提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方法和新策略（完整版）【摘要】慢性乙型肝炎（CHB）是由乙型反復(fù)炎性病變?yōu)橹饕卣鞯募膊。蛇M(jìn)一步發(fā)展為失代償期肝硬化、肝癌或肝衰竭。目前CHB的抗病毒治療藥物主要是核苷（酸）類似物和干擾素兩大類，雖能有效抑制病毒復(fù)制，但由于不能破壞共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA仍面臨HBsAg清除率低、停藥后易復(fù)發(fā)等問題，難以實(shí)現(xiàn)功能性治愈（或臨床治愈）。新型藥物及生物制劑的興起為CHB實(shí)現(xiàn)功能性治愈提供新的思路和方向。本文就CHB功能性治愈的新方法及方案作一闡述?！娟P(guān)鍵詞】肝炎，乙型，慢性；肝炎病毒，乙型；功能性治愈；新方法慢性乙型肝炎（CHB）仍是全球性公共衛(wèi)生疾病，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌或者肝衰竭，故需積極采取措施來降低CHB進(jìn)展風(fēng)險[1-2]。而CHB理想的治療終點(diǎn)是其功能性治愈（臨床治愈），即在有限的治療療程后，HBsAg、HBVDNA持續(xù)不可測，伴或不伴有抗-HBs產(chǎn)生，隨著時間推移，肝臟組織病變改善，肝癌發(fā)生率減低（不同層次的功能性治愈包括完全阻斷cccDNA轉(zhuǎn)錄、消除cccDNA、完全解決肝損傷和消除肝癌的水平，但HBsAg清除率只有3%～11%，且停藥后易復(fù)發(fā)。而IFN療程有限，且不良反應(yīng)多，HBsAg清除率僅達(dá)10%[5]。因此，CHB的功能性治愈仍是個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。鑒于NAs及IFN單一治療治愈率較低，抗病毒聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療已—抗病毒/免疫調(diào)節(jié)治療提高HBsAg陰轉(zhuǎn)率新方案的研究顯示，治療48周后，IFN聯(lián)合NAs、集落刺激因子及乙型肝炎疫苗治療的CHB初治患者HBsAg陰轉(zhuǎn)率達(dá)10.0%[6]，而NAs經(jīng)治的CHB患者HBsA高達(dá)15.83%，明顯高于單一IFN或IFN聯(lián)合NAs治療。本文將對CHB治療的新方案，包括針對直接抗HBV新靶點(diǎn)相關(guān)藥物以及調(diào)節(jié)患者免疫狀態(tài)相關(guān)生物制劑作一概述。一、直接抗病毒治療1.HBV入胞抑制劑HBV進(jìn)入肝細(xì)胞是HBV與宿主相互作用的第一步，由包膜蛋白介導(dǎo)，而前-S1結(jié)構(gòu)域是受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。李文輝團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)鈉-?；悄懰猁}共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（Na+/taurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP）是HBV感染肝細(xì)胞的功能性受體，能夠與前-S1區(qū)受體結(jié)合點(diǎn)特理想靶點(diǎn)，而靶向NTCP藥物被稱為HBV入胞抑制劑。因此，HBV入胞抑制劑可能阻止非感染肝細(xì)胞中的cccDNA從頭合成，在預(yù)防母嬰傳播或肝移植后再感染方面可能比清除慢性HBV感染者體內(nèi)的HBV更有效[3]。MyrcludexB是不可逆NTCP阻滯劑，已被證明能有效防止HBV在體內(nèi)下降超過1lgIU/mL，明顯高于其他治療劑量組，且有55%實(shí)現(xiàn)氨酶（ALT）復(fù)常，但HBsAg的血清學(xué)水平?jīng)]有明顯改善[9]。盡管NTCP阻滯劑對于已存在的感染效果欠佳，但聯(lián)合NAs、IFN或者其他制劑可能2.靶向cccDNA治療清除cccDNA是CHB治療的中心障礙，新的cccDNA合成可以被治療可以清除、降解cccDNA或使cccDNA功能表達(dá)受阻，然而該領(lǐng)域的努力仍處于初級階段。2.1嵌合核酸內(nèi)切酶研究發(fā)現(xiàn)，在核酸內(nèi)切酶上添加一個能與cccDNA序列特異性結(jié)合的DNA錨鏈多肽，可形成嵌合核酸內(nèi)切酶，能在不影響宿主細(xì)胞DNA的前提下靶向識別并剪切cccDNA上的堿基序列。目前研究最多的是鋅指蛋白介導(dǎo)的短回文重復(fù)序列（theRNA-guiinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR）以及CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPRassociatedprotins,Cas）核酸內(nèi)切酶[10以與HBVDNA互補(bǔ)，從而破壞復(fù)制。