黑花生衣原花色素低聚體的分離純化及特性分析1前言1.1原花色素簡(jiǎn)介原花色素（Proanthocyanidins，簡(jiǎn)稱PC）是自然界中的一類多酚物質(zhì)，廣泛存在于花生、山楂、葡萄、高粱、野草莓、銀杏、扁桃等植物中。主要由兒茶素和表兒茶素的單體聚合而成，包括二聚體到十聚體，其中二聚體到五聚體稱為原花色素的低聚體[]。原花色素的低聚體具有強(qiáng)的抗氧化性，能清除自由基進(jìn)而延緩衰老。1.2原花色素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)原花色素在酸性條件下加熱可以生成花色素，故此被稱原花色素。原花色素為黃烷-3-醇類化合物，主要由表兒茶素、兒茶素或沒(méi)食子酸單體經(jīng)C4—C8或者C4—C6鍵縮合而成，結(jié)構(gòu)式如圖1.1。其中二～四聚體通常被稱為原花色素低聚體，五聚體及其以上稱為原花色素高聚體?；窘Y(jié)構(gòu)單元為黃烷-3、4-二醇，原花色素的二聚體結(jié)構(gòu)式如下圖1.2所示[]：由于原花色素分子中有大量自由酚羥基，所以極性較大，由相思相溶原理可知，其能溶于如甲醇、乙醇等極性溶劑，但不能溶于如氯仿等非極性溶劑。其在水中溶解度隨結(jié)構(gòu)式中羥基數(shù)量的再增多而增大，當(dāng)甲基取代羥基中的氫之后，原花色素在有機(jī)溶劑中的溶解度增大。原花色素有一定的耐熱性，如葡萄籽原花色素低聚體在溫度不高于60℃時(shí)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不會(huì)發(fā)生改變，除此之外，原花色素還有光穩(wěn)定性[]；有機(jī)化學(xué)可知，羥基也以進(jìn)行醚化和?；然瘜W(xué)反應(yīng)，原花色素中的酚羥基也可以發(fā)生這些反應(yīng)，具有很好的使用意義[]；原花色素還能與一些物質(zhì)發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，例如蛋白質(zhì)、多糖等[]。1.3原花色素的生物學(xué)活性原花色素作為新型天然氧化劑，具有多種生物活性。1.3.1原花色素的抗氧化活性人體在進(jìn)行有氧呼吸時(shí)會(huì)產(chǎn)生自由基，而自由基可以引起人體內(nèi)脂質(zhì)的發(fā)生一系列的過(guò)氧化反應(yīng)，這些反應(yīng)會(huì)傷害到細(xì)胞[]。原花色素分子中有能和自由基反應(yīng)的活性酚羥基，因此其有清除人體內(nèi)的自由基的功能特性，進(jìn)而能夠防治人體內(nèi)由自由基過(guò)多而引起的細(xì)胞損傷和其他種疾病。王繼鋒、樊金玲等人從不同植物提取的原花色素，通過(guò)做相關(guān)的抗氧化性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了原花色素的抗氧化能力一些常見(jiàn)的抗氧化劑要好，如維生素C等。張丁等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)，探究出小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶活性會(huì)受到原花色素的影響，從而說(shuō)明了原花色素具有延緩衰老和抗氧化的作用。1.3.2原花色素對(duì)心血管的作用近幾年，越來(lái)越多人的關(guān)注和研究原花色素是否能預(yù)防心血管疾病。梁英所做通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明原花色素具有調(diào)節(jié)血脂稠密度、使血管的抗壓能力增強(qiáng)、改變毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)并使其滲透性降低、抗動(dòng)脈粥樣化及血小板凝集、調(diào)節(jié)血壓等作用。Kim等人先提取了山楂中的原花色素，然后將大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其結(jié)果表明原花色素可以舒張血管。Vinson等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原花色素可以降低低密度脂蛋白（LDL）和膽固醇的水平，由于LDL和膽固醇影響血栓等形成，所以表明原花色素對(duì)血栓形成有抑制作用。1.3.3原花色素調(diào)節(jié)免疫活性凌智群等人的研究證明原花色素可以增強(qiáng)小鼠的B、T淋巴細(xì)胞的功能和骨髓造血干細(xì)胞的增殖。1.4原花色素的應(yīng)用原花色素還具有保護(hù)血管、抗輻射、改善視覺(jué)疲勞、抗癌、收斂保濕、增白美容等效果。原花色素的無(wú)毒、無(wú)過(guò)敏等特性使其作為新型的天然抗氧化劑被廣泛運(yùn)用。近十年以來(lái)，在北美原花色素以及被廣泛用到功能性食品和化妝品中。1.5原花色素的制備原花色素廣泛存在于自然界的各種植物中，因此可以用植物作為原料，使用醇或酮溶劑浸提植物材料，然后離心分離除去水不溶雜質(zhì)，再濃縮得到原花色素濃縮液。利用大孔樹(shù)脂的吸附特性將濃縮液分離純化，收集得到原花色素精制液，將原花色素精致液冷凍結(jié)冰，使用真空冷凍干燥機(jī)使冰升華得到原花色素。1.6本論文主要研究?jī)?nèi)容本論文中主要以混合菌種發(fā)酵法降解黑花生衣中的原花色素作為研究對(duì)象，在優(yōu)化超聲波輔助提取工藝的基礎(chǔ)上，采用膜分離、柱純化等生化分離純化手段制備出高純度的原花色素低聚體產(chǎn)品，并對(duì)分離純化后的原花色素低聚體的相關(guān)功能性質(zhì)進(jìn)行研究。