魚類原生動(dòng)物疾病防治技術(shù)規(guī)范2018-09-01發(fā)布2018-11-01實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定編制。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：岳城、郭愛(ài)民、郝翠蘭、謝志勝、楊昆明、段成任、焦麗、馬江霞、喀迪11范圍本標(biāo)準(zhǔn)制定了新疆常見(jiàn)魚類原生動(dòng)物疾病防治的術(shù)語(yǔ)和定義、病原特征、生活史及流行情況、臨床癥狀和病理變化、病原診斷及綜合防治措施。本標(biāo)準(zhǔn)適用于養(yǎng)殖企業(yè)、個(gè)體養(yǎng)殖戶的防病工作及基層獸醫(yī)部門檢疫診斷工作。2規(guī)范性引用文下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T34734-2017淡水魚類小瓜蟲病診斷規(guī)程SC/T1132-2016魚藥使用規(guī)范SN/T2503-2010淡水魚中寄生蟲檢疫技術(shù)規(guī)范SC/T7014-2006水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。魚類原生動(dòng)物疾病，又稱魚類原蟲病，泛指由原生動(dòng)物門的病原種類所引起的魚類疾病。原生動(dòng)物可侵染魚體各器官組織，當(dāng)進(jìn)行魚類寄生蟲檢查時(shí)，不論魚的種類、年齡、性別、檢查的季節(jié)及采集地點(diǎn)如何，總會(huì)發(fā)現(xiàn)有原蟲寄生，所以原蟲在魚體上寄生很廣泛。其嚴(yán)重感染時(shí)，可在短期內(nèi)引起魚類(尤其是魚苗、魚種)大批死亡。新疆常見(jiàn)魚類寄生原生動(dòng)物疾病是指新疆地區(qū)常見(jiàn)原生動(dòng)物引起的魚類病害，包括對(duì)常見(jiàn)養(yǎng)殖魚類及新疆土著魚類。主要的病原有車輪蟲、斜管蟲、小瓜蟲、杯體蟲、累枝蟲、孢子蟲和隱鞭蟲。車輪蟲病trichodiasis由車輪蟲科(Trichodinidae)的蟲體寄生在魚的體表、腮等部位，使鰓組織及體表組織潰爛，影響魚的呼吸并導(dǎo)致繼發(fā)感染，而致魚類死亡的一種疾病。由斜管蟲屬(Chilodonellasp)的蟲體寄生在魚的鰓部、皮膚及鼻腔，刺激魚體與物體摩擦、表皮發(fā)炎、壞死脫落，呼吸困難，繼發(fā)感染而死亡的一種疾病。小瓜蟲病ichthyophthiriasis類行為異常、發(fā)生嚴(yán)重病理變化，導(dǎo)致死亡的一種疾病。俗稱“白點(diǎn)病”。2由杯體蟲屬(Apiosomasp)的蟲體寄生于魚類的腮、皮膚等部位，導(dǎo)致魚類呼吸困難并死亡的一由孢子蟲綱(Myxosprea)的各種蟲體寄生于魚類的體表、見(jiàn)附錄A。車輪蟲可進(jìn)行無(wú)性二分裂繁殖或有性接合生殖。車輪蟲繁殖的適宜水溫約為20℃~28℃,全年都可發(fā)病，春夏兩季達(dá)到高峰。各種魚類均可發(fā)病且危害巨大，對(duì)新疆土著魚類的影響小瓜蟲生活史包括滋養(yǎng)體、包囊和幼蟲3個(gè)連續(xù)階段。小瓜蟲最適水溫是15℃~25℃,通常在20℃累枝蟲無(wú)可進(jìn)行無(wú)性二分裂繁殖或有性接合生殖。主要在4月~5月流行。各種魚類均可發(fā)病，特3年的6月~10月，對(duì)苗種的危害巨大。5.6孢子蟲感染47.1形態(tài)學(xué)診斷可刮取患病處黏液在顯微鏡下觀察并與形態(tài)學(xué)特征(見(jiàn)附錄A)進(jìn)行對(duì)比，必要時(shí)制作蟲體標(biāo)本并進(jìn)行相應(yīng)的染色(見(jiàn)附錄B)。