OSAS模式間歇低氧下大鼠PMN凋亡與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（ObstructiveSleepApneaSyndrome，OSAS）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，其主要特征為睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)上氣道完全或部分阻塞，進(jìn)而引發(fā)呼吸暫停、低通氣以及間歇性低氧等情況。這些病理生理改變不僅嚴(yán)重干擾患者的睡眠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致睡眠質(zhì)量顯著下降，還會(huì)引發(fā)一系列全身多系統(tǒng)的并發(fā)癥，對(duì)患者的身體健康造成極大的危害。OSAS在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。流行病學(xué)研究表明，成年人中OSAS的患病率高達(dá)5%-20%，且隨著年齡的增長、肥胖人群的增加以及生活方式的改變，其發(fā)病率仍在持續(xù)攀升。未經(jīng)有效治療的OSAS患者，其全因病死率和心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。在心血管系統(tǒng)方面，OSAS長期發(fā)展可導(dǎo)致心力衰竭、冠心病、高血壓、心律失常等疾病。這是因?yàn)镺SAS患者睡眠時(shí)反復(fù)發(fā)生的低氧血癥和高碳酸血癥，會(huì)激活機(jī)體的交感神經(jīng)系統(tǒng)，使兒茶酚胺分泌增加，導(dǎo)致血管收縮、血壓升高，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在呼吸系統(tǒng)，OSAS可引發(fā)呼吸衰竭、肺心病、夜間哮喘等。由于睡眠中的呼吸暫停和低通氣，導(dǎo)致肺部氣體交換受阻，二氧化碳潴留，進(jìn)而引起肺動(dòng)脈高壓，最終可發(fā)展為肺心病。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，OSAS與老年癡呆癥、腦梗塞、記憶力減退、腦出血、性格改變（如抑郁癥）等密切相關(guān)。間歇性低氧會(huì)導(dǎo)致大腦缺氧，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能和代謝，加速神經(jīng)退行性變，增加神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病幾率。在內(nèi)分泌系統(tǒng)方面，OSAS可導(dǎo)致肥胖、兒童生長遲緩、脂質(zhì)代謝紊亂、糖尿病等。OSAS患者的睡眠紊亂和低氧狀態(tài)會(huì)影響內(nèi)分泌激素的分泌和調(diào)節(jié)，導(dǎo)致胰島素抵抗增加，血糖升高，脂肪代謝異常。血管內(nèi)皮功能障礙在OSAS諸多靶器官損害中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致上述疾病的共同病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)壁的一層單細(xì)胞屏障，不僅具有維持血管壁完整性和調(diào)節(jié)血管張力的作用，還參與了炎癥反應(yīng)、凝血與纖溶平衡以及細(xì)胞黏附等多種生理病理過程。在正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠保持動(dòng)態(tài)平衡，維持血管的正常功能。然而，在OSAS患者中，由于長期處于間歇低氧/再氧合環(huán)境，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種因素的刺激，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變。這種改變會(huì)使得血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，血管收縮性增強(qiáng)，容易形成血栓；同時(shí)，還會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，最終導(dǎo)致心腦血管等靶器官的損害。外周血多型核細(xì)胞（PolymorphonuclearNeutrophils，PMN），主要是外周血中性粒細(xì)胞，是體內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞，在機(jī)體的免疫防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PMN的數(shù)量占全部循環(huán)白細(xì)胞近60％，它可釋放多種炎癥因子、化學(xué)因子和黏附因子，參與機(jī)體免疫反應(yīng)。在常氧狀態(tài)下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用保持動(dòng)態(tài)平衡，PMN的正常凋亡是防止炎癥損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮的基本機(jī)制。但在OSAS患者慢性間歇低氧（ChronicIntermittentHypoxia，CIH）狀態(tài)下，PMN細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡通路如NF-κB、bcl-2家族、p38MAPK及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）等發(fā)生了不同程度的改變，導(dǎo)致PMN凋亡延遲，生存時(shí)間延長。凋亡延遲的PMN持續(xù)激活，L-選擇素、E-選擇素和P-選擇素的表達(dá)增強(qiáng)，與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增強(qiáng)，釋放高水平的活性氧簇（ReactiveOxygenSpecies，ROS）。同時(shí)，CIH狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞被激活，內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子、選擇素和整合素的表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)P選擇素等因子進(jìn)入循環(huán)血，促進(jìn)PMN凋亡延遲及細(xì)胞間黏附加強(qiáng)，相互作用時(shí)間延長，PMN向內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子、蛋白溶解酶、白三烯、ROS等介質(zhì)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，進(jìn)而加速內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展。因此，深入研究OSAS模式間歇低氧對(duì)PMN凋亡以及PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的機(jī)制，對(duì)于揭示OSAS相關(guān)心腦血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論意義。目前，雖然對(duì)OSAS的研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于OSAS模式間歇低氧導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的具體機(jī)制，尤其是PMN凋亡在其中的作用以及PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的交互影響機(jī)制，尚未完全明確。明確這些機(jī)制，一方面有助于為臨床治療OSAS及其相關(guān)并發(fā)癥提供新的靶點(diǎn)和策略。例如，如果能夠找到調(diào)節(jié)PMN凋亡的關(guān)鍵因素或信號(hào)通路，就可以開發(fā)相應(yīng)的藥物來促進(jìn)PMN的正常凋亡，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕血管內(nèi)皮的損傷，預(yù)防和治療心腦血管等并發(fā)癥。另一方面，也可以為OSAS的早期診斷和病情評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)PMN凋亡相關(guān)指標(biāo)以及PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互作用的相關(guān)標(biāo)志物，能夠更準(zhǔn)確地判斷OSAS患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后，為個(gè)性化治療方案的制定提供依據(jù)。所以，本研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義，有望為OSAS的防治開辟新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，OSAS模式間歇低氧對(duì)機(jī)體的影響成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，眾多學(xué)者圍繞其對(duì)大鼠PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響展開了深入研究，取得了一系列成果，但仍存在部分空白與不足。在國外，有研究通過建立OSAS大鼠模型，深入探討了間歇低氧對(duì)PMN凋亡的影響。結(jié)果表明，間歇低氧狀態(tài)下，大鼠PMN凋亡相關(guān)信號(hào)通路如NF-κB、bcl-2家族等發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致PMN凋亡延遲。