AGO2互作蛋白PSMC3、DFFA對RNAi功能影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義RNA干擾（RNAinterference，RNAi）作為一種在生物體內(nèi)通過小RNA分子抑制特定基因表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)，自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的核心研究內(nèi)容。它利用內(nèi)源或人工合成的小干擾RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）來實現(xiàn)對目標(biāo)基因的精準(zhǔn)調(diào)控，在基因功能研究、疾病治療、藥物開發(fā)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域展現(xiàn)出非凡的價值。在基因功能研究中，RNAi是探索基因功能和網(wǎng)絡(luò)、揭示生物體生長發(fā)育和疾病發(fā)生分子機制的有力工具，能夠幫助科研人員深入了解基因在生命過程中的具體作用和相互關(guān)系。在藥物開發(fā)方面，RNAi技術(shù)為設(shè)計新型抗病毒藥物、抗癌藥物和遺傳疾病治療策略開辟了新路徑，為攻克多種疑難病癥帶來了希望。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于培育抗病蟲害和抗逆性強的作物品種，有助于提高農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量，保障全球糧食安全。在RNAi的復(fù)雜機制中，Argonaute2（AGO2）蛋白占據(jù)著核心地位。它是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的關(guān)鍵組成部分，在RISC組裝過程中，AGO2將siRNA分離成引導(dǎo)鏈和乘客鏈，并降解乘客鏈，保留引導(dǎo)鏈作為與mRNA比對的模板，進(jìn)而在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下切割靶mRNA，實現(xiàn)基因沉默。不僅如此，AGO2還參與miRNA通路，對具有2-nt3'末端懸垂的成熟miRNA雙鏈進(jìn)行識別并裝載形成RISC，調(diào)控靶基因的表達(dá)。AGO2在RNAi過程中的核心作用使其成為研究RNAi機制和相關(guān)應(yīng)用的關(guān)鍵靶點。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞的各種生理過程中發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用，對于維持細(xì)胞正常功能和生命活動的有序進(jìn)行至關(guān)重要。在RNAi過程中，AGO2與其他蛋白質(zhì)的相互作用對其功能的正常發(fā)揮起著不可或缺的調(diào)控作用。PSMC3和DFFA作為AGO2的相互作用蛋白，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡等重要生理過程中各自扮演著獨特角色。PSMC3是蛋白酶體的重要組成部分，參與蛋白質(zhì)的降解過程，確保細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制和代謝平衡。DFFA則在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與DNA的降解和細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。它們與AGO2的相互作用可能通過多種機制影響RNAi功能。一方面，PSMC3可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解過程，影響參與RNAi通路的相關(guān)蛋白質(zhì)的豐度和穩(wěn)定性，進(jìn)而間接影響RNAi功能。另一方面，DFFA可能在細(xì)胞凋亡等特殊生理狀態(tài)下，改變細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境和信號通路，與AGO2相互作用，對RNAi功能產(chǎn)生影響。深入研究AGO2與PSMC3、DFFA之間的相互作用關(guān)系及其對RNAi功能的影響，有助于從分子層面揭示RNAi的調(diào)控機制，為優(yōu)化RNAi技術(shù)在基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。目前，雖然對RNAi機制和AGO2的研究已取得顯著進(jìn)展，但對于AGO2與PSMC3、DFFA相互作用如何影響RNAi功能的具體分子機制，仍存在許多未知。在基因治療中，RNAi技術(shù)面臨著諸如脫靶效應(yīng)、遞送效率等挑戰(zhàn)，深入了解這些相互作用關(guān)系，有望為解決這些問題提供新的思路和方法。在藥物研發(fā)方面，明確這些分子間的作用機制，有助于開發(fā)更加高效、特異的RNAi藥物，提高治療效果，減少副作用。因此，本研究聚焦于AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA對RNAi功能的影響，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1AGO2的研究進(jìn)展自RNAi現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來，AGO2作為RNAi機制中的核心蛋白，一直是國內(nèi)外研究的重點。早期研究主要聚焦于AGO2在RNAi通路中的基礎(chǔ)功能，明確了AGO2在RISC組裝中的關(guān)鍵作用，即它能夠結(jié)合siRNA或miRNA，形成具有活性的RISC，進(jìn)而識別并切割靶mRNA，實現(xiàn)基因沉默。隨著研究的深入，對AGO2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的解析取得了顯著成果。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究揭示了AGO2的PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域在結(jié)合小RNA和切割靶mRNA過程中的獨特作用機制，為深入理解RNAi的分子機制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如，PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性識別小RNA的3'末端，而PIWI結(jié)構(gòu)域則具有核酸內(nèi)切酶活性，負(fù)責(zé)切割靶mRNA。在疾病研究領(lǐng)域，AGO2與多種疾病的關(guān)聯(lián)逐漸被揭示。在腫瘤研究中，大量研究表明AGO2的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。一些腫瘤細(xì)胞中AGO2的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為。在乳腺癌細(xì)胞中，AGO2的過表達(dá)可通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，AGO2在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中的作用也受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，AGO2參與了神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的發(fā)育過程，其功能異?？赡軐?dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙。在阿爾茨海默病患者的腦組織中，AGO2的表達(dá)和功能改變與淀粉樣蛋白的沉積和神經(jīng)元的凋亡相關(guān)。1.2.2PSMC3的研究進(jìn)展PSMC3作為蛋白酶體的關(guān)鍵組成部分，在蛋白質(zhì)代謝過程中扮演著重要角色，國內(nèi)外對其研究也較為廣泛。在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，PSMC3在蛋白酶體中的功能和作用機制已得到深入探討。PSMC3參與了蛋白酶體對蛋白質(zhì)的識別、解折疊和降解過程，確保細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制和代謝平衡。它通過與其他蛋白酶體亞基相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白酶體復(fù)合物，協(xié)同完成蛋白質(zhì)降解任務(wù)。研究還發(fā)現(xiàn)，PSMC3在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等重要生理過程中發(fā)揮著間接作用。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，PSMC3通過降解特定的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞周期的各個階段轉(zhuǎn)換，保證細(xì)胞正常分裂和增殖。在疾病相關(guān)性研究方面，PSMC3與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。在腫瘤領(lǐng)域，PSMC3的異常表達(dá)與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。許多腫瘤組織中PSMC3表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。在肝癌組織中，PSMC3的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在心血管疾病研究中，PSMC3也被發(fā)現(xiàn)參與了動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在動脈粥樣硬化斑塊中，PSMC3的表達(dá)變化與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)，可能通過影響血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。1.2.3DFFA的研究進(jìn)展DFFA在細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用是其研究的核心內(nèi)容。早期研究明確了DFFA在細(xì)胞凋亡信號通路中的地位，它作為核酸酶DFFB的激活因子，在細(xì)胞凋亡時被激活，參與DNA的降解過程，導(dǎo)致細(xì)胞核固縮和凋亡小體的形成。進(jìn)一步研究揭示了DFFA的激活機制和調(diào)控方式，它受到多種凋亡相關(guān)蛋白和信號通路的調(diào)節(jié)，如Caspase家族蛋白酶的切割激活，以及Bcl-2家族蛋白對其活性的抑制或促進(jìn)作用。在細(xì)胞受到凋亡刺激時，Caspase-3會切割DFFA，使其釋放出活性片段，進(jìn)而激活DFFB，引發(fā)DNA降解。在疾病研究方面，DFFA與多種疾病的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。