具體的研究?jī)?nèi)容包括：（1）在采用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵黑花生衣的基礎(chǔ)上，優(yōu)化醇提工藝，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定超聲波輔助醇提時(shí)提取液中的乙醇濃度、乙醇溶液用量、醇提的溫度及提取時(shí)間；（2）把原花色素純度作為實(shí)驗(yàn)考察目的，以D101型大孔樹(shù)脂作為填料，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化柱分離純化的工藝條件，確定柱分離時(shí)的上樣體積、所用洗脫液種類、洗脫液的濃度以及洗脫液的流速等工藝參數(shù)；（3）原花色素低聚體產(chǎn)品的相關(guān)性能分析：實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）法對(duì)分離純化后的低聚原花色素的組成進(jìn)行成分分析，以確定產(chǎn)品的純度與得率，并探究不同因素（光照、PH值、溫度、金屬離子、還原劑、氧化劑、食品甜味劑、防腐苯甲酸鈉）對(duì)其穩(wěn)定性的影響以及檢測(cè)其抗氧化活性（清除自由基、還原性、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化）的能力。1.7立題依據(jù)和研究意義原花色素作為一種新型的天然抗氧化劑，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用到醫(yī)藥、化妝品和功能性食品中?，F(xiàn)有的研究中大部分是對(duì)葡萄籽和紅花生衣中的原花色素進(jìn)行提取和性質(zhì)探究，并且提取的方法也多是微波輔助提取，少有人對(duì)黑花生衣中的原花色素進(jìn)行提取研究。而杜蕾、李新華的實(shí)驗(yàn)探究得出黑花生衣中原花色素的含量達(dá)到29.19%,并且運(yùn)用質(zhì)譜信息初步鑒定出黑花生衣中原花色素的二聚體有3種及三聚體有4種。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用混合菌種發(fā)酵降解黑花生衣的原花色素，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化微波輔助醇提條件及柱分離純化條件，并進(jìn)一步探究其相關(guān)功能性質(zhì)。2材料與方法2.1試劑與儀器2.1.1主要試劑LB合成培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、YPD合成培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、香草醛、濃鹽酸、甲醇、乙醇、NaOH、FeCl3、FeSO4、NaCl、CuCl2、CaCl2、ZnCl2、AlCl3、MgCl2、Na2SO3、過(guò)氧化氫（H2O2）、葡萄糖、維生素C、苯甲酸鈉、水楊酸、硝酸、Fe2+-EDTA、乙醚、三氯乙酸、鎢酸鈉、鄰苯三酚、Tris-HCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）、亞油酸、硫代巴比妥酸、亞硝酸鈉。沒(méi)食子酸、原花青素B1、(+)-兒茶素、原花青素B2、(?)-表兒茶素、(?)-表兒茶素3-O-沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品。乙腈、甲醇，均為色譜純。2.1.2主要儀器JJ500型電子天平常熟市雙杰測(cè)試儀器廠水浴恒溫雙功能振蕩器金壇市杰瑞爾電器有限公司HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司L-550型臺(tái)式低速離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司氣流式超微粉碎機(jī)溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司99-1A型大功率磁力攪拌器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司微波催化合成/萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司W(wǎng)D-9412A型恒溫循環(huán)器北京市六一儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠恒溫恒濕箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司真空冷凍干燥機(jī)金西盟（北京）儀器有限公司2.2菌株及其培養(yǎng)條件2.2.1菌種活化取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有斜面保存的枯草芽孢桿菌和釀酒酵母，用接菌環(huán)挑取菌落分別劃線接種到LB固體培養(yǎng)基和YPD固體培養(yǎng)基上，然后分別放在35℃和30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落傳代培養(yǎng)兩到三代。待菌種活化后，將菌種配成甘油含量40%的菌液，保存到-80℃的液氮中。枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)：取出甘油保藏法保存的枯草芽孢桿菌菌種，置于室溫下自然解凍，以體積比1：100的接菌量接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為180r·min-1的搖床中培養(yǎng)12h。