凋亡延遲的PMN持續(xù)激活，釋放大量活性氧簇（ROS）和炎癥介質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血管內(nèi)皮的正常功能。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞被激活后，其表面黏附分子表達(dá)增加，與PMN的黏附作用增強(qiáng)，二者相互作用，形成惡性循環(huán)，加速了血管內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈硬化的進(jìn)程。國內(nèi)的研究也得出了類似結(jié)論，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了不同間歇低氧時(shí)間對(duì)PMN凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)隨著間歇低氧時(shí)間的延長，PMN凋亡率呈逐漸下降趨勢(shì)，且這種變化與低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在對(duì)OSAS患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，患者外周血PMN凋亡異常與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）越高，PMN凋亡延遲越明顯，提示PMN凋亡可能作為評(píng)估OSAS病情的潛在指標(biāo)。關(guān)于PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互影響，國外有研究利用共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)CIH狀態(tài)下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用顯著增強(qiáng)，PMN釋放的炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而內(nèi)皮細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子又能進(jìn)一步影響PMN的功能和凋亡進(jìn)程。國內(nèi)學(xué)者通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，證實(shí)了在OSAS間歇低氧環(huán)境下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在復(fù)雜的交互作用，這種交互作用受多種信號(hào)通路調(diào)控，如p38MAPK、ERK1/2等信號(hào)通路在調(diào)節(jié)二者相互作用中發(fā)揮重要作用。盡管國內(nèi)外在這一領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展，但仍存在不足之處。一方面，目前對(duì)于OSAS模式間歇低氧導(dǎo)致PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的具體分子機(jī)制尚未完全明確，雖然已知一些信號(hào)通路參與其中，但各信號(hào)通路之間的相互關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控這一過程，仍有待深入研究。另一方面，現(xiàn)有的研究多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，臨床研究相對(duì)較少，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來進(jìn)一步驗(yàn)證和拓展基礎(chǔ)研究的成果。此外，針對(duì)OSAS模式間歇低氧下PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的干預(yù)措施研究還不夠系統(tǒng)和深入，如何通過調(diào)節(jié)這一過程來防治OSAS相關(guān)并發(fā)癥，仍需要更多的探索和研究。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究OSAS模式間歇低氧對(duì)大鼠PMN凋亡的影響，以及PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的交互影響機(jī)制，為揭示OSAS相關(guān)心腦血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，并為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在研究過程中，我們將采用多種研究方法。首先是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選用健康成年雄性SD大鼠，將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組和間歇低氧組，利用間歇低氧艙模擬OSAS患者的間歇低氧環(huán)境，對(duì)間歇低氧組大鼠進(jìn)行不同時(shí)間和模式的間歇低氧暴露處理，從而建立OSAS模式間歇低氧大鼠模型。其次，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從大鼠主動(dòng)脈中分離并培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)從大鼠外周血中獲取PMN。通過將PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行直接共培養(yǎng)和利用transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)細(xì)胞間的相互作用環(huán)境，以便研究間歇低氧狀態(tài)下PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的交互影響。再者，借助分子生物學(xué)檢測(cè)方法，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PMN凋亡相關(guān)基因（如bcl-2、bax、caspase-3等）以及細(xì)胞間黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1等）的mRNA表達(dá)水平；運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)上述基因及蛋白的表達(dá)水平；利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-8等）和氧化應(yīng)激指標(biāo)（如MDA、SOD等）的含量；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN凋亡率以及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett'sT3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此來確定不同組之間的差異，明確OSAS模式間歇低氧對(duì)大鼠PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的具體機(jī)制。二、OSAS模式間歇低氧大鼠模型構(gòu)建及PMN凋亡檢測(cè)2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性SD大鼠48只，體重200-220g，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。大鼠在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將48只大鼠隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照組（NIH組）和間歇低氧組（IH組），每組各24只。正常對(duì)照組大鼠置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，間歇低氧組大鼠則接受間歇低氧暴露處理，以構(gòu)建OSAS模式間歇低氧大鼠模型。通過這樣的分組設(shè)置，能夠清晰地對(duì)比正常生理狀態(tài)與間歇低氧病理狀態(tài)下大鼠PMN凋亡及相關(guān)指標(biāo)的變化，為后續(xù)研究提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.2間歇低氧暴露方法本研究采用間歇低氧艙對(duì)間歇低氧組大鼠進(jìn)行暴露處理，以模擬OSAS患者睡眠時(shí)的間歇低氧環(huán)境。間歇低氧艙由[低氧艙設(shè)備制造商名稱]生產(chǎn)，型號(hào)為[具體型號(hào)]，具備精準(zhǔn)的氣體流量控制和氧濃度監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)低氧與常氧環(huán)境的交替切換。參照相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定間歇低氧暴露參數(shù)如下：低氧階段，將艙內(nèi)氧濃度迅速降低至6%-8%，并維持90秒，此氧濃度范圍能夠較好地模擬OSAS患者睡眠時(shí)的嚴(yán)重低氧狀態(tài)；常氧階段，使艙內(nèi)氧濃度恢復(fù)至21%，持續(xù)30秒，以模擬呼吸恢復(fù)后的正常氧合狀態(tài)。如此，低氧與常氧循環(huán)交替，每2分鐘為一個(gè)循環(huán)周期，每天持續(xù)暴露8小時(shí)，每周連續(xù)暴露7天，共計(jì)暴露8周。在整個(gè)暴露過程中，通過艙內(nèi)的氧濃度傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧濃度，并利用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄氧濃度的變化情況，確保氧濃度始終維持在設(shè)定范圍內(nèi)，以保證實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性和一致性。