在腫瘤研究中，DFFA的功能異常與腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗和化療耐藥性相關(guān)。一些腫瘤細(xì)胞通過調(diào)節(jié)DFFA的表達(dá)或活性，逃避細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在白血病細(xì)胞中，DFFA的表達(dá)降低或功能受損，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，影響治療效果。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，DFFA也參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)退行性疾病的病理過程。在帕金森病患者的腦組織中，DFFA的表達(dá)和活性改變與多巴胺能神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，可能在帕金森病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。1.2.4AGO2與PSMC3、DFFA相互作用及對RNAi功能影響的研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于AGO2與PSMC3、DFFA之間相互作用的研究相對較少，但已有的研究成果顯示出這種相互作用的重要性。在分子機制研究方面，有研究通過免疫共沉淀等技術(shù)證實了AGO2與PSMC3、DFFA在細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用。但對于這種相互作用如何影響RNAi功能的具體分子機制，仍處于初步探索階段。一些研究推測，PSMC3可能通過調(diào)節(jié)AGO2的穩(wěn)定性或修飾狀態(tài)，影響RISC的組裝和活性，進(jìn)而影響RNAi功能。PSMC3可能參與降解與AGO2結(jié)合的抑制性蛋白，或者促進(jìn)AGO2的泛素化修飾，改變其在細(xì)胞內(nèi)的定位和活性。在生理功能研究方面，已有研究表明AGO2與PSMC3、DFFA的相互作用在細(xì)胞的抗病毒免疫、細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程中發(fā)揮著一定作用。在抗病毒免疫過程中，三者的相互作用可能影響病毒RNA的降解和免疫信號的傳遞，從而影響細(xì)胞對病毒感染的抵抗能力。在細(xì)胞增殖和凋亡過程中，這種相互作用可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的命運決定。然而，這些研究還不夠系統(tǒng)和深入，對于三者相互作用在不同生理和病理條件下的具體功能和調(diào)控機制，仍有待進(jìn)一步研究。1.2.5研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足綜上所述，國內(nèi)外在AGO2、PSMC3、DFFA各自的功能和疾病相關(guān)性方面已取得了豐富的研究成果，但對于AGO2與PSMC3、DFFA相互作用及對RNAi功能影響的研究仍存在諸多不足。在分子機制研究方面，雖然已證實三者存在相互作用，但具體的作用位點、作用方式以及相互作用如何影響RNAi通路中關(guān)鍵蛋白的活性和穩(wěn)定性等問題，尚未得到明確解答。在生理功能研究方面，三者相互作用在不同生理和病理條件下的功能和調(diào)控機制研究還不夠系統(tǒng)和全面，缺乏對其在整體生物體水平上作用的深入探究。此外，目前的研究多集中在細(xì)胞模型上，對于在動物模型和人體中的驗證研究相對較少，這限制了研究成果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。因此，深入研究AGO2與PSMC3、DFFA相互作用及對RNAi功能的影響，具有重要的理論和現(xiàn)實意義，有望為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和策略。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA對RNAi功能的影響，具體研究目的如下：明確相互作用關(guān)系：運用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)，精準(zhǔn)確定PSMC3、DFFA與AGO2在細(xì)胞內(nèi)的直接相互作用，并詳細(xì)解析三者之間的相互作用位點和作用方式，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。揭示對RNAi功能的影響：通過基因敲降、過表達(dá)等實驗手段，深入研究PSMC3、DFFA對RNAi功能的影響，包括對RISC組裝效率、小RNA穩(wěn)定性、靶mRNA切割效率等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的作用，全面揭示其對RNAi功能的調(diào)控機制。闡明分子機制：從分子層面深入剖析PSMC3、DFFA影響RNAi功能的具體機制，探究它們是否通過調(diào)節(jié)AGO2的修飾狀態(tài)、亞細(xì)胞定位或與其他RNAi相關(guān)蛋白的相互作用，來實現(xiàn)對RNAi功能的調(diào)控，為理解RNAi的精細(xì)調(diào)控提供理論依據(jù)。探索生理病理意義：在細(xì)胞和動物模型中，系統(tǒng)研究AGO2與PSMC3、DFFA相互作用在正常生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，如在抗病毒免疫、細(xì)胞增殖與凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中的功能，為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和策略。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：研究角度創(chuàng)新：以往對RNAi功能的研究多集中在核心蛋白AGO2本身以及經(jīng)典的RNAi通路，而本研究從AGO2的相互作用蛋白PSMC3、DFFA出發(fā)，為研究RNAi功能的調(diào)控機制提供了全新的視角，有望揭示RNAi過程中尚未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機制。多學(xué)科交叉研究方法創(chuàng)新：綜合運用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)以及生物信息學(xué)等多學(xué)科研究方法，對PSMC3、DFFA與AGO2的相互作用及對RNAi功能的影響進(jìn)行全面深入的研究。通過多學(xué)科的交叉融合，能夠從不同層面和角度揭示三者之間的關(guān)系和作用機制，使研究結(jié)果更加全面、深入和準(zhǔn)確。研究內(nèi)容創(chuàng)新：目前對于PSMC3、DFFA在RNAi過程中的作用研究較少，本研究首次將PSMC3、DFFA與RNAi功能聯(lián)系起來，填補了該領(lǐng)域在這方面的研究空白。同時，本研究還將探索三者相互作用在生理病理過程中的意義，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和靶點，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。二、RNAi與AGO2、PSMC3、DFFA概述2.1RNAi的作用機制與生物學(xué)功能2.1.1RNAi的作用機制RNAi是一種在生物體內(nèi)高度保守的基因表達(dá)調(diào)控機制，其核心作用是通過小RNA分子介導(dǎo)對靶基因的特異性沉默，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。這一過程涉及多個關(guān)鍵步驟和多種蛋白質(zhì)的協(xié)同作用，展現(xiàn)了生命活動在分子層面的高度復(fù)雜性和精確性。RNAi的起始階段始于雙鏈RNA（dsRNA）的出現(xiàn)。dsRNA的來源具有多樣性，它可以通過外源導(dǎo)入的方式進(jìn)入細(xì)胞，例如在實驗研究中，科研人員常常人工合成dsRNA并將其導(dǎo)入細(xì)胞，以啟動特定的RNAi過程。dsRNA也可能是細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的，當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時，病毒的基因組在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程中會產(chǎn)生dsRNA中間體；細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等過程也能產(chǎn)生dsRNA。這些dsRNA一旦在細(xì)胞中出現(xiàn)，便會成為RNAi機制啟動的信號。在起始階段，細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Dicer酶屬于RNaseⅢ核糖核酸酶家族，其結(jié)構(gòu)獨特，包含兩個催化結(jié)構(gòu)域、一個解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個PAZ（Piwi/Argonaute/Zwille）結(jié)構(gòu)域。當(dāng)dsRNA出現(xiàn)后，細(xì)胞中的Rde-1、Rde-4等編碼的蛋白會識別dsRNA，并引導(dǎo)其與Dicer酶結(jié)合。Dicer酶以ATP依賴的方式對dsRNA進(jìn)行加工，它首先將dsRNA解旋，然后以一種精確的方式將其裂解為長度約為21-23nt的雙鏈小分子干擾RNA（siRNA）。這些siRNA具有特定的結(jié)構(gòu)特征，其每條單鏈的3’端都帶有2個突出的非配對堿基（多數(shù)是UU），這種結(jié)構(gòu)對于siRNA后續(xù)的功能發(fā)揮至關(guān)重要。siRNA的生成標(biāo)志著RNAi起始階段的完成，同時也啟動了后續(xù)更為復(fù)雜的效應(yīng)階段。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA會結(jié)合一個核酶復(fù)合物，進(jìn)而形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。RISC是RNAi效應(yīng)發(fā)揮的核心組件，它由多種成分構(gòu)成，包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白等。在RISC形成過程中，需要一個ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程，這一過程使得RISC被激活，從而具備識別和切割靶mRNA的能力?；罨蟮腞ISC會依據(jù)siRNA中的反義鏈，精準(zhǔn)地定位到與反義鏈互補的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上。RISC中的內(nèi)切核酸酶會在距離siRNA3’端12個堿基的位置對靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的沉默。