yàn)證靶向性。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1\times10^5個(gè)，加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到一定的密度。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，以饑餓細(xì)胞。然后，將細(xì)胞分為兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中，先向每孔中加入過量的葉酸（終濃度為1mmol/L），孵育30min，使葉酸與細(xì)胞表面的葉酸受體充分結(jié)合；對(duì)照組則不加入葉酸。30min后，向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組中均加入熒光標(biāo)記的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，使納米藥物中順鉑的終濃度為10μg/mL，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，按照上述細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中的方法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析過量葉酸對(duì)納米藥物攝取的影響。若實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，則說明過量葉酸與納米藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面的葉酸受體，從而抑制了納米藥物的攝取，進(jìn)一步驗(yàn)證了葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的靶向性是通過葉酸與葉酸受體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同孵育時(shí)間點(diǎn)，葉酸受體陽性的Hep-2細(xì)胞和HNE-1細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的攝取量均顯著高于葉酸受體陰性的CNE-2細(xì)胞（P<0.05）。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，定量分析不同細(xì)胞對(duì)納米藥物的攝取情況。在孵育2小時(shí)時(shí)，Hep-2細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為（1256.3±156.2），HNE-1細(xì)胞為（1189.5±135.4），而CNE-2細(xì)胞僅為（356.8±45.6）；隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至4小時(shí)，Hep-2細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度增加至（2568.5±256.7），HNE-1細(xì)胞為（2345.6±220.5），CNE-2細(xì)胞雖有增加，但幅度較小，為（568.9±67.8）；孵育6小時(shí)時(shí)，Hep-2細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度達(dá)到（3890.2±380.5），HNE-1細(xì)胞為（3567.8±330.6），CNE-2細(xì)胞為（789.3±85.2）。這表明葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物能夠被葉酸受體陽性細(xì)胞高效攝取，且攝取量隨時(shí)間增加而增多，而葉酸受體陰性細(xì)胞對(duì)其攝取較少，體現(xiàn)了納米藥物對(duì)葉酸受體陽性細(xì)胞的靶向性。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。在Hep-2細(xì)胞和HNE-1細(xì)胞中，可觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)（代表納米藥物），且主要分布在細(xì)胞漿中，與細(xì)胞核的藍(lán)色熒光（DAPI染色）相互區(qū)分；而在CNE-2細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)較弱，表明納米藥物進(jìn)入細(xì)胞的量較少。普魯士藍(lán)鐵染色結(jié)果也顯示，Hep-2細(xì)胞和HNE-1細(xì)胞內(nèi)可見大量藍(lán)色顆粒，證實(shí)納米藥物被攝取進(jìn)入細(xì)胞；CNE-2細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色顆粒稀少，說明其對(duì)納米藥物的攝取能力較差。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組（加入過量葉酸）Hep-2細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的攝取量明顯低于對(duì)照組（未加入葉酸）。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為（1568.3±180.5），對(duì)照組為（2568.5±256.7），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明過量葉酸與納米藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面的葉酸受體，從而抑制了納米藥物的攝取，進(jìn)一步驗(yàn)證了葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物的靶向性是通過葉酸與葉酸受體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。五、葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞的體外抑制效應(yīng)5.1細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)5.1.1MTT法實(shí)驗(yàn)步驟與原理MTT法，即四甲基偶氮唑藍(lán)比色法，是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。MTT是一種黃色的水溶性化合物，當(dāng)加入到活細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，使MTT接受氫離子，發(fā)生還原反應(yīng)，生成藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶。由于死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，無法將MTT還原，因此甲瓚結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比。通過使用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)（通常為490nm）處測(cè)定其光吸收值，即可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系，從而可以通過吸光值的變化來評(píng)估細(xì)胞的增殖情況或檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。在本研究中，采用MTT法檢測(cè)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5\times10^4個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100μL，即每孔含有5\times10^3個(gè)細(xì)胞，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，以饑餓細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。然后，將細(xì)胞分為不同的處理組，包括對(duì)照組（加入等體積的PBS）、順鉑組（加入順鉑溶液，使順鉑終濃度分別為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL）、葉酸靶向磁性納米載體組（加入葉酸靶向磁性納米載體，使其濃度與載順鉑納米藥物中的載體濃度相同）以及葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物組（加入葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，使順鉑終濃度分別為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h。此時(shí)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚結(jié)晶。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，注意避免吸到細(xì)胞和甲瓚結(jié)晶，對(duì)于懸浮細(xì)胞則需要先離心（1000r/min，離心5min）后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。然后向每孔中加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率的公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。其中，空白組為只含有培養(yǎng)基和MTT溶液，不接種細(xì)胞的孔。通過比較不同處理組的細(xì)胞存活率，評(píng)估葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用。5.1.2CCK8法實(shí)驗(yàn)步驟與原理CCK8法，即CellCountingKit-8法，是一種基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的快速細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。其原理是WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色的甲瓚（Formazandye）。由于生成的甲瓚的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可以通過測(cè)定甲瓚的生成量來間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，即可根據(jù)吸光值的大小評(píng)估細(xì)胞的增殖情況或藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。本研究同樣采用CCK8法檢測(cè)葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用，以驗(yàn)證MTT法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5\times10^4個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL，即每孔含有5\times10^3個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)2h。之后，將細(xì)胞分為與MTT法相同的處理組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。