152022-07-29發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：張?jiān)旅贰②w世華、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、張帆、楊斌、劉I間接ELISA方法檢測羊溶血性曼氏桿菌抗體本文件規(guī)定了應(yīng)用間接ELISA檢測羊溶血性曼氏桿菌抗本文件適用于羊溶血性曼氏桿菌PlpE蛋白或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，在一定底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底辣根過氧化物酶horseradish與堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）常被用于免疫酶技術(shù)中的抗體或抗抗體的標(biāo)記，而12一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，它可以作為具有l(wèi)ac或tac等啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。吐溫-20tween-20一種蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，從卡那霉素鏈霉菌(Streptomyceskanamyceticus)分離鑒定并經(jīng)測序確定為溶血性曼氏桿菌的菌液制備全菌滅活抗原，并4.5碳酸鹽包被液稱取碳酸鈉1.0g和碳酸氫鈉3.0g,溶于800mL超純水，調(diào)節(jié)pH值為9.4～9.6,用超純水定容至調(diào)整pH值為7.4,超純水定容至1000mL,121℃高壓蒸汽滅菌15min。3量取5.0mL馬血清溶于95.0mLPBS中。稱取TMB200.0mg,無水乙醇(或二甲基亞砜)100mL,加超純水至1000mL。4.11底物液B十二水合磷酸氫二鈉14.60g,檸檬酸9.33g,0.75%過氧化氫6.4mL,調(diào)pH值為5.0～5.4,加超純水至1000mL。稱取胰酪胨15.0g,大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g,氯化鈉5.0g,超純水1000mL,混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.3,加入15.0g瓊脂，加熱融化后，121℃高壓蒸汽滅菌15min,冷卻至約60℃,在無菌操作條件下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃稱取胰酪胨15.0g,大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g,氯化鈉5.0g,超純水1000mL,混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.3,121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。值為7.3,121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。值為7.3,加入15.0g瓊脂，加熱融化后，121℃高壓蒸汽滅菌15min,冷卻至約60℃,在無菌操作要求下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。5.3天平：稱量范圍0g~500g,讀數(shù)精確度0.01g。5.4恒溫?fù)u床：37℃。45.9血清稀釋板(96孔一次性U型血凝板或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。采血器室溫靜置2h,待血液凝固后，將其放入冰箱2℃~8℃3h后，4000r/min離心10min,用移血清樣本若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測，可在冰箱中2℃~8℃保存，如果超過一周檢測，應(yīng)將樣品置于-20℃保存，測試前應(yīng)將樣本提前恢復(fù)至室溫。運(yùn)輸過程注意冷藏，可將采集的血清樣本用冰袋、保溫基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。振蕩培養(yǎng)至0D6o為0.6,加入IPTG使其終濃度為1mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體，將菌體沉淀懸57.2ELISA檢測7.2.1包被：將目的蛋白用0.05mol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋為0.25μg/mL,按100L/孔加入至酶聯(lián)反應(yīng)板，置4℃冰箱過夜，次日甩掉包被液，用PBST洗滌酶聯(lián)反應(yīng)板3次。出后加PBST洗板3次。7.2.3加樣：用PBS按體積比1:100稀釋待檢血清、陽性、陰性對(duì)照血清，稀釋后血清100LL/孔，37℃恒溫箱孵育1h,用PBST洗板3次。吸取不同血清時(shí)需要更換洗頭。7.2.4加酶結(jié)合物：取稀釋好的酶結(jié)合物，酶聯(lián)反應(yīng)板100μL/孔加注，37℃恒溫箱孵育30min,洗7.2.5加底物顯色：將底物液A和底物液B等體積混合制成的TMB底物顯色液按100μL/孔加注，室7.2.6數(shù)據(jù)讀取：用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定每孔的吸收值，每個(gè)樣品每次平行2孔，取其平均