通過遺傳分析方法研究發(fā)現(xiàn)，線蟲中的RDE-1、MUT-7和DNA/RNA解旋酶及其他PAZ/Piwi蛋白也參與到這一階段的反應(yīng)中，它們與RISC中的各種成分相互協(xié)作，共同確保RNAi效應(yīng)的高效和準(zhǔn)確。除了上述經(jīng)典的RNAi作用機制外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)RNAi存在擴增效應(yīng)。Dicer酶將長dsRNA切成初級siRNA，這一放大水平與dsRNA的長度密切相關(guān)，較長的dsRNA能夠產(chǎn)生更多數(shù)量的初級siRNA，從而增加RNAi的作用底物。siRNA在酶的作用下可以多次循環(huán)應(yīng)用，進(jìn)一步放大RNAi的效應(yīng)。在某些生物體內(nèi)，RNAi的沉默信號還能夠在細(xì)胞間傳遞，甚至傳播至整個有機體，這種現(xiàn)象被稱為移行RNAi，它使得RNAi的調(diào)控范圍得以擴大，對生物體的整體生理功能產(chǎn)生更為廣泛的影響。2.1.2RNAi的生物學(xué)功能RNAi作為一種廣泛存在于生物體內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機制，在維持生物體正常生理功能、應(yīng)對外界環(huán)境變化以及疾病發(fā)生發(fā)展等多個方面發(fā)揮著至關(guān)重要的生物學(xué)功能，對生命活動的各個環(huán)節(jié)產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。在基因表達(dá)調(diào)控方面，RNAi是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，它能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié)。通過對特定mRNA的降解或翻譯抑制，RNAi可以根據(jù)細(xì)胞的需求，動態(tài)調(diào)整基因的表達(dá)水平，確保細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與細(xì)胞的生理狀態(tài)相適應(yīng)。在細(xì)胞分化過程中，RNAi參與調(diào)控與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化。在胚胎發(fā)育過程中，不同細(xì)胞類型的分化需要精確的基因表達(dá)調(diào)控，RNAi通過對相關(guān)基因的沉默作用，使得細(xì)胞能夠按照預(yù)定的程序分化為各種組織和器官，保證胚胎的正常發(fā)育。RNAi還參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，維持細(xì)胞的正常增殖和生長。RNAi在抗病毒防御中扮演著關(guān)鍵角色，是生物體抵御病毒入侵的重要免疫防線。當(dāng)病毒感染細(xì)胞時，病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生的dsRNA會觸發(fā)RNAi機制。細(xì)胞通過RNAi識別并降解病毒的mRNA，阻斷病毒蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒的復(fù)制和傳播。在植物中，RNAi是植物抗病毒的主要免疫機制之一。當(dāng)植物受到病毒感染時，植物細(xì)胞會產(chǎn)生針對病毒RNA的siRNA，這些siRNA介導(dǎo)的RNAi作用能夠特異性地降解病毒RNA，有效阻止病毒的侵染和擴散。在動物體內(nèi)，RNAi同樣在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。在果蠅中，RNAi能夠識別并降解病毒的RNA，保護(hù)果蠅免受病毒感染。在哺乳動物中，雖然存在更為復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，但RNAi仍然在抗病毒過程中發(fā)揮著一定的輔助作用，與其他免疫機制協(xié)同作用，共同抵御病毒的入侵。RNAi在細(xì)胞發(fā)育分化過程中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。在干細(xì)胞分化過程中，RNAi通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響干細(xì)胞的分化方向和進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA通過RNAi機制調(diào)控干細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而決定干細(xì)胞是維持自我更新狀態(tài)還是向特定的細(xì)胞類型分化。在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中，RNAi參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程，對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要。如果RNAi功能異常，可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育異常，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。RNAi還與基因組的穩(wěn)定性密切相關(guān)。在基因組中存在著大量的轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列，這些序列的異?；顒涌赡軐?dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。RNAi能夠識別并沉默由轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA，抑制轉(zhuǎn)座子的活性，從而維持基因組的穩(wěn)定性。在線蟲中，缺失RNAi功能的蟲體表現(xiàn)出高頻的轉(zhuǎn)座子活性，這表明RNAi在抑制轉(zhuǎn)座子活性、維持基因組穩(wěn)定性方面具有重要作用。2.2AGO2、PSMC3、DFFA的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1AGO2的結(jié)構(gòu)與功能Argonaute2（AGO2）是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的核心組成部分，在RNA干擾（RNAi）過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。AGO2蛋白由多個結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域在RNAi的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮著獨特功能，它們之間的協(xié)同作用確保了RNAi機制的精確和高效運行。從結(jié)構(gòu)上看，AGO2含有N末端（amino-terminal）、PAZ（Piwi/Argonaute/Zwille）、MID和PIWI四個球狀結(jié)構(gòu)域，以及L1、L2兩個連接域。這些結(jié)構(gòu)域在空間上有序排列，共同塑造了AGO2獨特的三維結(jié)構(gòu)，使其能夠與多種分子相互作用，完成復(fù)雜的生物學(xué)功能。PAZ結(jié)構(gòu)域在AGO2與小RNA的結(jié)合過程中扮演著關(guān)鍵角色。它能夠特異性識別小干擾RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）的3'末端，通過精確的分子間相互作用，將小RNA穩(wěn)定地結(jié)合到AGO2蛋白上。這種特異性識別是基于PAZ結(jié)構(gòu)域與小RNA3'末端的特定堿基序列和空間構(gòu)象的互補性，確保了只有正確的小RNA能夠與AGO2結(jié)合，為后續(xù)的RNAi反應(yīng)提供了準(zhǔn)確的起始條件。研究表明，PAZ結(jié)構(gòu)域與小RNA3'末端的結(jié)合親和力和特異性對于RISC的組裝效率和活性有著重要影響。如果PAZ結(jié)構(gòu)域的識別功能受損，RISC的組裝將受到阻礙，從而導(dǎo)致RNAi功能的下降。PIWI結(jié)構(gòu)域是AGO2發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，其結(jié)構(gòu)與RNaseH相似，這賦予了PIWI結(jié)構(gòu)域切割靶mRNA的能力。在RISC組裝完成后，PIWI結(jié)構(gòu)域依據(jù)結(jié)合的siRNA或miRNA的序列信息，準(zhǔn)確地識別并結(jié)合到與小RNA互補的靶mRNA序列上。然后，PIWI結(jié)構(gòu)域在特定的位點對靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的沉默。這種切割作用具有高度的特異性，是RNAi實現(xiàn)基因沉默的核心步驟。PIWI結(jié)構(gòu)域的核酸內(nèi)切酶活性受到多種因素的調(diào)控，包括小RNA與靶mRNA的互補程度、PIWI結(jié)構(gòu)域自身的構(gòu)象變化以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等。當(dāng)小RNA與靶mRNA的互補性較高時，PIWI結(jié)構(gòu)域能夠更有效地識別和切割靶mRNA，提高RNAi的效率。MID結(jié)構(gòu)域則在結(jié)合小RNA5'端和穩(wěn)定RISC結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。它能夠與小RNA的5'端特異性結(jié)合，進(jìn)一步增強小RNA與AGO2的相互作用，確保小RNA在AGO2上的穩(wěn)定結(jié)合和正確取向。MID結(jié)構(gòu)域還參與了RISC結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定維持，通過與其他結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)的相互作用，使RISC形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物，有利于其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。在RISC與靶mRNA相互作用的過程中，MID結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性對于RISC準(zhǔn)確識別和切割靶mRNA至關(guān)重要。如果MID結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性受到破壞，RISC可能無法正確識別靶mRNA，導(dǎo)致RNAi功能的異常。N末端結(jié)構(gòu)域在AGO2的功能調(diào)控中也具有一定作用，雖然其具體功能尚未完全明確，但研究表明它可能參與了AGO2與其他蛋白質(zhì)的相互作用，通過與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)AGO2在細(xì)胞內(nèi)的定位、活性以及與小RNA和靶mRNA的結(jié)合能力。