釀酒酵母：取出甘油保藏法保存的釀酒酵母菌種，置于室溫中自然解凍，以體積比1：100的接菌量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為160r·min-1的搖床中培養(yǎng)16h。2.2.2混合菌種發(fā)酵培養(yǎng)分別取枯草芽孢桿菌菌液和釀酒酵母菌液為0.8ml和1.4ml加入到滅菌的2ml離心管中，置于4度離心機(jī)中5000r·min-1離心10分鐘，倒去培養(yǎng)基，用無(wú)菌水將菌體細(xì)胞洗到預(yù)先滅菌的100ml錐形瓶中，而后加水至總加水量為20ml。然后取700mg黑花生衣（相當(dāng)于枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的接菌量按體積比分別為4%和7%）加入到錐形瓶中，將其置于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為180r·min-1的搖床中混菌發(fā)酵24h。2.3原花色素含量的檢測(cè)取樣液1.0mL加入到試管中，接著加入4%香草醛甲醇溶液(準(zhǔn)確稱取4.0g香草醛試劑，用甲醇定容到100ml)3.0mL混合，然后加入濃鹽酸1,5ml，混勻后在室溫下靜止顯色15min左右，最后在500nm處測(cè)定其吸光值。另取一個(gè)干凈的試管，加入1ml80%乙醇溶液，其他試劑加量相同，做空白對(duì)照，注意避光保存。原花色素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和原花色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取原花色素的標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于試管中，用一定量的80%乙醇充分溶解，然后轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中進(jìn)行定容，接種用此溶液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/ml的原花色素的標(biāo)準(zhǔn)液。采用上述香草醛-乙酸法測(cè)其在500nm出的吸光值，得到圖2.1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2.1原花色素標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4微波輔助提取原花色素的單因素試驗(yàn)2.4.1乙醇濃度的影響在發(fā)酵液中依次添加乙醇濃度為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液20mL，在溫度為55℃時(shí)超聲波輔助提取5min。然后將用離心機(jī)5000r·min-1離心浸提液10分鐘，離心后取上清液稀釋10倍，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處OD值，重復(fù)三次試驗(yàn)取其平均值。2.4.2提取液用量的影響在已確定乙醇濃度的情況下，分別向發(fā)酵液中加入5ml、10ml、15ml，20ml、25ml乙醇溶液，在溫度為55℃時(shí)超聲波輔助提取1min。然后將用離心機(jī)5000r·min-1離心浸提液10分鐘，離心后取上清液稀釋10倍，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處OD值，重復(fù)三次試驗(yàn)取其平均值。2.4.3溫度的影響在已確定乙醇濃度、乙醇溶液用量的情況下，將裝有發(fā)酵液的錐形瓶放在超聲波儀器中，依次調(diào)整溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，開(kāi)啟儀器超聲波輔助萃取5min然后將用離心機(jī)5000r·min-1離心浸提液10分鐘，離心后取上清液稀釋10倍，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處OD值，重復(fù)三次試驗(yàn)取其平均值。2.4.3提取的影響在已確定乙醇濃度、乙醇溶液用量、提取溫度的情況下，將加入乙醇的發(fā)酵液置于上述確定的溫度下分別微波輔助提取0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min。然后將用離心機(jī)5000r·min-1離心浸提液10分鐘，離心后取上清液稀釋10倍，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處OD值，重復(fù)三次試驗(yàn)取其平均值。2.5原花色素的分離純化2.5.1D-101型大孔樹(shù)脂的前處理取新開(kāi)封樹(shù)脂加蒸餾水浸泡24h，然后用蒸餾水漂洗至在澄清，除水后加2~3倍體積量的2mol/LHcl溶液用磁力攪拌器攪拌2h，除酸后用蒸餾水水洗至中性，接著除水后加4~5倍量2mol/LNaOH溶液用磁力攪拌器攪拌2h，除堿液后用蒸餾水水洗到中性。2.5.2靜態(tài)吸附與靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)取6個(gè)錐形瓶，分別向每個(gè)錐形瓶加入1g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂，然后分別依次加入10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60mL提取上清液，置于轉(zhuǎn)速為150r·min-1的-搖床中在室溫下振蕩1h，靜止沉淀后取其上清液，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處吸光度值，通過(guò)計(jì)算得到原花色素的靜態(tài)吸附率。