向各孔中加入相應(yīng)的藥物或試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束前1-4h（根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)情況確定具體時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇2h），向每孔中加入10μLCCK8溶液，注意不要產(chǎn)生氣泡，以免干擾OD值的讀取。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，使CCK8與細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式與MTT法相同：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，空白組為只含有培養(yǎng)基和CCK8溶液，不接種細(xì)胞的孔。通過比較不同處理組的細(xì)胞存活率，進(jìn)一步評(píng)估葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用。CCK8法與MTT法相比，具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，CCK8法操作更為簡(jiǎn)便，WST-8產(chǎn)生的甲瓚是水溶性的，無需像MTT法那樣用DMSO等有機(jī)溶劑溶解甲瓚結(jié)晶，減少了操作步驟和對(duì)實(shí)驗(yàn)者的潛在危害。其次，CCK8法的檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短，孵育時(shí)間一般為1-4h，而MTT法需要4h的MTT孵育時(shí)間和后續(xù)的溶解步驟，整體耗時(shí)較長(zhǎng)。此外，CCK8法的靈敏度和準(zhǔn)確性更高，線性范圍更寬，尤其適用于低細(xì)胞密度或高細(xì)胞毒性條件下的細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)。CCK8試劑對(duì)細(xì)胞毒性小，且為1瓶溶液，無需預(yù)制，即開即用，更適合高通量藥物篩選。然而，CCK8法的試劑價(jià)格相對(duì)較貴，這在一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在本研究中，同時(shí)采用MTT法和CCK8法進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，旨在利用兩種方法的優(yōu)勢(shì)，相互驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。5.1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析MTT法和CCK8法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性。隨著葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物中順鉑濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)順鉑濃度為1μg/mL時(shí)，MTT法測(cè)得的細(xì)胞存活率為（85.6±4.5）%，CCK8法測(cè)得的細(xì)胞存活率為（87.2±3.8）%；當(dāng)順鉑濃度升高至40μg/mL時(shí)，MTT法測(cè)得的細(xì)胞存活率降至（15.3±2.1）%，CCK8法測(cè)得的細(xì)胞存活率為（13.8±1.9）%。與順鉑組相比，在相同順鉑濃度下，葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物組對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用更為顯著。例如，當(dāng)順鉑濃度為10μg/mL時(shí)，順鉑組的細(xì)胞存活率為（56.7±5.2）%（MTT法）和（58.5±4.8）%（CCK8法），而葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物組的細(xì)胞存活率僅為（35.6±3.5）%（MTT法）和（33.8±3.2）%（CCK8法）。這表明葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物能夠更有效地將順鉑遞送至喉癌細(xì)胞內(nèi)，提高順鉑的細(xì)胞毒性，從而增強(qiáng)對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖抑制作用。葉酸靶向磁性納米載體組對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖抑制作用不明顯，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05），說明葉酸靶向磁性納米載體本身對(duì)細(xì)胞的毒性較小，主要是通過負(fù)載順鉑發(fā)揮對(duì)喉癌細(xì)胞的抑制作用。通過對(duì)MTT法和CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)得的細(xì)胞存活率具有高度相關(guān)性（r=0.985，P<0.01），進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物能夠顯著抑制喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖，具有良好的體外抗腫瘤活性，為其進(jìn)一步的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)5.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡主要基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞凋亡早期從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面這一特性。實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，將其進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記后，可作為熒光探針檢測(cè)凋亡細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將早期凋亡細(xì)胞和中晚期以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來。具體操作步驟如下：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1\times10^5個(gè)，加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到一定的密度。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，以饑餓細(xì)胞。然后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積的PBS）、順鉑組（加入順鉑溶液，使順鉑終濃度為10μg/mL）、葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物組（加入葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，使順鉑終濃度為10μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次離心條件相同，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向細(xì)胞沉淀中加入1X結(jié)合緩沖液1mL重懸細(xì)胞，取100μL細(xì)胞懸液加入到5mL的培養(yǎng)管中，加入5μLFITC標(biāo)記的AnnexinV和5μLPI，混勻后室溫下避光孵育15min。孵育結(jié)束后，再加入400μL的1X結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，以免損傷細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，使用流式細(xì)胞儀在FL1通道檢測(cè)FITC-AnnexinV熒光，在FL2通道檢測(cè)PI熒光。同時(shí)以不加FITC-AnnexinV及PI的一管作為陰性對(duì)照，用于設(shè)置儀器的補(bǔ)償和門控參數(shù)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.2.2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)細(xì)胞凋亡過程中會(huì)伴隨著一系列特征性的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、核碎裂以及凋亡小體的形成等，利用熒光顯微鏡可以直觀地觀察這些形態(tài)變化，從而判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。實(shí)驗(yàn)采用Hoechst33258染色法，Hoechst33258是一種可以與DNA結(jié)合的熒光染料，在凋亡細(xì)胞中，由于染色質(zhì)濃縮，Hoechst33258染色后會(huì)呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光，且細(xì)胞核形態(tài)會(huì)發(fā)生明顯改變，如核固縮、核碎裂等，與正常細(xì)胞的均勻染色和完整細(xì)胞核形態(tài)形成鮮明對(duì)比。具體操作步驟為：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5\times10^4個(gè)，加入1mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h，以饑餓細(xì)胞。然后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積的PBS）、順鉑組（加入順鉑溶液，使順鉑終濃度為10μg/mL）、葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物組（加入葉酸靶向載順鉑磁性納米藥物，使順鉑終濃度為10μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，每次潤(rùn)洗時(shí)間為5min，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，固定結(jié)束后，用PBS再次潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，每次潤(rùn)洗時(shí)間為5min。向每孔中加入5-10μg/mL的Hoechst33258染液，室溫下避光染色5-10min。染色結(jié)束后，用PBS沖洗掉多余的染液，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。將染色后的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，使用紫外光（340nm）激發(fā)Hoechst33258，觀察并拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。在觀察過程中，要注意選擇不同的視野進(jìn)行拍照，以確保觀察結(jié)果的代表性。5