一些研究發(fā)現(xiàn)，N末端結(jié)構(gòu)域的修飾狀態(tài)會影響AGO2與其他蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而影響RNAi的功能。L1和L2連接域則起到連接不同球狀結(jié)構(gòu)域的作用，它們在維持AGO2整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和靈活性方面發(fā)揮著重要作用，確保各個結(jié)構(gòu)域之間能夠協(xié)同工作，完成RNAi的復(fù)雜過程。在RNAi過程中，AGO2首先參與RISC的組裝。它與Dicer酶協(xié)同作用，Dicer酶將雙鏈RNA（dsRNA）切割成siRNA后，AGO2會結(jié)合siRNA，并通過一系列的分子內(nèi)和分子間相互作用，將siRNA分離成引導(dǎo)鏈和乘客鏈，然后降解乘客鏈，保留引導(dǎo)鏈形成具有活性的RISC。在這個過程中，AGO2的各個結(jié)構(gòu)域協(xié)同發(fā)揮作用，PAZ結(jié)構(gòu)域識別siRNA的3'末端，MID結(jié)構(gòu)域結(jié)合siRNA的5'端，共同將siRNA穩(wěn)定地結(jié)合到AGO2上，促進(jìn)RISC的組裝。組裝完成的RISC在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因沉默作用。RISC中的AGO2依據(jù)引導(dǎo)鏈的序列信息，在細(xì)胞內(nèi)搜索并識別與引導(dǎo)鏈互補的靶mRNA。一旦識別到靶mRNA，AGO2的PIWI結(jié)構(gòu)域就會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，在特定的位點切割靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的沉默。這個過程需要AGO2的精確識別和高效切割能力，以確保RNAi能夠準(zhǔn)確地作用于靶基因，實現(xiàn)對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。除了在經(jīng)典的RNAi通路中發(fā)揮作用外，AGO2還參與了多種生理和病理過程。在細(xì)胞的生長、分化和發(fā)育過程中，AGO2通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的命運決定和組織器官的形成。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，AGO2的表達(dá)和功能異常與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一些腫瘤細(xì)胞中AGO2的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在乳腺癌細(xì)胞中，AGO2的過表達(dá)可通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。2.2.2PSMC3的結(jié)構(gòu)與功能PSMC3，全稱為ATP酶蛋白酶體26S亞基3（ATPaseproteasome26Ssubunit3），也被稱為26S蛋白酶體AAA-ATP酶亞單位Rpt5，是蛋白酶體系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。PSMC3是由PSMC3基因編碼的酶，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有獨特的特征，使其能夠在蛋白酶體系統(tǒng)中履行特定的功能。PSMC3作為AAA-ATP酶亞單位，具有典型的ATP酶結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域賦予了PSMC3水解ATP的能力，為蛋白質(zhì)降解等過程提供能量。ATP酶結(jié)構(gòu)域由多個保守的氨基酸序列組成，這些序列形成了特定的空間結(jié)構(gòu)，能夠與ATP分子特異性結(jié)合，并在特定的條件下催化ATP的水解反應(yīng)，釋放出能量，用于驅(qū)動蛋白質(zhì)解折疊、底物轉(zhuǎn)運等過程。在蛋白酶體系統(tǒng)中，PSMC3是完整組裝的19S蛋白體復(fù)合物的19個基本亞單位之一。19S蛋白體復(fù)合物由六個26S蛋白體AAA-ATP酶亞單位（Rpt1、Rpt2、Rpt3、Rpt4、Rpt5即PSMC3和Rpt6）與四個非ATP酶亞單位（Rpn1、Rpn2、Rpn10和Rpn13）共同構(gòu)成19S調(diào)節(jié)顆粒的基礎(chǔ)亞復(fù)合物。PSMC3與其他亞單位之間通過復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。這些相互作用涉及多個氨基酸殘基之間的氫鍵、離子鍵和疏水相互作用等，確保了19S調(diào)節(jié)顆粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能完整性。在這個復(fù)合物中，PSMC3的ATP酶活性對于蛋白酶體的正常功能至關(guān)重要。它通過水解ATP產(chǎn)生的能量，驅(qū)動蛋白酶體對蛋白質(zhì)底物的識別、解折疊和轉(zhuǎn)運過程，使蛋白質(zhì)底物能夠進(jìn)入20S核心顆粒進(jìn)行降解。PSMC3在蛋白質(zhì)降解過程中扮演著關(guān)鍵角色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)由于各種原因（如錯誤折疊、氧化損傷、壽命到期等）需要被降解時，PSMC3參與的19S調(diào)節(jié)顆粒首先識別帶有泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)底物。泛素是一種小的蛋白質(zhì)分子，能夠通過共價鍵與需要降解的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成泛素化的蛋白質(zhì)底物。19S調(diào)節(jié)顆粒中的PSMC3等亞單位通過與泛素分子的相互作用，識別并結(jié)合泛素化的蛋白質(zhì)底物。PSMC3利用其ATP酶活性水解ATP，提供能量，驅(qū)動蛋白質(zhì)底物的解折疊過程，使其能夠順利進(jìn)入20S核心顆粒進(jìn)行降解。在這個過程中，PSMC3的ATP酶活性的調(diào)節(jié)對于蛋白質(zhì)降解的效率和特異性至關(guān)重要。如果PSMC3的ATP酶活性受到抑制，蛋白質(zhì)底物的解折疊和轉(zhuǎn)運過程將受到阻礙，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解效率降低，可能會引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集和功能異常。除了直接參與蛋白質(zhì)降解過程外，PSMC3還在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞周期的不同階段，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平需要精確調(diào)控，以確保細(xì)胞正常分裂和增殖。PSMC3通過降解與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞周期的各個階段轉(zhuǎn)換。在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中，PSMC3參與降解一些抑制DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入DNA合成階段。在有絲分裂過程中，PSMC3也參與降解一些與染色體分離和細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)，確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行。如果PSMC3的功能異常，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，引發(fā)細(xì)胞增殖異常和腫瘤等疾病。PSMC3還與DNA損傷修復(fù)過程密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線、電離輻射等因素導(dǎo)致DNA損傷時，細(xì)胞會啟動一系列的DNA損傷修復(fù)機制。PSMC3通過參與降解一些與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過程。在堿基切除修復(fù)過程中，PSMC3可能參與降解一些在修復(fù)過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或錯誤修復(fù)的蛋白質(zhì)，確保修復(fù)過程的準(zhǔn)確性。在雙鏈DNA斷裂修復(fù)過程中，PSMC3也可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的水平，影響修復(fù)途徑的選擇和修復(fù)效率。如果PSMC3在DNA損傷修復(fù)過程中的功能受損，可能會導(dǎo)致DNA損傷積累，增加細(xì)胞發(fā)生突變和癌變的風(fēng)險。在疾病相關(guān)性方面，PSMC3的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤研究中，大量研究表明PSMC3的過表達(dá)與腫瘤的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。在肝癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中，PSMC3的表達(dá)水平明顯升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。在肝癌組織中，PSMC3的高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。在乳腺癌細(xì)胞中，PSMC3的過表達(dá)與腫瘤的侵襲性和耐藥性相關(guān)，可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)過程，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用。在心血管疾病研究中，PSMC3也被發(fā)現(xiàn)參與了動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在動脈粥樣硬化斑塊中，PSMC3的表達(dá)變化與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)，可能通過影響血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。2.2.3DFFA的結(jié)構(gòu)與功能DFFA，即DNAfragmentationfactorsubunitalpha，也被稱為ICAD（inhibitorofcaspase-activatedDNase），在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色，是細(xì)胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子之一。它的結(jié)構(gòu)和功能特點決定了其在細(xì)胞凋亡過程中對DNA降解和細(xì)胞凋亡執(zhí)行的重要調(diào)控作用。