7.2分子生物學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷包括DNA的提取和PCR鑒定，具體操作見(jiàn)附錄C。8綜合防治措施8.1預(yù)防措施8.1.1漁池和孵化槽的設(shè)計(jì)和建造上應(yīng)盡量做到符合防病要求，每個(gè)池塘應(yīng)有獨(dú)立的進(jìn)排水口，水源充足、清潔，避免從進(jìn)水口處引入病原寄生蟲。8.1.2建立檢疫制度。魚種、魚苗引進(jìn)或引出時(shí)要進(jìn)行認(rèn)真檢疫，確認(rèn)無(wú)病和無(wú)病原后再放養(yǎng)，以防地區(qū)性寄生蟲病擴(kuò)散傳播。8.1.3在魚苗孵化前要用漂白粉、生石灰清洗、消毒。在魚苗、魚種放養(yǎng)前必須堅(jiān)持徹底清塘，用藥物消滅池中的病原生物。8.1.4魚種放養(yǎng)、分塘、轉(zhuǎn)塘前應(yīng)對(duì)魚體進(jìn)行藥物浸洗消毒、殺蟲，切斷傳播途徑。8.1.5開展藥物預(yù)防。病原體往往粘附在飼料中進(jìn)人池塘，因此，對(duì)食物場(chǎng)地要進(jìn)行定期消毒，對(duì)投喂的飼料，特別是青草等飼料要進(jìn)行消毒、殺蟲。在魚病易發(fā)季節(jié)，要定期用藥物全池消毒、定期投喂藥餌，控制病原滋生，以達(dá)到防病效果。8.1.6提高魚體自身抵抗力。在越冬期間要選用較好的配合飼料投喂。在開春投喂時(shí)要注意添加一部分營(yíng)養(yǎng)及免疫調(diào)節(jié)劑等，盡快恢復(fù)魚類因越冬而消耗的體質(zhì)，并通過(guò)拉網(wǎng)鍛煉，提高免疫力；在活魚裝運(yùn)時(shí)，要盡量避免魚體受傷，減少病原生物侵人機(jī)會(huì)。硫酸銅硫酸亞鐵合劑：10g/m3藥浴15min~30min;或水溫低于30℃時(shí)，1g/m3全池潑灑，水溫高于30℃時(shí)0.6g/m3~0.7g/m3全池潑灑。使用時(shí)需考慮水溫的高低、有機(jī)質(zhì)的多少及水的酸堿度。鱘魚對(duì)該藥較為敏感，需慎用。當(dāng)病情嚴(yán)重時(shí)，可考慮全池潑灑一次殺菌藥，以防繼發(fā)細(xì)菌感染。8.2.2.1亞乙基雙二硫代氨基甲酸銨：按0.2g/m3全池均勻潑灑，嚴(yán)禁局部使用藥物濃度過(guò)高。8.2.2.2苯扎溴銨溶液：8g/m3~15g/m3,加水稀釋后全池潑灑。水體中有機(jī)物多時(shí)，可加倍使用，具體的要結(jié)合養(yǎng)殖品種的種類選擇用藥濃度；無(wú)鱗魚使用時(shí)劑量要慎重。冷水魚較敏感，需慎用。8.2.2.3硫酸鋅粉：0.75g/m3~1g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。8.2.2.4硫酸鋅三氯異氰脲酸粉：0.3g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。8.2.3小瓜蟲病防治措施8.2.3.1外用復(fù)方絡(luò)合銅(25%環(huán)烷酸銅合劑):0.30g/m3~0.35g/m3,全池均勻潑灑；翌日起內(nèi)服復(fù)方中草藥(青蒿、檳榔、苦參、辣廖),用60℃熱水浸泡6h后冷卻，12.5g/kg~25g/kg拌飼投喂，連續(xù)8.2.3.2硫酸鋅粉：0.75g/m3~1g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。8.2.3.3硫酸鋅三氯異氰脲酸粉：0.3g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。58.2.4斜管蟲、杯體蟲、累枝蟲病防治措施8.2.4.1苯扎溴銨：0.6g/m3全池潑灑；水體中有機(jī)物多時(shí)，可加倍使用，具體的要結(jié)合養(yǎng)殖品種的種類選擇用藥濃度；無(wú)鱗魚劑量要慎重。