正常對(duì)照組大鼠則飼養(yǎng)于常氧環(huán)境的普通鼠籠中，溫度、濕度、光照等飼養(yǎng)條件與間歇低氧組相同，自由攝食和飲水，不進(jìn)行任何低氧處理，作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照，用于與間歇低氧組進(jìn)行對(duì)比分析，以明確間歇低氧對(duì)大鼠PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的特異性作用。2.3PMN的獲取與鑒定在實(shí)驗(yàn)過程中，獲取高純度、高活性的PMN是后續(xù)研究的關(guān)鍵步驟。具體操作如下：在大鼠暴露處理結(jié)束后，將大鼠用10%水合氯醛按3.5ml/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，迅速打開胸腔，暴露心臟，用無菌注射器經(jīng)左心室穿刺，抽取5ml外周血，置于含有EDTA-K2抗凝劑的采血管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。將采集的外周血轉(zhuǎn)移至離心管中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，使血液分層，此時(shí)可清晰看到上層為淡黃色的血漿，下層為紅細(xì)胞，中間有一層薄薄的白色云霧狀物質(zhì)，即為白細(xì)胞層。小心吸取白細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打混勻，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的血漿和雜質(zhì)。隨后，向離心管中加入3ml的淋巴細(xì)胞分離液，再將上述洗滌后的細(xì)胞懸液緩慢疊加在淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面清晰。以2500r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，此時(shí)管內(nèi)液體可分為四層，從上至下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層，PMN則位于淋巴細(xì)胞分離液與紅細(xì)胞層之間。小心吸取PMN層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量PBS緩沖液，吹打混勻后，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，即可獲得較為純凈的PMN。為確保獲取的PMN具有良好的活性和純度，需對(duì)其進(jìn)行鑒定。首先，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)PMN的存活率。取少量PMN懸液，與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按9:1的比例混合，輕輕混勻，室溫下靜置3分鐘。然后，用移液器吸取混合液，滴加在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞由于細(xì)胞膜完整，拒染臺(tái)盼藍(lán)，呈無色透明狀；而死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，臺(tái)盼藍(lán)可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使其染成藍(lán)色。通過計(jì)算未被染色的活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，即可得出PMN的存活率，一般要求存活率在95%以上。接著，利用吉姆薩染色法檢測(cè)PMN的純度。將PMN懸液滴在潔凈的載玻片上，推片制成血涂片，自然干燥后，用甲醇固定5分鐘。隨后，將血涂片浸入吉姆薩染液中，染色15-20分鐘，取出后用流水輕輕沖洗，自然干燥。在顯微鏡下觀察，PMN的細(xì)胞核呈分葉狀，細(xì)胞質(zhì)中含有許多細(xì)小的淡紫色或淡紅色顆粒，根據(jù)形態(tài)特征，計(jì)數(shù)PMN在所有細(xì)胞中的比例，以此確定其純度，要求純度達(dá)到90%以上。只有經(jīng)過鑒定，確保存活率和純度符合要求的PMN，才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.4PMN凋亡檢測(cè)方法本實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV和7-AAD雙標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN凋亡率。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜具有完整的結(jié)構(gòu)和功能，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）主要分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)。而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸會(huì)外翻至細(xì)胞膜外表面。AnnexinV是一種對(duì)PS具有高度親和力的Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合，從而可以作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。7-AAD（7-氨基放線菌素D）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，使其呈現(xiàn)紅色熒光?；谶@一原理，利用AnnexinV和7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。具體操作過程如下：首先，將獲取的PMN用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。然后，按照1×10?個(gè)細(xì)胞加入500μlBindingBuffer的比例，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，制成細(xì)胞懸液。接著，向細(xì)胞懸液中依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μl7-AAD，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。在孵育過程中，AnnexinV-FITC會(huì)與凋亡細(xì)胞表面外翻的PS結(jié)合，7-AAD則會(huì)進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞與DNA結(jié)合。孵育結(jié)束后，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀能夠根據(jù)細(xì)胞對(duì)不同熒光染料的攝取情況，將細(xì)胞分為不同的亞群，通過分析不同亞群細(xì)胞的比例，即可計(jì)算出PMN的凋亡率。其中，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV陽性、7-AAD陰性；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV陽性、7-AAD陽性；正常細(xì)胞則表現(xiàn)為AnnexinV陰性、7-AAD陰性。每個(gè)樣本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組大鼠PMN凋亡率，結(jié)果顯示，正常對(duì)照組（NIH組）大鼠PMN凋亡率為（25.34±5.21）%。而間歇低氧組（IH組）大鼠PMN凋亡率在不同暴露時(shí)間下呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。暴露4周時(shí)，IH組大鼠PMN凋亡率為（18.25±4.36）%，與NIH組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明間歇低氧暴露4周可導(dǎo)致PMN凋亡明顯延遲；暴露6周時(shí)，IH組大鼠PMN凋亡率為（16.58±3.89）%，較4周時(shí)進(jìn)一步降低，與NIH組的差異更加顯著（P<0.01）；暴露8周時(shí)，IH組大鼠PMN凋亡率為（15.12±3.56）%，雖然仍低于NIH組，但下降趨勢(shì)有所減緩，與6周時(shí)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長，PMN凋亡率逐漸降低，即凋亡延遲現(xiàn)象愈發(fā)明顯，但在暴露8周時(shí)，可能由于機(jī)體產(chǎn)生了部分適應(yīng)機(jī)制，使得PMN凋亡率下降趨勢(shì)變緩。進(jìn)一步分析不同常氧和低氧時(shí)間暴露對(duì)大鼠PMN凋亡率的影響。設(shè)置不同的低氧循環(huán)周期，如低氧90秒/常氧30秒、低氧120秒/常氧60秒、低氧150秒/常氧90秒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低氧90秒/常氧30秒的循環(huán)周期下，暴露4周時(shí)PMN凋亡率為（18.25±4.36）%；在低氧120秒/常氧60秒的循環(huán)周期下，暴露4周時(shí)PMN凋亡率為（16.32±4.05）%，與低氧90秒/常氧30秒組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明更長時(shí)間的低氧暴露和相對(duì)較短的常氧恢復(fù)時(shí)間會(huì)進(jìn)一步抑制PMN凋亡；在低氧150秒/常氧90秒的循環(huán)周期下，暴露4周時(shí)PMN凋亡率為（14.87±3.78）%，與前兩組相比，凋亡率顯著降低（P<0.01）。