Cradick等[11]在研究中首次證明ZFNs可以在病毒復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)模型中破壞36%的質(zhì)粒衍生的病毒序列。隨后Weber等[12]利用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)HBV特異性ZFNs，并在細(xì)胞模型中檢測其活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFNs能有效抑制HBVDNA復(fù)制。另一種核酸內(nèi)切酶TALENs利用可識別HBV特異位點(diǎn)的DNA結(jié)合域?qū)⒁拼a突變引入HBV基因，從而抑制HBVDNA復(fù)制。Bloom等[13]報道TALENs可靶向識別S或C開放閱讀框，導(dǎo)致35%的cccDNA分子突變。而特異性破壞HBVcccDNA[16-18]。Kennedy等[19]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶能使肝細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA降至1/1000，而肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA降至1/10。雖然臨床前研究顯示嵌合核酸內(nèi)切酶能有效降解cccDNA，但其具體療效需進(jìn)一步深入探討研究。制劑Cai等[20]通過研究篩選出兩種磺胺類衍生物，即CCC-0975以及CCC-0346，可抑制rcDNA向cccDNA轉(zhuǎn)化，而且可以針對cccDNA控制表觀遺傳，同時證明CCC-0975可降低HBV感染的鴨原代肝細(xì)胞中的cccDNA合成。然而上述藥物均在早期研究階段，具體療效尚需更多體外及體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步評估。RNAi可以直接高度特異性地靶向HBVmRNA轉(zhuǎn)錄，明顯減少包括HBsAg在內(nèi)的病毒蛋白的產(chǎn)生。ARC-520由兩個合成的短干擾RNAs與膽固醇組成，靶向HBVRNA保守序列從而降低HBVDNA及病毒蛋白水平[21]。Wooddell等[22]在臨床試驗(yàn)中讓長期服用恩替卡韋的CHB患者分別接受不同劑量的ARC-520（最高達(dá)4mg/kg發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性隊(duì)列中接受4mg/kg劑量的患者HBsAg下降明顯高于其他劑量組；而在接受ARC-520相同劑量情況下，HBeAg陽性患者HBsAg下降較HBeAg陰性患者明顯，同時在試驗(yàn)中證明ARC-520具有良好的耐受性，無嚴(yán)重的不良反應(yīng)。Michler等[23]研究顯示，表達(dá)短發(fā)夾RNA的腺病毒載體（ShorthairpinRNA-expressingadeno-asociated-virusvector,表達(dá)，而用新的腺病毒8載體可獲得持久的HBV抑制。N-乙酰半乳糖胺偶聯(lián)siRNA（N-acetylgalactosamine-coupledsiRNA,GAlNAc-siRNAs）通過肝細(xì)胞特異性唾液酸糖蛋白受體干擾基因的表達(dá)。研究表明，AAV-shRNA和GAlNAc-siRNAs均能抑制HBV抗原的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)兩者在高病毒載量小鼠模型中能夠促進(jìn)治療性疫苗誘導(dǎo)特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用，引起HBsAg及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)功能性治愈。而且，部分小鼠甚至在停藥5個月后仍能抑制HBV復(fù)制，同時無明顯的不良反應(yīng)[24-25]。ARB-1467能夠降低HBV所有轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。Mani等[26]研究表明，AB-452可以降低HBVRNA水平，且對HBV基因型A～H均有效。聯(lián)合下文將提到的AB-506，以及ARB-1467和NAs能產(chǎn)生明顯的協(xié)同抗病毒作用。AB-729是在ARB-1467基礎(chǔ)上改善而成的一種新型RNA干擾劑，對HBV基因型A～H均有活性，單次皮下注射可抑制病毒復(fù)制并減少病毒轉(zhuǎn)錄，從而降低HBsAg水平。