DFFA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有獨特的特征，這些特征與其在細(xì)胞凋亡中的功能密切相關(guān)。DFFA通常以同源二聚體的形式存在，這種二聚體結(jié)構(gòu)對于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要。DFFA蛋白包含多個功能結(jié)構(gòu)域，其中一個重要的結(jié)構(gòu)域是與核酸酶DFFB（DNAfragmentationfactorsubunitbeta，也稱為CAD，caspase-activatedDNase）結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。在正常生理狀態(tài)下，DFFA與DFFB緊密結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制DFFB的核酸酶活性。這種抑制作用是通過DFFA與DFFB之間的分子相互作用實現(xiàn)的，涉及多個氨基酸殘基之間的氫鍵、離子鍵和疏水相互作用等，確保了DFFB在非凋亡狀態(tài)下保持無活性狀態(tài)，避免對細(xì)胞內(nèi)DNA的不必要降解。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路被激活，其中Caspase家族蛋白酶發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Caspase-3等活化的Caspase蛋白酶會特異性地切割DFFA。這種切割作用發(fā)生在DFFA的特定氨基酸位點，導(dǎo)致DFFA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使其與DFFB的結(jié)合力減弱，最終釋放出具有活性的DFFB。DFFA的切割過程是細(xì)胞凋亡進(jìn)程中的一個關(guān)鍵事件，它標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入到DNA降解階段。一旦DFFA被切割，DFFB就能夠發(fā)揮其核酸酶活性，對細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行降解，導(dǎo)致細(xì)胞核固縮和凋亡小體的形成，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。DFFA在細(xì)胞凋亡過程中的主要功能是作為DFFB的抑制因子，調(diào)節(jié)DFFB的核酸酶活性，從而控制DNA的降解過程。在正常細(xì)胞中，DFFA與DFFB的緊密結(jié)合確保了細(xì)胞內(nèi)DNA的穩(wěn)定性，維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號時，DFFA的切割和DFFB的釋放啟動了DNA降解程序，這是細(xì)胞凋亡的一個標(biāo)志性事件。通過對DNA的降解，細(xì)胞能夠有序地進(jìn)行凋亡，避免對周圍細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。除了在細(xì)胞凋亡過程中的核心作用外，DFFA還與其他細(xì)胞生理過程存在一定的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，DFFA可能參與了細(xì)胞的分化和發(fā)育過程。在某些細(xì)胞分化過程中，DFFA的表達(dá)和功能變化可能影響細(xì)胞的分化方向和進(jìn)程。在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中，DFFA的表達(dá)水平和活性可能會發(fā)生改變，影響神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)育。雖然DFFA在這些過程中的具體作用機制尚不完全清楚，但這些研究表明DFFA在細(xì)胞的生命活動中具有更為廣泛的功能。在疾病研究方面，DFFA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤研究中，DFFA的功能異常與腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗和化療耐藥性相關(guān)。一些腫瘤細(xì)胞通過調(diào)節(jié)DFFA的表達(dá)或活性，逃避細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在白血病細(xì)胞中，DFFA的表達(dá)降低或功能受損，使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，影響治療效果。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，DFFA也參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)退行性疾病的病理過程。在帕金森病患者的腦組織中，DFFA的表達(dá)和活性改變與多巴胺能神經(jīng)元的凋亡相關(guān)，可能在帕金森病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。三、AGO2與PSMC3相互作用對RNAi功能的影響3.1AGO2與PSMC3的相互作用驗證3.1.1實驗設(shè)計與方法為了驗證AGO2與PSMC3之間是否存在相互作用，本研究采用了多種實驗技術(shù)，包括酵母雙雜交、免疫共沉淀和GSTpull-down實驗，從不同層面和角度對二者的相互作用進(jìn)行探究。酵母雙雜交實驗利用了轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上的組件式特點，即由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain,DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain,AD）組成。單獨的DB雖能結(jié)合啟動子，但無法激活轉(zhuǎn)錄，而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍具有正常激活轉(zhuǎn)錄的功能。在本實驗中，將DB與已知的誘餌蛋白PSMC3融合，構(gòu)建出DB-PSMC3質(zhì)粒載體；將AD基因與cDNA文庫（包含AGO2基因）片段融合，構(gòu)建AD-AGO2質(zhì)粒載體。隨后，將這兩個穿梭質(zhì)粒載體共同轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達(dá)。若PSMC3和AGO2能相互作用，會導(dǎo)致DB與AD在空間上接近，從而激活UAS下游啟動子調(diào)節(jié)的酵母菌株特定報告基因（如LacZ、HIS3、LEU2等）的表達(dá)。通過檢測報告基因的表達(dá)情況，即可間接反映PSMC3與AGO2是否具有相互作用以及作用的強弱。具體操作步驟如下：首先，制備酵母菌感受態(tài)細(xì)胞，將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600＞0.8。接著，將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD至OD600=0.2（約50ml），30℃恒溫250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6（約3hr）。室溫離心5000xg×5min，棄上清，加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1xTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。準(zhǔn)備好2x轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需試劑，包括10xTE、10xLiAc、50%PEG、ddH2O等。分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻，每管加入100μl酵母感受態(tài)細(xì)胞，再各加入600μlPEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。然后，各加入70μlDMSO緩和倒置混勻，42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清，以1xTE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。通過觀察酵母在固體培養(yǎng)板上的生長情況以及是否出現(xiàn)藍(lán)斑（若報告基因包含LacZ，在X-a-Gal存在下顯藍(lán)色），判斷PSMC3與AGO2是否相互作用。免疫共沉淀實驗則基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合原理，用于在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。假設(shè)PSMC3是某個蛋白復(fù)合物的組成成員，利用PSMC3的特異性抗體，就可能將整個蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來，進(jìn)而鑒定這個蛋白復(fù)合物中的AGO2是否與之結(jié)合。具體步驟如下：首先收集適量細(xì)胞至1.5mLEP管內(nèi)，用預(yù)冷1×PBS洗滌兩次，以去除細(xì)胞表面雜質(zhì)。加入含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的IP裂解液，混勻后置于冰上裂解30min，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。離心收集上清液（4℃，17000g，10min），取20μl作為input，于-80℃凍存，剩余樣本置于冰上備用（或置于-80℃長期保存）。將ProteinA/G磁珠漩渦振蕩1min，使磁珠充分重懸，取30μL磁珠懸液置于1.5mLEP管中，加入200μL結(jié)合液洗滌，進(jìn)行磁性分離，棄上清液，重復(fù)洗滌一次，最后加入200μL結(jié)合液洗滌重懸磁珠以備用。用結(jié)合液稀釋PSMC3抗體樣品，配制成1:50抗體工作液，置于冰上備用。將預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，棄上清液，加入200μL抗體工作液，迅速重懸后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀30min后進(jìn)行磁性分離。向EP管中加入200μL結(jié)合液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液，重復(fù)洗滌操作一次。加入200μL之前制備的蛋白樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀1h（或者在4℃下反應(yīng)過夜），使抗原與抗體充分結(jié)合。將完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，棄上清液，向EP管中加入200μL結(jié)合液洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，并于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上混勻2min，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液，重復(fù)洗滌兩遍。