這說明間歇低氧暴露的程度（低氧時(shí)間與常氧時(shí)間的比例）對(duì)PMN凋亡也有顯著影響，低氧時(shí)間越長、常氧時(shí)間越短，PMN凋亡延遲越明顯。三、大鼠PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互作用研究3.1血管內(nèi)皮細(xì)胞的準(zhǔn)備本研究選用健康成年雄性SD大鼠，體重250-300g，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。將大鼠用10%水合氯醛按3.5ml/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，迅速打開胸腔，分離出胸主動(dòng)脈。在超凈工作臺(tái)中，將胸主動(dòng)脈置于含有無菌D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪和鑷子小心去除血管外膜的脂肪和纖維組織，再用含抗生素（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml）的D-Hanks液反復(fù)沖洗血管外表面及血管腔內(nèi)的凝血，以確保血管的清潔。采用貼塊法進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。用眼科剪將沖洗干凈的胸主動(dòng)脈縱向剪開，使其平展在培養(yǎng)皿中，然后用銳利的手術(shù)刀將其切成1mm3大小的動(dòng)脈植塊。提前將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿用1%明膠在37℃下預(yù)置過夜，使用前2h移入CO?培養(yǎng)箱中，用時(shí)先用含10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗。將動(dòng)脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸，以約1塊/cm2的種植密度種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中靜置2h（干貼壁），使植塊更好地貼附在瓶底。之后，加入0.5ml含25%胎牛血清的培養(yǎng)液，液量以略蓋過動(dòng)脈植塊內(nèi)膜面，且不使植塊漂浮為宜。24h后，更換培養(yǎng)液，加入2-3ml培養(yǎng)液。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長情況。大約72h時(shí)，當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長出，而成纖維細(xì)胞剛要長出時(shí)，將動(dòng)脈植塊除去，并刮除成纖維細(xì)胞，更換一次培養(yǎng)液。此后，每2天換液一次，每次換1/2-1/3的液量。繼續(xù)培養(yǎng)8-10d，當(dāng)細(xì)胞融合成單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃下消化1-2min，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。為了鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞表面的血管性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF）。將培養(yǎng)的細(xì)胞接種到預(yù)先放置有無菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至接近匯合時(shí)，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15min。然后用0.1%TritonX-100通透10min，再用5%BSA封閉30min。加入兔抗大鼠vWF多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫避光孵育1h。再次用PBS沖洗3次，每次5min，然后用DAPI染核5min。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞呈鋪路石樣排列，且vWF呈陽性表達(dá)，即細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，則可確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。3.2直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將兩種細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。按照1:1的比例，將血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN懸液混合均勻，接種于預(yù)先用1%明膠包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2ml細(xì)胞懸液，使每孔中兩種細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到2×10?個(gè)。同時(shí)設(shè)置單獨(dú)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)PMN的對(duì)照組，對(duì)照組每孔接種2ml相應(yīng)的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度同樣為1×10?個(gè)/ml。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6h、12h、24h時(shí)，取出培養(yǎng)板，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總RNA，使用TRIzol試劑按照說明書操作，從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。然后進(jìn)行RNA純度和濃度的測(cè)定，利用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的OD???/OD???比值，要求比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的純度。根據(jù)RNA的濃度，取適量的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以cDNA為模板，加入特異性引物、SYBRGreenMasterMix等試劑，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線，計(jì)算ICAM-1、VCAM-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)水平。將培養(yǎng)的細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離，使不同分子量的蛋白在凝膠上形成不同的條帶。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。接著加入兔抗大鼠ICAM-1、VCAM-1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)情況。利用AnnexinV和7-AAD雙標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，具體操作同前文PMN凋亡檢測(cè)中的相關(guān)步驟，通過分析不同亞群細(xì)胞的比例，計(jì)算出血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，以此來研究直接共培養(yǎng)條件下PMN對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。3.3transwell間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選用孔徑為0.4μm的transwell小室進(jìn)行間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，該孔徑允許細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等小分子物質(zhì)自由通過，而細(xì)胞本身無法穿過，從而實(shí)現(xiàn)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的間接接觸，以便研究二者之間通過分泌的物質(zhì)進(jìn)行的交互影響。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液接種于transwell小室的上室中。同時(shí)，將從大鼠外周血中獲取并鑒定合格的PMN用PBS洗滌2次后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。取600μlPMN懸液加入到transwell小室對(duì)應(yīng)的24孔培養(yǎng)板的下室中。設(shè)置正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN作為對(duì)照組，即上室只接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，下室只接種PMN。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6h、12h、24h時(shí)，取出培養(yǎng)板，收集上室和下室的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-8等）和氧化應(yīng)激指標(biāo)（如MDA、SOD等）的含量。按照ELISA試劑盒說明書操作，首先將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到已包被特異性抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2h，使樣品中的抗原與包被抗體充分結(jié)合。