然后過(guò)濾得到樹(shù)脂，分別依次加入50mL濃度為60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，置于轉(zhuǎn)速為150r·min-1的搖床中在室溫下振蕩1h以解吸吸附樹(shù)脂，通過(guò)計(jì)算得靜態(tài)解吸率，根據(jù)計(jì)算結(jié)果得出最佳的洗脫液濃度。D-101型大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率與靜態(tài)解吸率的計(jì)算公式如下：-2.5.3動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)2.5.3.1動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制取10gD-101型大孔吸附樹(shù)脂，經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行裝柱，然后將提取上清液以1mL/min的流速過(guò)柱，等時(shí)間間隔收集流出液，每一分鐘收集一次，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出原花色素的濃度。根據(jù)計(jì)算結(jié)果繪制出動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。2.5.3.2動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)以解吸率作為指標(biāo)，考察洗脫液的濃度和流速對(duì)洗脫效果的影響，動(dòng)態(tài)解吸率的計(jì)算方法如下：當(dāng)乙醇的濃度分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%時(shí)，洗脫液固定以1.5mL/min的流速過(guò)柱，等時(shí)間間隔收集流出液，每一分鐘收集一次，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，在500nm測(cè)得的其吸光度值可表示為解析液中原花色素相對(duì)濃度。對(duì)比所得結(jié)果，確定動(dòng)態(tài)解析乙醇的最佳濃度。在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，探究改變洗脫液以不同的流速過(guò)柱（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml/min），等時(shí)間間隔收集流出液，每一分鐘收集一次，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，計(jì)算得出其中的（低聚）原花色素的濃度。對(duì)比結(jié)果得出動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)解析液的最佳過(guò)柱流速。2.5.3.3黑花生衣（低聚）原花色素的制取在最佳洗脫液濃度和流速下收集的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃時(shí)濃縮到體積為原來(lái)的1/3至1/5，將濃縮液置于-20℃冷凍結(jié)冰，然后使用真空冷凍干燥機(jī)制得黑花生衣的（低聚）原花色素。2.6黑花生衣（低聚）原花色素的組成分析分別以沒(méi)食子酸、原花青素B1、(+)-兒茶素、原花青素B2、(?)-表兒茶素、(?)-表兒茶素3-O-沒(méi)食子酸酯為標(biāo)樣，采用高效液相色譜法（HPLC）法定性定量分析黑花生衣中原花色素低聚體的組成成分。高效液相色譜法（HPLC）的檢測(cè)條件為：溶液A：色譜純乙腈，過(guò)0.45um微孔濾膜；溶液B：0.3%磷酸（精密移取3mL磷酸于1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻），過(guò)0.45um微孔濾膜，即得；流動(dòng)相：溶液A-溶液B（1：9V/V）；加樣量：10ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm;流速：0.7mL/min;溫度：30℃。2.7黑花生衣（低聚）原花色素的性質(zhì)測(cè)定2.7.1黑花生衣（低聚）原花色素溶液的配制稱取分離純化制取的黑花生衣（低聚）原花色素500mg溶于1L的60%乙醇溶液中，得到（低聚）原花色素溶液，避光保存。2.7.2穩(wěn)定性的檢測(cè)2.7.2.1光照對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取3支透光性良好的試管，分別向其中加入20ml配置好的（低聚）原花色素溶液，然后將3支試管分別置于暗室（避光）、室內(nèi)（避免陽(yáng)光直射）、室內(nèi)燈光中，經(jīng)過(guò)24h、72h后，取出分別用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，，之后每3d測(cè)定一次，直到第15d，每個(gè)樣品設(shè)定3組平行實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。2.7.2.2pH對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取12支試管，向每支試管中加入4ml配制好的（低聚）原花色素溶液，在室溫下分別用0.1mol/L檸檬酸溶液和0.1mol/LNaOH熱液調(diào)節(jié)溶液的pH，配制成pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的12組試液，然后將所有試管于30℃恒溫水浴鍋中靜置2h，取出后采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。