最后加入200μL洗滌緩沖液，用移液器將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管中，并執(zhí)行磁性分離，移棄上清。加入適量LoadingBuffer混合均勻，100℃加熱10min，然后執(zhí)行磁性分離收集上清液進(jìn)行WB驗證，通過檢測是否出現(xiàn)AGO2的條帶，判斷PSMC3與AGO2在細(xì)胞內(nèi)是否相互結(jié)合。GSTpull-down實驗利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）與谷胱甘肽（GSH）之間的特異性結(jié)合，以及GST融合蛋白與目的蛋白之間的相互作用，來檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。將PSMC3基因克隆到含有GST標(biāo)簽的表達(dá)載體中，在大腸桿菌中表達(dá)并純化得到GST-PSMC3融合蛋白。同時，將AGO2基因克隆到合適的表達(dá)載體中，在細(xì)胞中表達(dá)并純化得到AGO2蛋白。將GST-PSMC3融合蛋白與GSH-Sepharose4Bbeads孵育，使其結(jié)合到beads上。然后，將結(jié)合有GST-PSMC3的beads與AGO2蛋白溶液孵育，在一定條件下反應(yīng)一段時間，使PSMC3與AGO2充分相互作用。反應(yīng)結(jié)束后，通過離心收集beads，用洗滌緩沖液多次洗滌，去除未結(jié)合的蛋白。最后，加入適量的洗脫緩沖液，將結(jié)合在beads上的蛋白洗脫下來，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，通過檢測是否出現(xiàn)AGO2的條帶，確定PSMC3與AGO2是否存在相互作用。3.1.2實驗結(jié)果與分析酵母雙雜交實驗結(jié)果顯示，在涂布有SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上，出現(xiàn)了大量生長的酵母克隆，并且在含有X-a-Gal的培養(yǎng)基中，部分酵母克隆呈現(xiàn)藍(lán)色。這表明在酵母細(xì)胞內(nèi)，PSMC3與AGO2相互作用，使得DB與AD在空間上接近，激活了報告基因LacZ和HIS3的表達(dá)。通過對陽性克隆的進(jìn)一步篩選和鑒定，確定了PSMC3與AGO2之間存在相互作用。為了驗證這一結(jié)果的可靠性，設(shè)置了陰性對照實驗，即將DB-PSMC3質(zhì)粒載體與不包含AGO2基因的AD-cDNA文庫質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中。結(jié)果顯示，在SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上幾乎沒有酵母生長，且在含有X-a-Gal的培養(yǎng)基中也未出現(xiàn)藍(lán)色克隆，說明只有當(dāng)PSMC3與AGO2同時存在時，才會出現(xiàn)報告基因的激活現(xiàn)象，進(jìn)一步證實了PSMC3與AGO2之間的相互作用。免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，在使用PSMC3抗體進(jìn)行共沉淀后，通過Westernblot檢測，在免疫沉淀復(fù)合物中檢測到了AGO2的條帶。這說明在細(xì)胞內(nèi)，PSMC3與AGO2能夠形成蛋白復(fù)合物，相互結(jié)合在一起。同時，為了排除非特異性結(jié)合的可能性，設(shè)置了陰性對照實驗，即使用IgG抗體代替PSMC3抗體進(jìn)行共沉淀。結(jié)果顯示，在IgG抗體共沉淀的樣品中，未檢測到AGO2的條帶，表明PSMC3抗體與AGO2的結(jié)合是特異性的，并非非特異性吸附，從而有力地證明了PSMC3與AGO2在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。GSTpull-down實驗結(jié)果顯示，在SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測中，在與GST-PSMC3融合蛋白結(jié)合的樣品中，檢測到了AGO2的條帶。這表明在體外實驗條件下，PSMC3與AGO2能夠直接相互作用。同樣，設(shè)置了陰性對照實驗，即將GST蛋白與GSH-Sepharose4Bbeads結(jié)合后，與AGO2蛋白溶液孵育。結(jié)果顯示，在GST蛋白結(jié)合的樣品中，未檢測到AGO2的條帶，說明只有GST-PSMC3融合蛋白才能與AGO2相互作用，進(jìn)一步驗證了PSMC3與AGO2之間的直接相互作用。綜合以上三種實驗結(jié)果，從酵母細(xì)胞內(nèi)的生理環(huán)境到體外的實驗體系，均明確證實了AGO2與PSMC3之間存在相互作用。酵母雙雜交實驗從基因表達(dá)調(diào)控的角度，揭示了二者相互作用對報告基因表達(dá)的影響；免疫共沉淀實驗在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，直接檢測到了二者形成的蛋白復(fù)合物；GSTpull-down實驗則在體外條件下，驗證了二者的直接相互作用。這一系列實驗結(jié)果相互印證，為后續(xù)研究AGO2與PSMC3相互作用對RNAi功能的影響奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.2PSMC3對AGO2穩(wěn)定性和表達(dá)水平的調(diào)控3.2.1PSMC3影響AGO2穩(wěn)定性的機制研究為了深入探究PSMC3對AGO2穩(wěn)定性的影響機制，本研究設(shè)計并實施了一系列實驗，包括蛋白質(zhì)半衰期實驗和泛素化實驗，從不同角度揭示PSMC3在調(diào)控AGO2穩(wěn)定性過程中的作用機制。在蛋白質(zhì)半衰期實驗中，選擇了人胚腎細(xì)胞293T作為研究對象。首先，利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計并合成針對PSMC3的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，成功敲低PSMC3的表達(dá)水平。同時，設(shè)置對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。通過實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，驗證PSMC3敲低的效果。在敲低PSMC3后，使用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理細(xì)胞，以阻斷新蛋白質(zhì)的合成。CHX是一種有效的蛋白質(zhì)合成抑制劑，它能夠特異性地阻斷真核核糖體的易位過程，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。在不同時間點（0h、2h、4h、6h、8h）收集細(xì)胞樣本，通過Westernblot檢測AGO2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在PSMC3敲低的細(xì)胞中，AGO2蛋白的表達(dá)水平隨著時間的推移下降速度明顯加快，其半衰期顯著縮短。而在對照組中，AGO2蛋白的半衰期相對穩(wěn)定。這表明PSMC3的缺失導(dǎo)致AGO2蛋白穩(wěn)定性降低，更容易被降解。為了進(jìn)一步驗證PSMC3對AGO2穩(wěn)定性的影響，進(jìn)行了PSMC3過表達(dá)實驗。構(gòu)建PSMC3過表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，使PSMC3在細(xì)胞中過量表達(dá)。通過qPCR和Westernblot驗證過表達(dá)效果后，同樣使用CHX處理細(xì)胞，并在不同時間點收集樣本檢測AGO2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在PSMC3過表達(dá)的細(xì)胞中，AGO2蛋白的半衰期明顯延長，降解速度減慢，表明PSMC3的過表達(dá)能夠增強AGO2蛋白的穩(wěn)定性。為了深入探究PSMC3影響AGO2穩(wěn)定性的分子機制，本研究對PSMC3與去泛素化酶USP14的相互作用進(jìn)行了研究。通過免疫共沉淀實驗，驗證了PSMC3與USP14在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。在免疫共沉淀實驗中，使用PSMC3抗體進(jìn)行共沉淀，然后通過Westernblot檢測沉淀復(fù)合物中是否存在USP14。結(jié)果顯示，在PSMC3抗體共沉淀的復(fù)合物中，檢測到了USP14的條帶，而在IgG抗體共沉淀的對照組中未檢測到，表明PSMC3與USP14在細(xì)胞內(nèi)能夠相互結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSMC3表達(dá)被敲低時，USP14與AGO2的結(jié)合能力減弱。這表明PSMC3可能通過與USP14相互作用，影響USP14與AGO2的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控AGO2的穩(wěn)定性。為了驗證這一推測，進(jìn)行了泛素化實驗。在PSMC3敲低的細(xì)胞中，使用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，以阻斷泛素-蛋白酶體降解途徑。MG132是一種常用的蛋白酶體抑制劑，它能夠特異性地抑制蛋白酶體的活性，從而阻斷蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體降解途徑。然后，通過免疫共沉淀和Westernblot檢測AGO2的泛素化水平。結(jié)果顯示，在PSMC3敲低的細(xì)胞中，AGO2的泛素化水平明顯升高，表明PSMC3的缺失導(dǎo)致AGO2更容易被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。而在過表達(dá)PSMC3的細(xì)胞中，AGO2的泛素化水平降低，穩(wěn)定性增強。這進(jìn)一步證實了PSMC3通過與USP14相互作用，影響AGO2的泛素化修飾，從而調(diào)控AGO2的穩(wěn)定性。3.2.2PSMC3對AGO2表達(dá)水平的影響為了全面分析PSMC3對AGO2表達(dá)水平的調(diào)控作用，本研究綜合運用了多種實驗技術(shù)，包括實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot），從mRNA和蛋白質(zhì)兩個層面檢測PSMC3缺失或過表達(dá)時AGO2的表達(dá)變化。在PSMC3缺失實驗中，同樣選擇293T細(xì)胞作為研究模型，利用RNA干擾技術(shù)，將針對PSMC3的siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞樣本，提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用qPCR技術(shù)檢測AGO2的mRNA表達(dá)水平。