然后棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3-5次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。接著加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育30-60min，使酶標(biāo)抗體與結(jié)合在包被抗體上的抗原結(jié)合。再次洗滌酶標(biāo)板后，加入底物顯色液，37℃避光孵育15-30min，在酶的催化作用下，底物顯色液發(fā)生顏色變化。最后加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量。采用AnnexinV和7-AAD雙標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，具體操作同前文PMN凋亡檢測(cè)中的相關(guān)步驟。通過分析不同亞群細(xì)胞的比例，計(jì)算出血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，以此來研究間接共培養(yǎng)條件下PMN對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。3.4結(jié)果比較與分析在直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，不同培養(yǎng)時(shí)間下，與單獨(dú)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組中血管內(nèi)皮細(xì)胞與PMN共同培養(yǎng)6h時(shí)，細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平分別為（1.56±0.23）、（1.48±0.20），顯著升高（P<0.05）；培養(yǎng)12h時(shí)，ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，分別達(dá)到（2.12±0.30）、（1.95±0.25），與6h時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)24h時(shí)，ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平繼續(xù)上升，分別為（2.85±0.35）、（2.56±0.32），與12h時(shí)相比，差異同樣顯著（P<0.05）。在蛋白表達(dá)水平上，通過Westernblot檢測(cè)也得到了相似的結(jié)果，共培養(yǎng)組中ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸升高，6h時(shí)凋亡率為（15.23±3.12）%，12h時(shí)為（23.56±4.23）%，24h時(shí)達(dá)到（35.12±5.34）%，與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在直接共培養(yǎng)條件下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用隨著時(shí)間的推移逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在transwell間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，不同培養(yǎng)時(shí)間下，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量在6h時(shí)分別為（56.32±8.21）pg/ml、（45.67±6.54）pg/ml、（38.25±5.12）pg/ml，明顯升高（P<0.05）；12h時(shí)，TNF-α、IL-6、IL-8的含量繼續(xù)增加，分別達(dá)到（78.56±10.32）pg/ml、（65.43±8.76）pg/ml、（56.34±7.23）pg/ml，與6h時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24h時(shí)，TNF-α、IL-6、IL-8的含量進(jìn)一步上升，分別為（105.67±12.56）pg/ml、（85.78±10.45）pg/ml、（75.67±8.45）pg/ml，與12h時(shí)相比，差異顯著（P<0.05）。氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量在6h時(shí)為（6.54±1.02）nmol/ml，12h時(shí)升高至（8.76±1.23）nmol/ml，24h時(shí)達(dá)到（11.56±1.56）nmol/ml，呈逐漸上升趨勢(shì)（P<0.05）；而SOD活性在6h時(shí)為（85.67±10.23）U/ml，12h時(shí)下降至（65.43±8.56）U/ml，24h時(shí)進(jìn)一步降低至（45.67±6.78）U/ml，逐漸降低（P<0.05）。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率在6h時(shí)為（12.34±2.56）%，12h時(shí)為（20.12±3.67）%，24h時(shí)達(dá)到（30.56±4.89）%，與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明在間接共培養(yǎng)條件下，PMN通過分泌炎癥因子和影響氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。對(duì)比直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)直接共培養(yǎng)組中細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)水平和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率在相同培養(yǎng)時(shí)間下均高于間接共培養(yǎng)組。在培養(yǎng)24h時(shí)，直接共培養(yǎng)組ICAM-1的mRNA表達(dá)水平為（2.85±0.35），而間接共培養(yǎng)組為（2.05±0.28），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；直接共培養(yǎng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為（35.12±5.34）%，間接共培養(yǎng)組為（30.56±4.89）%，差異同樣顯著（P<0.05）。這可能是因?yàn)樵谥苯庸才囵B(yǎng)中，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸，能夠更直接、更快速地傳遞信號(hào)和物質(zhì)，從而導(dǎo)致更強(qiáng)的黏附作用和更高的凋亡率。而在間接共培養(yǎng)中，細(xì)胞間通過分泌的物質(zhì)間接交流，信號(hào)和物質(zhì)的傳遞相對(duì)間接和緩慢，使得黏附作用和凋亡率相對(duì)較低。但兩種培養(yǎng)方式下，細(xì)胞間的相互作用都導(dǎo)致了炎癥因子的釋放增加、氧化應(yīng)激水平的改變以及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的升高，這表明在OSAS模式間歇低氧環(huán)境下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在著密切的交互影響，且這種影響在不同的細(xì)胞接觸方式下均能發(fā)生。四、機(jī)制探討4.1OSAS與細(xì)胞間粘附機(jī)制在OSAS模式間歇低氧環(huán)境下，大鼠PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附機(jī)制發(fā)生了顯著變化，這一變化在炎癥反應(yīng)和血管損傷過程中扮演著至關(guān)重要的角色。細(xì)胞間粘附分子（如ICAM-1、VCAM-1等）在介導(dǎo)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附過程中起關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1、VCAM-1等粘附分子呈低水平表達(dá)，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附作用較弱，二者保持相對(duì)獨(dú)立的狀態(tài)。然而，當(dāng)機(jī)體處于OSAS模式間歇低氧狀態(tài)時(shí)，情況發(fā)生了明顯改變。間歇低氧會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，其中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是兩個(gè)重要方面。在氧化應(yīng)激作用下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧簇（ROS），這些ROS作為第二信使，能夠激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下，它與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB?；罨腘F-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與ICAM-1、VCAM-1等粘附分子基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)這些粘附分子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。同時(shí)，炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，也能通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步上調(diào)ICAM-1、VCAM-1等粘附分子的表達(dá)。