然而，其效應(yīng)具有劑量依賴性，且目前具體療效仍處于臨床前研究階段，需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)支持[27]。ARO-HBV可靶向cccDNA及整合DNA產(chǎn)生的所有HBV轉(zhuǎn)錄物。研究表明，其在小鼠及食蟹猴屬中具有良好的耐受性，每3周劑量可達(dá)300mg/kg。單次劑量注射可長久降低高病毒載量小鼠模型中的HBVRNA、HBsAg、HBeAg以及血清HBVDNA水平，且重復(fù)皮下注射的療效較單次劑量更佳，并與恩替卡韋具有協(xié)同抗病毒作用。雖然上述藥物大多仍在臨床前研究階段，但為CHB治療提供了新思路，亦啟示我們未來CHB治療可能需要多種藥物聯(lián)合使用[28]。2.4基因沉默DNA的表觀遺傳修飾可以沉默基因的表達(dá)，是宿主防御病毒基因表達(dá)的機(jī)制。目前已經(jīng)證實(shí)HBx可通過降解染色體的結(jié)構(gòu)維持（Structural轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制[18,29]。2.5cccDNA降解editingcatalyticpolypeptide-like,APOBEC）可與HBV核心蛋白相互作用，并轉(zhuǎn)位到核心蛋白上脫氨基后降解細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA。最近激動劑可上調(diào)APOBEC，從而誘導(dǎo)cccDNA降解，體內(nèi)與體外試驗(yàn)均表明LTβR可降低HBVDNA水平以及cccDNA濃度，但是其活化持續(xù)時間超過1年可能與肝癌的發(fā)展有關(guān)，因此LTβR激動劑仍需長期治療相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)[16]。3.HBV組裝過程中相關(guān)靶點(diǎn)藥物HBV核心/衣殼蛋白/HBc蛋白作為直接抗病毒的靶點(diǎn)近年來得到了廣泛關(guān)注。目前研究較多的苯基丙酰胺（如AT-61，AT130）、雜芳基二（Pregenomic-RNA,pgRNA）包封或衣殼形成，使逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生無功能的病毒顆粒[31]。新型衣殼蛋白抑制劑NVR3-778在Ia期試驗(yàn)中沒有發(fā)生治療或劑量相關(guān)的不良反應(yīng)[16]。Klumpp等[32]在人源化肝臟小鼠中發(fā)現(xiàn)NVR-778可降低血清中HBVDNA和RNA水平，并且與聚乙二醇干擾素（PegIFN）的聯(lián)合使用抗病毒效果更佳。然而其劑量相關(guān)的安全性、藥代動力學(xué)仍在Ib試驗(yàn)期[16]。AB-506作用于核心蛋白二聚體界面，能夠?qū)е潞铣傻囊職と狈gRNA，從而阻斷rcDNA形成,能有效抑制HBV復(fù)制，并可針對HBV的所有基因型。研究表明AB-506在高病毒載量小鼠模型中能降低血清HBVDNA水平，且其效應(yīng)具有劑量依賴性。在耐受范圍內(nèi)（最高可達(dá)100mg/kgAB-506劑量越高，HBVDNA水平下降越明顯[26]。EP-027367可通過加速二聚體核心亞基的組裝過程，形成基因組缺陷的衣殼，從而有效抑制HBV復(fù)制。體外試驗(yàn)顯示，EP-027367對穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞株具有抗病毒活性，且對NAs耐藥的細(xì)胞亦有活性，并與NAs或其他衣殼抑制劑具有協(xié)同抗病毒作用。有動物實(shí)驗(yàn)表明，而且有著良好的藥物耐受性，然而此制劑仍在臨床前研究階段[33]。另一種新型有效的HBV衣殼調(diào)節(jié)劑GLP-26，在人和狗的血漿、人肝微粒體中均具有良好的穩(wěn)定性。研究表明GLP-26對抗雜芳基二氫嘧啶突變體T109l有效。體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)GLP-26與恩替卡韋具有協(xié)同抗病毒作用，能有效降低小鼠模型中HBVDNA、HBeAg以及HBsAg水平[34]。RO7049389是口服的核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，對HBVA～D基因型均有較高抵抗作用，且與NAs變異體沒有交叉抵抗。研究表明，RO7049389與下文將講述的Toll樣受體7（TolllikereceDNA水平，并且在部分小鼠中可出現(xiàn)抗-HBs，目前在臨床試驗(yàn)I期[35]。4.新型聚合酶抑制劑長期NAs治療的局限性在于其耐藥性，而新型的NAs可以減少耐藥可作為替諾福韋繼任者。由于可在淋巴組織和肝臟中積累，因此對于治療HBV感染具有巨大潛力。相比替諾福韋，TAF具有較低的腎毒性或骨密度是一種新型的鳥苷酸類似物，在細(xì)胞內(nèi)可快速磷酸化，從而抑制HBV復(fù)制。