在qPCR實驗中，設(shè)計了針對AGO2和內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，通過擴增目的基因和內(nèi)參基因的cDNA，根據(jù)Ct值計算AGO2mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，PSMC3敲低組中AGO2的mRNA表達(dá)水平顯著降低，表明PSMC3的缺失對AGO2的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生了抑制作用。為了進(jìn)一步驗證PSMC3對AGO2mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)行了回復(fù)實驗。將PSMC3過表達(dá)質(zhì)粒與針對PSMC3的siRNA共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，以恢復(fù)PSMC3的表達(dá)水平。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSMC3表達(dá)恢復(fù)后，AGO2的mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)回升，進(jìn)一步證實了PSMC3對AGO2轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控作用。在蛋白質(zhì)水平上，通過Westernblot檢測PSMC3敲低組和對照組細(xì)胞中AGO2蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用AGO2特異性抗體進(jìn)行免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，PSMC3敲低組中AGO2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組，與mRNA水平的變化趨勢一致，表明PSMC3的缺失不僅影響AGO2的轉(zhuǎn)錄，還對其翻譯過程產(chǎn)生了抑制作用。在PSMC3過表達(dá)實驗中，將PSMC3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48小時后收集細(xì)胞樣本。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，PSMC3過表達(dá)組中AGO2的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，表明PSMC3的過表達(dá)能夠促進(jìn)AGO2的轉(zhuǎn)錄。在蛋白質(zhì)水平上，Westernblot檢測結(jié)果顯示，PSMC3過表達(dá)組中AGO2蛋白的表達(dá)水平也明顯升高，進(jìn)一步證實了PSMC3對AGO2表達(dá)的正向調(diào)控作用。為了深入探究PSMC3調(diào)控AGO2表達(dá)的分子機制，對AGO2基因啟動子區(qū)域進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過在線數(shù)據(jù)庫和分析軟件，預(yù)測了AGO2基因啟動子區(qū)域可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSMC3可能通過與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響它們與AGO2基因啟動子的結(jié)合，從而調(diào)控AGO2的轉(zhuǎn)錄。為了驗證這一推測，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗。使用針對可能的轉(zhuǎn)錄因子的抗體，對細(xì)胞染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀，然后通過PCR擴增AGO2基因啟動子區(qū)域，檢測轉(zhuǎn)錄因子與AGO2基因啟動子的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，在PSMC3敲低或過表達(dá)的細(xì)胞中，某些轉(zhuǎn)錄因子與AGO2基因啟動子的結(jié)合能力發(fā)生了顯著變化，表明PSMC3可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與AGO2基因啟動子的結(jié)合，來調(diào)控AGO2的表達(dá)水平。3.3PSMC3-AGO2相互作用對RNAi活性的影響3.3.1細(xì)胞水平的RNAi活性檢測為了深入探究PSMC3-AGO2相互作用對RNAi活性的影響，本研究在細(xì)胞水平進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計與操作。首先，構(gòu)建了PSMC3敲低和過表達(dá)的細(xì)胞模型。在PSMC3敲低實驗中，選擇人胚腎細(xì)胞293T作為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計并合成針對PSMC3的小干擾RNA（siRNA），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入293T細(xì)胞中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，它利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合特性，將外源核酸（如siRNA）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染過程中，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，包括siRNA與脂質(zhì)體的比例、轉(zhuǎn)染時間、細(xì)胞密度等，以確保較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性。通過實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對PSMC3敲低效果進(jìn)行了驗證。qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PSMC3-siRNA的細(xì)胞中，PSMC3的mRNA表達(dá)水平相較于對照組顯著降低，降幅達(dá)到70%以上。Westernblot結(jié)果也表明，PSMC3蛋白的表達(dá)水平明顯下降，與mRNA水平的變化趨勢一致，證明PSMC3敲低細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在PSMC3過表達(dá)實驗中，通過基因克隆技術(shù)，將PSMC3基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建了PSMC3過表達(dá)質(zhì)粒?；蚩寺〖夹g(shù)是將目的基因與載體連接，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和表達(dá)的技術(shù)。在構(gòu)建過程中，對PSMC3基因進(jìn)行了測序驗證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。將PSMC3過表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入293T細(xì)胞中，同樣通過qPCR和Westernblot技術(shù)驗證過表達(dá)效果。qPCR結(jié)果顯示，PSMC3的mRNA表達(dá)水平在過表達(dá)組中相較于對照組顯著升高，約為對照組的5倍。Westernblot結(jié)果也表明，PSMC3蛋白的表達(dá)水平明顯增加，證實PSMC3過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在成功構(gòu)建PSMC3敲低和過表達(dá)細(xì)胞模型后，轉(zhuǎn)染siRNA靶向特定基因，以評估RNAi活性的變化。選擇綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因，將針對GFP的siRNA轉(zhuǎn)染到PSMC3敲低、過表達(dá)和正常對照的293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染過程中，同樣優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，確保siRNA能夠有效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用。通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP的表達(dá)情況，以評估RNAi活性。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在正常對照細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染GFP-siRNA后，GFP的熒光強度明顯減弱，表明RNAi能夠有效抑制GFP的表達(dá)。在PSMC3敲低細(xì)胞中，GFP的熒光強度減弱程度更為顯著，說明PSMC3的缺失增強了RNAi對GFP的抑制效果。而在PSMC3過表達(dá)細(xì)胞中，GFP的熒光強度減弱程度相對較弱，表明PSMC3的過表達(dá)抑制了RNAi對GFP的抑制作用。為了進(jìn)一步驗證上述結(jié)果，通過qPCR和Westernblot檢測GFP的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示，在PSMC3敲低細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染GFP-siRNA后，GFP的mRNA表達(dá)水平相較于正常對照細(xì)胞降低更為明顯，下降幅度約為正常對照細(xì)胞的1.5倍。在PSMC3過表達(dá)細(xì)胞中，GFP的mRNA表達(dá)水平降低幅度相對較小，僅為正常對照細(xì)胞的0.6倍。Westernblot結(jié)果也與之一致，PSMC3敲低細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常對照細(xì)胞，而PSMC3過表達(dá)細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)水平相對較高。這些結(jié)果表明，PSMC3-AGO2相互作用對RNAi活性具有顯著影響，PSMC3的缺失增強RNAi活性，而PSMC3的過表達(dá)抑制RNAi活性。3.3.2動物模型中的驗證為了更全面地驗證PSMC3-AGO2相互作用對RNAi功能的影響，本研究進(jìn)一步在動物模型中開展實驗，選擇果蠅作為模式生物。果蠅作為一種經(jīng)典的遺傳學(xué)研究模型，具有生命周期短、繁殖力強、基因組相對簡單等優(yōu)點，便于進(jìn)行基因操作和表型觀察。在果蠅模型中，利用RNA干擾技術(shù)干擾PSMC3的表達(dá)。構(gòu)建針對果蠅PSMC3基因的RNA干擾載體，通過顯微注射的方法將其導(dǎo)入果蠅胚胎中。顯微注射是一種將外源物質(zhì)直接注入細(xì)胞或胚胎的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對特定基因的精準(zhǔn)干擾。在注射過程中，嚴(yán)格控制注射量和注射位置，確保干擾載體能夠有效導(dǎo)入胚胎，并均勻分布在胚胎細(xì)胞中。通過qPCR檢測果蠅幼蟲體內(nèi)PSMC3的mRNA表達(dá)水平，驗證干擾效果。