隨著粘附分子表達(dá)水平的升高，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附作用顯著增強(qiáng)。PMN表面表達(dá)的L-選擇素、整合素等分子，能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的ICAM-1、VCAM-1等粘附分子特異性結(jié)合，從而使PMN牢固地粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。這種粘附作用的增強(qiáng)，使得PMN更容易遷移到血管內(nèi)皮細(xì)胞處，進(jìn)而加劇了炎癥反應(yīng)和血管損傷。一方面，粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的PMN被進(jìn)一步激活，釋放出更多的炎癥介質(zhì)、蛋白溶解酶、白三烯、ROS等物質(zhì)。這些物質(zhì)不僅會(huì)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其正常的結(jié)構(gòu)和功能，還會(huì)吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集到血管內(nèi)皮部位，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不斷放大。另一方面，炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥介質(zhì)的釋放，會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，血液中的脂質(zhì)等成分更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。長期的炎癥刺激還會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，血管壁增厚，管腔狹窄，進(jìn)一步加重血管損傷。在直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，血管內(nèi)皮細(xì)胞與PMN共同培養(yǎng)組中ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也逐漸升高。這直接證明了在細(xì)胞直接接觸的情況下，粘附分子表達(dá)的增加促進(jìn)了PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡。在transwell間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，雖然細(xì)胞間沒有直接接觸，但通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的含量以及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，炎癥因子含量逐漸增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也逐漸升高。這說明即使在間接接觸的情況下，PMN通過分泌炎癥因子等物質(zhì)，仍然能夠激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)二者之間的粘附，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。綜上所述，OSAS模式間歇低氧通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等途徑，上調(diào)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)，增強(qiáng)二者之間的粘附作用，在炎癥和血管損傷過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這一機(jī)制的深入研究為理解OSAS相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。4.2OSAS與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制在OSAS模式間歇低氧條件下，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路與眾多分子的相互作用，PMN在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。線粒體途徑是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要通路之一。正常情況下，線粒體在維持細(xì)胞能量代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但在間歇低氧狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧簇（ROS）。過多的ROS會(huì)攻擊線粒體膜，使其通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。線粒體膜電位的下降會(huì)促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體進(jìn)一步招募并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9），活化的caspase-9又會(huì)激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究表明，在間歇低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型中，加入抗氧化劑可以減少ROS的產(chǎn)生，抑制線粒體膜電位的下降和細(xì)胞色素C的釋放，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，這充分證明了線粒體途徑在OSAS間歇低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的重要作用。死亡受體途徑也參與了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其中Fas/FasL系統(tǒng)是較為經(jīng)典的死亡受體途徑。Fas又稱CD95，在正常情況下，F(xiàn)as在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面呈低水平表達(dá)。當(dāng)機(jī)體處于OSAS間歇低氧狀態(tài)時(shí)，一方面，間歇低氧刺激機(jī)體產(chǎn)生的炎癥因子如TNF-α等，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面Fas表達(dá)上調(diào)；另一方面，活化的免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等表面的FasL表達(dá)也會(huì)增加。上調(diào)表達(dá)的Fas與FasL結(jié)合，導(dǎo)致Fas三聚體化。三聚化的Fas通過其胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD。FADD再通過其N端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與無活性的caspase-8酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，使caspase-8酶原激活形成有活性的caspase-8?；罨腸aspase-8可以直接激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，將凋亡信號(hào)傳遞到線粒體，進(jìn)一步放大凋亡信號(hào)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。PMN在OSAS間歇低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起著重要的介導(dǎo)作用。如前文所述，間歇低氧導(dǎo)致PMN凋亡延遲，持續(xù)激活的PMN會(huì)釋放大量的炎癥介質(zhì)、ROS等物質(zhì)。這些物質(zhì)可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。其中，ROS可以通過氧化應(yīng)激作用，損傷內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1β等，可以通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活死亡受體途徑和NF-κB信號(hào)通路等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。同時(shí)，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用增強(qiáng)，也會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡。在transwell間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，共培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量逐漸增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也逐漸升高，這表明PMN通過分泌炎癥因子，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了PMN在OSAS間歇低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的介導(dǎo)作用。4.3細(xì)胞間相互作用方式對(duì)機(jī)制的影響在本研究中，分別采用直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)兩種方式來探究細(xì)胞間相互作用方式對(duì)上述機(jī)制的影響。