冷水魚慎用。8.2.4.2硫酸鋅粉：0.75g/m3~1g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。8.2.4.3硫酸鋅三氯異氰脲酸粉：0.3g/m3,全池潑灑，苗種期慎用。3.2.5.2地克珠利預(yù)混劑(水產(chǎn)用):7g/kg~8g/kg拌飼投喂，連喂4d~5d。3.2.5.3外用復(fù)方絡(luò)合銅(25%環(huán)烷酸銅合劑):0.30g/m3~0.35g/m3,全池均勻潑灑；蝦蟹池慎用。3.2.5.3鹽酸氯苯胍粉：40mg/kg,拌飼投喂，苗種減半。5附錄A(資料性附錄)病原特征A.1形態(tài)特征帶兩側(cè)各長(zhǎng)一行纖毛，口帶最后會(huì)與胞口相通，口帶長(zhǎng)短決定口圍繞度的大小?？趪@度分為縮泡。車輪蟲有一大一小2個(gè)核，大核呈U形、C形或馬蹄狀。小核呈球形或橢球形，一般分布在大核一端的內(nèi)側(cè)、外側(cè)或前端。用干銀法染色，可清楚看到其附著盤結(jié)側(cè)突出，后端較厚。腹面前端有一胞口，背面前左側(cè)有1行較粗而長(zhǎng)的剛毛，其余裸圓形大核，有2個(gè)伸縮泡分別位于蟲體的右前方和左后方。用蛋白銀法染色，可以清晰地看到其纖毛圖或青灰色，細(xì)胞核呈馬蹄形或香腸狀。胞口位于前端的腹面。用10%甘油酒精透明處理的小瓜蟲，可的發(fā)育，馬蹄形的大核慢慢地縮短變圓，小核脫離大核。包囊形成2h~3h后，身體中部開始出現(xiàn)分裂溝。幼蟲在包囊內(nèi)需要經(jīng)過(guò)5h~8h的發(fā)育后才成熟并開始活動(dòng)尋找出口。度為體纖毛的3倍。染色標(biāo)本中的大核為卵形，小核圓形，位置不恒定。身體充分伸展時(shí)呈杯狀，前端粗，向后變狹。前端有1個(gè)圓盤形的口圍盤?？趪P四周有3層口緣膜結(jié)構(gòu)。緣膜由纖毛構(gòu)成，但不一定全連成一片?？趪P內(nèi)尚有1個(gè)左轉(zhuǎn)的口溝，庭不接胞咽?？诰壞ぶ虚g的2圈，沿口溝兩邊，隨口溝環(huán)繞，外面一圈直至前庭，變?yōu)椴▌?dòng)膜。在體中體寬為體長(zhǎng)的1/3~1/2。前端口圍顯著地厚而膨大，和本體交界處約束成為一個(gè)環(huán)形的頸。具有纖A.1.6孢子蟲孢子由1~7的殼片構(gòu)成的，它是由原生質(zhì)轉(zhuǎn)化而成為這種瓣膜狀的幾丁質(zhì)孢殼。兩殼瓣相連處成為7縫線的一面，稱殼面，孢子膜的大小和形狀因種而異。其表面一般是平滑的，但有些種類則有褶紋，雕紋或條紋。某些種類在殼的后緣又有長(zhǎng)短、粗細(xì)不一的各種突起，或延伸而呈“尾巴”狀，每個(gè)孢子有1、2或4~7個(gè)極囊。極囊可為梨形、瓶狀、球狀。在極囊之下或中間有孢中質(zhì)，內(nèi)有嗜碘泡及兩個(gè)胚核。A.1.6.1四極蟲營(yíng)養(yǎng)體直徑19.5μm~22.5μm。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)體內(nèi)含孢子數(shù)很少。無(wú)嗜碘泡，縫脊直，殼片有8條~10條與縫脊平行的條紋，其中一條與縫脊平行。孢子呈球形，大小為10.5μm×10.1μm。4個(gè)形狀與大小相似的球形極囊，集中排列于孢子的一端。A.1.6.2兩極蟲孢子紡錘形，兩端尖或圓，有兩個(gè)殼片，極囊2個(gè)，位于孢子的兩極，縫線較平直，沒(méi)有嗜碘泡。孢子殼面觀和縫面觀都呈狹長(zhǎng)瓜子形，后端鈍圓，向前端較尖細(xì)；有兩個(gè)殼片，殼面光滑無(wú)褶皺，大小為(26.4~30)μm×(7.2~9.6)μm;有1個(gè)棍狀極囊，約占孢子的2/3~3/4;有嗜碘泡；孢子外面常有一孢子卵形或橢圓形，扁平，前端有兩個(gè)極囊，等大或不等，內(nèi)有螺旋形極絲，孢中質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)胚核和一個(gè)明顯的嗜碘泡。