然而多中心研究表明，其病毒抑制以及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與恩替卡韋治療并沒有明顯的區(qū)別[37]。另外幾種包括CMX157、AGX-1009以及MIV-210等制劑現(xiàn)仍處于臨床II期試驗(yàn)階段[16]。盡管這些基于NAs的新型單藥療法對清除HBsAg及cccDNA療效微乎其微，但聯(lián)合其他直接抗病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)劑可能是未來CHB治療的主要支柱。5.HBsAg釋放抑制劑HBsAg具有抑制免疫系統(tǒng)應(yīng)答的作用，這可能是慢性持續(xù)性HBV感染原因之一，因此HBsAg清除是控制HBV感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理論上，HBsAg釋放抑制劑將消除由HBsAg蛋白介導(dǎo)的免疫抑制，并可能產(chǎn)生抗-HBs[38]。REP-2055、REP-2139和REP-2165能夠阻斷HBsAg釋放。Bazinet等[38]在試驗(yàn)中將已經(jīng)接受26周替諾福韋治療的40例CHB患者隨機(jī)分為兩組，分別接受替諾福韋+PegIFN+REP-2139或REP-2165兩種中的一種和替諾福韋+PegIFN兩種抗病毒藥物，隨訪至48周。結(jié)果顯示前組大多數(shù)患者實(shí)現(xiàn)HBsAg清除，近半數(shù)甚至產(chǎn)生抗-HBs。鑒于上述良好的抗病毒效果，我們需要進(jìn)一步的大樣本數(shù)據(jù)來支持臨床使用。二、抗HBV免疫調(diào)節(jié)劑免疫系統(tǒng)包括先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答，是抗HBV感染的重要屏障。因此，免疫調(diào)節(jié)療法在清除HBV感染細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。1.免疫增強(qiáng)劑人類先天性免疫系統(tǒng)通過諸如TLRs的模式識別受體識別病原體，進(jìn)而引發(fā)抗炎反應(yīng)。HBV可通過下調(diào)TLRs完成免疫逃避，故TLRs激動劑可能是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的新療法[39]。目前多數(shù)研究集中在TLR7的刺激誘導(dǎo)。在成功證明口服TLR7激動劑GS9620可誘導(dǎo)黑猩猩體內(nèi)HBVDNA的長期抑制，并刺激IFNα的產(chǎn)生后[40-41]，Agarwal等[42]讓192例并同時口服替諾福韋48周，在第24周觀察療效。在接受GS9620治療患者中，只有3例實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而HBsAg及HBVDNA水平并沒有明顯降低，其中少部分患者出現(xiàn)類似于PegIFNα的流感樣癥狀。另一種新型TLR7激動劑RO7020531是雙前驅(qū)藥物，不僅可激活TLR7，亦對TLR8激活有低效能。其安全性高，具有較好的耐受性。小鼠模型研究表明RO7020531可增加生發(fā)中心B細(xì)胞以及脾臟中HBsAg特異性B床試驗(yàn)I期[35]。2.治療性疫苗通過疫苗接種誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答被認(rèn)為是控制HBV感染的有效策略。Martin等[43]研究了一種新的可編碼HBV核心蛋白、多聚糖酶和胞膜蛋白三個區(qū)域的治療性疫苗TG1050，可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞和肝內(nèi)功能性T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制。GS-474是一種用以表達(dá)乙型肝炎特異性抗原的重組熱滅活酵母疫苗，其安全性及耐受性較好。臨床前小鼠研究表明，GS-474可以刺激遲發(fā)性HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞誘慰劑）24周，兩組之間的HBVDNA抑制率、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率或肝功能正?；牟町悷o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與宿主的免疫耗竭有關(guān)[16]。雖然治療性疫苗長期以來是CHB一種有前景的治療方法，但這種策略仍面臨挑戰(zhàn)。由于病毒抑制與強(qiáng)有力的NAs可能會減少T淋巴細(xì)胞衰竭，從而增加治療性疫苗的有效性，故疫苗聯(lián)合其他上述制劑可能是未來新的3.T細(xì)胞抑制受體增強(qiáng)抗病毒T細(xì)胞應(yīng)答的另一