直接共培養(yǎng)中，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸，二者可通過細(xì)胞表面的黏附分子、受體等直接進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞。這種直接的相互作用使得信號(hào)傳遞更為迅速和直接，能夠在短時(shí)間內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)。在直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，且升高幅度明顯大于間接共培養(yǎng)組。這表明直接接觸能夠更有效地促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)二者之間的黏附作用。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也顯著高于間接共培養(yǎng)組，這是因?yàn)橹苯咏佑|使得PMN釋放的炎癥介質(zhì)、ROS等物質(zhì)能夠更快速、更直接地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而更有效地激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率升高。間接共培養(yǎng)則是利用transwell小室，使PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞不直接接觸，而是通過小室膜的孔隙進(jìn)行細(xì)胞因子、趨化因子等小分子物質(zhì)的交換。這種方式下，細(xì)胞間的信號(hào)傳遞相對(duì)間接和緩慢，生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。在間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，雖然細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量以及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也逐漸升高，但增加的幅度均小于直接共培養(yǎng)組。這說明間接接觸下，細(xì)胞間通過分泌的物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)傳遞，雖然也能引發(fā)炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但程度相對(duì)較輕。對(duì)比兩種培養(yǎng)方式，直接共培養(yǎng)更側(cè)重于細(xì)胞間直接的物理接觸和信號(hào)傳遞，能夠快速激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致黏附分子表達(dá)增加和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；而間接共培養(yǎng)則主要通過細(xì)胞分泌的物質(zhì)進(jìn)行間接的信號(hào)交流，信號(hào)傳遞相對(duì)緩慢，炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的程度相對(duì)較弱。但兩種培養(yǎng)方式都證實(shí)了在OSAS模式間歇低氧環(huán)境下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在密切的交互影響，且這種影響在不同的細(xì)胞接觸方式下均能通過不同的途徑導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激水平改變以及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。五、抗氧化劑Tempol的干預(yù)研究5.1Tempol干預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激在OSAS模式間歇低氧導(dǎo)致PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響中的作用，本研究引入抗氧化劑Tempol進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。Tempol，化學(xué)名為4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基，是一種超氧化物歧化酶（SOD）模擬物，能夠特異性地清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子，有效減輕氧化應(yīng)激損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將健康成年雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只。分別為正常對(duì)照組（NIH組）、間歇低氧組（IH組）、間歇低氧+Tempol低劑量干預(yù)組（IHT-L組）、間歇低氧+Tempol中劑量干預(yù)組（IHT-M組）和間歇低氧+Tempol高劑量干預(yù)組（IHT-H組）。正常對(duì)照組大鼠置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理；間歇低氧組大鼠按照前文所述的間歇低氧暴露方法，在間歇低氧艙中進(jìn)行8周的間歇低氧暴露；IHT-L組、IHT-M組和IHT-H組大鼠在進(jìn)行間歇低氧暴露前30分鐘，分別腹腔注射50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的Tempol，用生理鹽水將Tempol稀釋至所需濃度，注射體積為1ml/100g體重。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，每周稱量一次體重，記錄體重變化情況。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將兩種細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。按照1:1的比例，將血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN懸液混合均勻，接種于預(yù)先用1%明膠包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2ml細(xì)胞懸液，使每孔中兩種細(xì)胞的總數(shù)達(dá)到2×10?個(gè)。同時(shí)設(shè)置單獨(dú)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)PMN的對(duì)照組，對(duì)照組每孔接種2ml相應(yīng)的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度同樣為1×10?個(gè)/ml。在此基礎(chǔ)上，再設(shè)置Tempol干預(yù)組，在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的Tempol，使其終濃度分別為50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6h、12h、24h時(shí)，取出培養(yǎng)板，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。對(duì)于transwell間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，選用孔徑為0.4μm的transwell小室。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的血管內(nèi)皮細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液接種于transwell小室的上室中。同時(shí)，將從大鼠外周血中獲取并鑒定合格的PMN用PBS洗滌2次后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個(gè)/ml。取600μlPMN懸液加入到transwell小室對(duì)應(yīng)的24孔培養(yǎng)板的下室中。設(shè)置正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和PMN作為對(duì)照組，即上室只接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，下室只接種PMN。Tempol干預(yù)組則在上下室的培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的Tempol，使其終濃度分別為50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6h、12h、24h時(shí)，取出培養(yǎng)板，收集上室和下室的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。通過這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能夠全面地研究Tempol在不同層面（動(dòng)物整體和細(xì)胞水平）、不同培養(yǎng)方式（直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)）下對(duì)OSAS模式間歇低氧導(dǎo)致的PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的干預(yù)作用。5.2干預(yù)效果檢測(cè)指標(biāo)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)，包括丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GlutathionePeroxidase，GSH-Px）等。