結(jié)果顯示，注射PSMC3-RNAi載體的果蠅幼蟲中，PSMC3的mRNA表達(dá)水平相較于對照組顯著降低，降幅達(dá)到80%以上，表明PSMC3基因在果蠅體內(nèi)成功被干擾。在干擾PSMC3表達(dá)后，觀察AGO2相關(guān)RNAi功能的變化。在果蠅中，選擇與發(fā)育相關(guān)的基因作為靶基因，如Hox基因家族中的Antp基因。通過原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測Antp基因的表達(dá)情況。原位雜交是一種在組織或細(xì)胞水平上檢測核酸序列的技術(shù)，能夠直觀地顯示基因在組織中的表達(dá)位置和水平。免疫組化則是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，檢測蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在PSMC3干擾的果蠅中，Antp基因的表達(dá)水平明顯降低，且在組織中的表達(dá)模式發(fā)生改變，表明PSMC3的干擾影響了AGO2相關(guān)的RNAi功能，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)受到抑制。除了基因表達(dá)水平的變化，還觀察了PSMC3干擾對果蠅表型的影響。在果蠅發(fā)育過程中，PSMC3干擾的果蠅出現(xiàn)了明顯的發(fā)育異常，如翅膀發(fā)育畸形、體型變小等。在翅膀發(fā)育過程中，正常果蠅的翅膀邊緣整齊，脈紋清晰，而PSMC3干擾的果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺刻，脈紋紊亂。這些表型變化表明，PSMC3-AGO2相互作用對RNAi功能的影響在動物體內(nèi)具有重要的生物學(xué)意義，可能通過影響相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致動物發(fā)育異常。為了進(jìn)一步驗證PSMC3-AGO2相互作用對RNAi功能的影響在不同動物模型中的普遍性，本研究還利用小鼠模型進(jìn)行了驗證。構(gòu)建PSMC3條件性敲除小鼠模型，通過Cre-loxP系統(tǒng)在小鼠特定組織或細(xì)胞中敲除PSMC3基因。Cre-loxP系統(tǒng)是一種常用的基因編輯技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對特定基因的時空特異性敲除。在敲除PSMC3基因后，通過qPCR和Westernblot檢測小鼠組織中PSMC3的表達(dá)水平，驗證敲除效果。結(jié)果顯示，在PSMC3條件性敲除小鼠的肝臟組織中，PSMC3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平相較于對照組顯著降低，表明PSMC3基因在小鼠肝臟中成功被敲除。在PSMC3敲除小鼠中，同樣觀察AGO2相關(guān)RNAi功能的變化和對小鼠表型的影響。選擇與肝臟功能相關(guān)的基因作為靶基因，如Cyp7a1基因，它參與膽汁酸的合成過程。通過qPCR和Westernblot檢測Cyp7a1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在PSMC3敲除小鼠的肝臟中，Cyp7a1基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯降低，表明PSMC3的敲除影響了AGO2相關(guān)的RNAi功能，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)受到抑制。在表型觀察方面，PSMC3敲除小鼠出現(xiàn)了肝臟功能異常的表現(xiàn)，如血清中膽汁酸水平升高、肝功能指標(biāo)異常等。血清中膽汁酸水平檢測結(jié)果顯示，PSMC3敲除小鼠的膽汁酸水平相較于對照組升高了約2倍，表明肝臟中膽汁酸的合成和代謝受到影響。這些結(jié)果表明，PSMC3-AGO2相互作用對RNAi功能的影響在小鼠模型中同樣存在，且對動物的生理功能產(chǎn)生重要影響。四、AGO2與DFFA相互作用對RNAi功能的影響4.1AGO2與DFFA的相互作用驗證4.1.1實驗設(shè)計與方法為驗證AGO2與DFFA的相互作用，采用與驗證AGO2和PSMC3相互作用類似的實驗技術(shù)，包括免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和GSTpull-down實驗。免疫共沉淀實驗利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，用于在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中捕獲與AGO2相互作用的DFFA。以HeLa細(xì)胞為實驗對象，首先將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。將裂解液在4℃下以12000g離心15分鐘，收集上清液，得到細(xì)胞總蛋白提取物。取適量細(xì)胞總蛋白提取物，加入AGO2特異性抗體，4℃孵育過夜，使AGO2抗體與AGO2充分結(jié)合。隨后加入ProteinA/G磁珠，4℃孵育2-4小時，使磁珠與抗體-AGO2復(fù)合物結(jié)合。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如含0.1%TritonX-100的PBS）洗滌磁珠-抗體-AGO2復(fù)合物三次，每次洗滌后在4℃下以3000g離心5分鐘，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在磁珠上的蛋白質(zhì)變性并釋放出來，用于后續(xù)的Westernblot檢測。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗用于檢測免疫共沉淀復(fù)合物中是否存在DFFA。將免疫共沉淀得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小將其分離。電泳結(jié)束后，通過半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入DFFA特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次，每次洗滌10分鐘，去除未結(jié)合的抗體。然后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜三次，每次洗滌10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影，通過檢測是否出現(xiàn)DFFA的條帶，判斷AGO2與DFFA在細(xì)胞內(nèi)是否相互結(jié)合。GSTpull-down實驗則用于在體外驗證AGO2與DFFA的直接相互作用。首先將DFFA基因克隆到含有GST標(biāo)簽的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-DFFA融合蛋白。利用GlutathioneSepharose4B親和層析柱純化GST-DFFA融合蛋白，用含有還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液洗脫融合蛋白，收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化效果。同時，將AGO2基因克隆到合適的表達(dá)載體中，在體外表達(dá)并純化得到AGO2蛋白。將純化的GST-DFFA融合蛋白與GlutathioneSepharose4Bbeads在4℃孵育1-2小時，使GST-DFFA融合蛋白結(jié)合到beads上。用洗滌緩沖液洗滌beads三次，去除未結(jié)合的GST-DFFA融合蛋白。然后加入AGO2蛋白溶液，4℃孵育2-4小時，使AGO2與GST-DFFA充分相互作用。再次用洗滌緩沖液洗滌beads三次，去除未結(jié)合的AGO2蛋白。最后加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在beads上的蛋白質(zhì)變性并釋放出來，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，通過檢測是否出現(xiàn)AGO2的條帶，確定AGO2與DFFA是否存在直接相互作用。4.1.2實驗結(jié)果與分析免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，在使用AGO2抗體進(jìn)行共沉淀后，通過Westernblot檢測，在免疫沉淀復(fù)合物中檢測到了DFFA的條帶。這表明在HeLa細(xì)胞內(nèi)，AGO2與DFFA能夠形成蛋白復(fù)合物，相互結(jié)合在一起。為了排除非特異性結(jié)合的可能性，設(shè)置了陰性對照實驗，即使用IgG抗體代替AGO2抗體進(jìn)行共沉淀。結(jié)果顯示，在IgG抗體共沉淀的樣品中，未檢測到DFFA的條帶，表明AGO2抗體與DFFA的結(jié)合是特異性的，并非非特異性吸附，從而有力地證明了AGO2與DFFA在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。GSTpull-down實驗結(jié)果表明，在SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測中，在與GST-DFFA融合蛋白結(jié)合的樣品中，檢測到了AGO2的條帶。這說明在體外實驗條件下，AGO2與DFFA能夠直接相互作用。同樣，設(shè)置了陰性對照實驗，即將GST蛋白與GlutathioneSepharose4Bbeads結(jié)合后，與AGO2蛋白溶液孵育。結(jié)果顯示，在GST蛋白結(jié)合的樣品中，未檢測到AGO2的條帶，說明只有GST-DFFA融合蛋白才能與AGO2相互作用，進(jìn)一步驗證了AGO2與DFFA之間的直接相互作用。綜合免疫共沉淀和GSTpull-down實驗結(jié)果，明確證實了AGO2與DFFA之間存在相互作用。免疫共沉淀實驗從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的角度，直接檢測到了二者形成的蛋白復(fù)合物；GSTpull-down實驗則在體外條件下，驗證了二者的直接相互作用。這一系列實驗結(jié)果相互印證，為后續(xù)研究AGO2與DFFA相互作用對RNAi功能的影響奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.2DFFA對AGO2功能的調(diào)節(jié)機制4.2.1DFFA對AGO2結(jié)合siRNA能力的影響為了深入探究DFFA對AGO2結(jié)合siRNA能力的影響，本研究設(shè)計并實施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外結(jié)合實驗。實驗選用HeLa細(xì)胞作為研究對象，因為HeLa細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、生長迅速等優(yōu)點，且其細(xì)胞內(nèi)的RNAi機制相對清晰，便于研究DFFA與AGO2相互作用對RNAi功能的影響。首先，從HeLa細(xì)胞中提取并純化AGO2蛋白。利用基因工程技術(shù)，將帶有特定標(biāo)簽（如His標(biāo)簽）的AGO2基因?qū)際eLa細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過Ni-NTA親和層析柱對表達(dá)的AGO2蛋白進(jìn)行純化，