2.7.2.3溫度對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取7支干凈的試管，分別向每支試管中加入配制好的（低聚）原花色素溶液13ml，然后將試管用塞子塞好，將7支試管分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴鍋中保溫處理2h，，取出后采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。2.7.2.4金屬離子對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取32支試管做好標(biāo)記，分別向每支試管中加入配制好的（低聚）原花色素溶液4ml，然后將配制好的1.0mol/LFeCl3、FeSO4、NaCl、CuCl2、CaCl2、ZnCl2、AlCl3、MgCl2等八種金屬離子鹽溶液的母液，按照終離子濃度為0.1、1.0、5.0和10.0mmol/L分別加入到黑花生衣（低聚）原花色素溶液中，置于恒溫水浴鍋中30℃水浴2h，取出后采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。2.7.2.5還原劑對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取5支試管，分別向每支試管加入（低聚）原花色素溶液15ml，提前配置出濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L的Na2SO3溶液，分別取3ml不同濃度的Na2SO3溶液依次加入到5支試管中，置于黑暗無(wú)光的地方密封保存，每隔6h取出，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。單獨(dú)取原花色素溶液不加Na2SO3溶液，其他條件相同，作為空白對(duì)照。2.7.2.6氧化劑對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取5支試管，分別向每支試管加入15ml（低聚）原花色素溶液，提前配置好濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的H2O2溶液，分別向5支試管中加入配置好的不同濃度的H2O2溶液3ml，放在黑暗無(wú)光的地方密封保存，每隔6h取出，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。單獨(dú)取原花色素溶液不加H2O2溶液，其他條件相同，作為空白對(duì)照。2.7.2.7食品甜味劑對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取10支試管，分別向每支試管加入15ml（低聚）原花色素溶液，提前分別配好濃度為5%、10%、15%、20%、25%的葡萄糖與維生素C溶液，分別向每支試管中加入3ml不同濃度的試劑液，放在黑暗無(wú)光的地方密封保存，每隔6h取出，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。單獨(dú)取原花色素溶液不加試劑溶液，其他條件相同，作為空白對(duì)照。2.7.2.8防腐劑苯甲酸鈉對(duì)黑花生（低聚）原花色素穩(wěn)定性的影響取4支試管，分別向每支試管加入15ml（低聚）原花色素溶液，提前配好苯甲酸溶液，濃度分別為0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L，分別向每支試管中加入3ml，室溫放在黑暗無(wú)光處密封保存，每隔6h取出，采用香草醛-乙酸法測(cè)其500nm處的吸光度值，，每次每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。單獨(dú)取原花色素溶液不加試劑溶液，其他條件相同，作為空白對(duì)照。2.7.3抗氧化活性的檢測(cè)2.7.3.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定用少量的無(wú)水乙醇將DPPH配制成濃度為5mmol/L的溶液。取2mL5mmol/L的DPPH溶液和2mL95%的乙醇溶液置于試管中，混勻后室溫靜置20min，于517nm處測(cè)定其吸光值，記為A0。取2mL5mmol/L的DPPH溶液和2mL黑花生衣（低聚）原花色素溶液，混勻后室溫靜置20min，于517nm處測(cè)定其吸光值，記為As。取2mL95%的乙醇和2mL黑花生衣（低聚）原花色素溶液，混勻后室溫靜置20min，于517nm處測(cè)定其吸光值，記為Ar。按如下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-(As-Ar)/A0]，結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。2.7.3.2羥自由基（OH·）清除能力的測(cè)定取5支試管，分別向每支試管中加入2ml濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml的（低聚）原花色素溶液，接著依次向每支試管中加入2ml濃度為6mmol/L的FeSO4溶液及2ml濃度為6mmol/L的H2O2溶液，混勻后室溫靜置10min，再加入2ml濃度為6mmol/L的水楊酸溶液，混勻，室溫靜置30min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)量其吸光度值為Ai；用蒸餾水代替水楊酸測(cè)得吸光度值為Aj；空白對(duì)照以蒸餾水代替樣液，測(cè)得吸光度值記為Ao［20］［20］羥自由基清除率計(jì)算公式為：清除率=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100%2.7.3.3超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法研究黑花生衣（低聚）原花色素對(duì)超氧陰離子的清除能力。