A.1.7隱鞭蟲蟲體狹長(zhǎng)，輪廓像一片柳葉，毛基體在身體的前端。從身體前端的毛基體長(zhǎng)出2根鞭毛，一根向前叫前鞭毛，另一根沿身體表面構(gòu)成波動(dòng)膜之后，從后端伸出體外為后鞭毛。波動(dòng)膜狹窄，但頗為顯著。孢核圓形，在身體中部。胞核前面是一個(gè)同胞核形狀和大小差不多的構(gòu)造，卵圓形或圓形，叫做動(dòng)核。A.1.7.2顫動(dòng)隱鞭蟲蟲體略似三角形，比鰓隱鞭蟲小。毛基體在身體的近前端側(cè)面。前鞭毛和后鞭毛不等長(zhǎng)。胞核圓形，位于身體中部稍前的地方。動(dòng)核呈棍棒狀，在胞核前面，與身體略呈垂直。波動(dòng)膜不顯著。8(資料性附錄)片與載玻片之間的空隙。最后在玻片上做好標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明宿主采集日期。B.2.1蛋白銀染色法玻恩液：冰醋酸(CH?COOH):甲醛溶液(HCHO):苦味酸(C?H?N?O?7)=1:1:15顯影液：將0.5g亞硫酸鈉(NaSO?)溶于10mL水在解剖鏡下將纖毛蟲用微吸管吸取一定數(shù)量置于裝有玻恩液的胚胎皿中，固定5min。蒸餾水洗滌3蟲體，至蟲體變?yōu)闊o(wú)色透明后，立即用水重洗，直至胚胎皿中的NaCIO完全洗凈。加入5~6滴1%的蛋白銀溶液，加蓋后在60℃的恒溫箱中放置1h后取出。待胚胎皿降至室溫時(shí)，加入顯影液顯影5min。顯影后立即加入5%的定影液，定影5min。再次水洗，直至胚胎皿中的液體變?yōu)闊o(wú)色透明。將胚胎皿中的蟲體用極細(xì)的微吸管吸出，置于一張干凈的載玻片上，加入少量的蛋白甘油，烘干后依次在70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精I(xiàn)→100%酒精Ⅱ→50%酒精+50%二甲苯→100%二甲苯 I→100%二甲苯Ⅱ中進(jìn)行脫水透明，最后用中性樹膠封片。吸取蟲體置于干凈的載玻片上，自然晾干。滴數(shù)滴1%的硝酸銀溶液于樣品上，覆蓋1min。用蒸餾水洗凈硝酸銀溶液，自然晾干。60W臺(tái)燈距離5cm爆照1min。顯影劑顯影10s,鏡檢后迅速用蒸餾水洗凈。浸入95%的酒精中1min,自然晾干，中性樹膠封片。9C:100mL蒸餾水，10g氫氧化鈉(NaOH),長(zhǎng)期存放。B.2.3甘油酒精法觀察取用10%甲醛或升汞固定的小瓜蟲，用蒸餾水洗凈后放入10%的甘油酒精(10mL甘油+90mL無(wú)水乙醇)中。觀察時(shí)吸出若干蟲體于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，室溫放置24h以上，待酒精揮發(fā)、甘油濃縮后于顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。B.3蟲種形態(tài)及病魚圖：(資料性附錄)將蟲體吸取至載玻片上，用蒸餾水清洗干凈，集中至PCR管中，盡量吸干水(如不能立即DNA,則可先保存至95%酒精中，待提取時(shí)用梯度酒精復(fù)水),使用DNA提取試劑盒(Sigma,St.Louis)C.2PCR鑒定C.2.2診斷步驟(以車輪蟲為例)25μL反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系上游引物F1下游引物R1加ddH?O至30個(gè)循環(huán)30個(gè)循環(huán)溫度時(shí)間延伸再延伸用1×TAE電泳緩沖液配制1.0%的瓊脂糖(含100μL/L熒光染料),在電泳槽中加入電泳緩沖液，使間約30min;凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果(車輪蟲約460bp),