取十支試管，分別向每支試管加入4.5mlpH值為8.2的Tris-HCl緩沖液，置于恒溫水浴鍋中25℃水浴20min，分別依次向每支試管加入1ml濃度不同的（低聚）原花色素溶液，最后再向每支試管中加入0.4ml濃度為25mmol/L的鄰苯三酚溶液，混合均勻，置于25℃水浴鍋中水浴反應(yīng)5min，隨后加入1.0ml濃度為8mol/L的HCl溶液，同時(shí)用1mL蒸餾水代替黑花生衣（低聚）原花色素溶液作為空白對(duì)照，在545nm下測(cè)定（低聚）原花色素試樣液的吸光度值，計(jì)算清除率。超氧陰離子自由基的清除率的計(jì)算公式為:2.7.2.3還原能力的測(cè)定采用普魯士蘭法。取5支25mL具塞試管，分別向試管中加入1ml濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml的黑花生衣的（低聚）原花色素溶液，接著再向試管中0.6ml磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH=6.6）和1.5mL1%的K3[Fe(CN)6]溶液，然后將試管置于水浴鍋中50℃水浴反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后流動(dòng)水冷卻其至室溫，加入3ml10%冰乙酸，混勻后靜置10min，將溶液在3000rpm條件下離心15min。取離心后的上清液3ml，然后加入5ml蒸餾水和0.2mL1%的FeCl3溶液，混合均勻后靜置5min，于517nm處測(cè)定其吸光度值，吸光值越大表示其還原力越強(qiáng)。以1.5ml蒸餾水代替1.5mlK3[Fe(CN)6]溶液做空白對(duì)照。同時(shí)，配制相同濃度的Vc溶液作為對(duì)照，表示其還原能力的大小。2.7.2.4脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力采用對(duì)烷基引發(fā)的亞油酸氧化體系的清除研究其對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力。（聚體方法參照［18］和［22］中所述）對(duì)烷基自由基清除率的計(jì)算公式為:3結(jié)果與討論3.1提取原花色素的單因素試驗(yàn)3.1.1乙醇濃度對(duì)提?。ǖ途郏┰ㄉ氐挠绊懏?dāng)設(shè)定微波的功率為400W、溫度為55℃、提取時(shí)間為1min時(shí)，分別向每份發(fā)酵液中加入濃度為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%的乙醇20ml，測(cè)的（低聚）原花色素提取率如下圖。由圖3.1可知，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，黑花生衣的（低聚）原花色素的提取率最高。圖3.1不同乙醇濃度下（低聚）原花色素提取率3.1.2乙醇加入量對(duì)提?。ǖ途郏┰ㄉ氐挠绊懏?dāng)設(shè)定微波的功率為400W、溫度為55℃、提取時(shí)間為1min及乙醇濃度為50%時(shí)，分別向每份發(fā)酵液加入5、10、15、20、25ml乙醇溶液，得到（低聚）原花色素提取率如圖3.2。有圖可知當(dāng)乙醇加入量為20ml時(shí)，黑花生衣（低聚）原花色素的提取率最高。圖3.2不同乙醇加入量的（低聚）原花色素提取率3.1.3提取溫度對(duì)提?。ǖ途郏┰ㄉ氐挠绊懏?dāng)設(shè)定微波的功率為400W、提取時(shí)間為1min及乙醇濃度為50%、加入量為20ml時(shí)，提取溫度分別為40、45、50、55、60℃，得到（低聚）原花色素提取率如圖3.3。有圖可知當(dāng)提取溫度為55℃時(shí)，黑花生衣（低聚）原花色素的提取率最高。圖3.3不同溫度下（低聚）原花色素的提取率3.1.3提取溫度對(duì)提?。ǖ途郏┰ㄉ氐挠绊?.2低聚原花色素的分離純化3.2.13.3比較分析（低聚）原花色素的組成成分3.4比較分析（低聚）原花色素的穩(wěn)定性3.4.13.5比較分析（低聚）原花色素的生物學(xué)活性分析3.5.1參考文獻(xiàn)：［1］劉大川，劉強(qiáng)，吳波.花生紅衣中自藜蘆醇、原花色素提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2005,26（7）：144-148.［2］管文狄.花生紅衣中原花色素的提取與純化工藝研究.［D］.吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.［3］李瑞麗.葡萄籽中原花青素的提取工藝研究［D］.北京，北京化工大學(xué)，2006：4.［4］溫鵬飛等.原花色素研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2004,20:25-29.［5］石碧，杜曉.植物原花色素研究利用進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì)［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,38（5）：16-24.［6］鄭榮梁.自由基生物學(xué).北京.高等教育出