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的程度和細(xì)胞損傷的程度，MDA含量越高，表明氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過氧化氫，從而清除體內(nèi)過多的超氧陰離子，減輕氧化應(yīng)激損傷，SOD活性越高，說明機(jī)體的抗氧化能力越強(qiáng)。GSH-Px也是一種抗氧化酶，它可以利用還原型谷胱甘肽將過氧化氫還原成水，同時(shí)自身被氧化為氧化型谷胱甘肽，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡和抗氧化防御中發(fā)揮重要作用，GSH-Px活性升高，提示機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)。運(yùn)用ELISA法檢測(cè)血清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）等的含量。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，它可以激活免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其他炎癥因子的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，TNF-α含量升高，表明炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和急性期反應(yīng)等過程，在OSAS患者中，IL-6水平升高與心血管疾病等并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。IL-8是一種趨化因子，能夠吸引中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位聚集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，其含量的增加反映了炎癥細(xì)胞的趨化和活化。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)體系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及PMN凋亡相關(guān)基因（如bcl-2、bax、caspase-3等）的mRNA表達(dá)水平。ICAM-1和VCAM-1在介導(dǎo)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附中起關(guān)鍵作用，其mRNA表達(dá)水平的變化可以反映細(xì)胞間黏附能力的改變。bcl-2是一種抗凋亡基因，它可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，bcl-2mRNA表達(dá)水平升高，提示細(xì)胞凋亡受到抑制；bax是一種促凋亡基因，與bcl-2相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，baxmRNA表達(dá)水平升高，表明細(xì)胞凋亡傾向增強(qiáng)。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，在凋亡信號(hào)的刺激下，caspase-3被激活，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其mRNA表達(dá)水平的變化可反映細(xì)胞凋亡的程度。運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)上述基因及蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步從蛋白水平驗(yàn)證基因表達(dá)的變化，以更全面地了解Tempol對(duì)細(xì)胞間黏附分子和PMN凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。利用AnnexinV和7-AAD雙標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN凋亡率以及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，通過分析不同亞群細(xì)胞的比例，準(zhǔn)確計(jì)算出凋亡率，直觀地反映Tempol對(duì)PMN和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的干預(yù)效果。利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-8等）和氧化應(yīng)激指標(biāo)（如MDA、SOD等）的含量，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)指標(biāo)相互印證，從細(xì)胞水平探討Tempol對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組（NIH組）相比，間歇低氧組（IH組）大鼠血清中MDA含量顯著升高，達(dá)到（10.56±1.56）nmol/L，而SOD活性和GSH-Px活性則明顯降低，分別為（55.67±8.23）U/ml和（45.67±6.54）U/g，這表明間歇低氧導(dǎo)致大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著升高，抗氧化能力明顯下降。同時(shí)，IH組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量也顯著增加，分別為（85.67±10.32）pg/ml、（75.43±9.56）pg/ml、（65.34±8.23）pg/ml，說明間歇低氧引發(fā)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。經(jīng)過Tempol干預(yù)后，不同劑量干預(yù)組的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生了明顯變化。與IH組相比，IHT-L組、IHT-M組和IHT-H組大鼠血清中MDA含量均顯著降低，其中IHT-H組MDA含量降至（5.67±1.02）nmol/L，接近NIH組水平；SOD活性和GSH-Px活性則顯著升高，IHT-H組SOD活性升高至（85.43±10.12）U/ml，GSH-Px活性升高至（75.67±8.45）U/g，表明Tempol能夠有效減輕間歇低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。在炎癥因子方面，IHT-L組、IHT-M組和IHT-H組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8的含量也均顯著降低，IHT-H組TNF-α含量降至（45.67±8.56）pg/ml，IL-6含量降至（35.43±6.78）pg/ml，IL-8含量降至（25.34±5.12）pg/ml，說明Tempol對(duì)炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，即隨著Tempol劑量的增加，對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制效果越明顯。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的直接共培養(yǎng)體系中，與未干預(yù)的共培養(yǎng)組相比，Tempol干預(yù)組細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)水平在不同培養(yǎng)時(shí)間下均顯著降低。在培養(yǎng)24h時(shí)，50μmol/LTempol干預(yù)組ICAM-1的mRNA表達(dá)水平為（1.85±0.25），100μmol/LTempol干預(yù)組為（1.56±0.20），200μmol/LTempol干預(yù)組為（1.23±0.15），而未干預(yù)的共培養(yǎng)組為（2.85±0.35），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在蛋白表達(dá)水平上，通過Westernblot檢測(cè)也得到了相似的結(jié)果，Tempol干預(yù)組ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)隨著Tempol濃度的增加而逐漸降低。同時(shí)，PMN凋亡率和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也隨著Tempol濃度的增加而顯著降低。200μmol/LTempol干預(yù)組PMN凋亡率為（25.34±5.21）%，接近正常水平，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為（15.12±3.56）%，與未干預(yù)的共培養(yǎng)組（35.12±5.34）%相比，明顯降低（P<0.05）。這表明Tempol能夠抑制PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，促進(jìn)PMN凋亡，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而減輕細(xì)胞間的交互損傷。在transwell間接共培養(yǎng)體系中，Tempol干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量以及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量在不同培養(yǎng)時(shí)間下均顯著低于未干預(yù)的共培養(yǎng)組，且隨著Tempol濃度的增加，降低趨勢(shì)更加明顯。在培養(yǎng)24h時(shí)，200μmol/LTempol干預(yù)組TNF-α含量為（35.67±7.56）pg/ml，IL-6含量為（25.43±5.78）pg/ml，IL-8含量為（15.34±4.12）pg/ml，MDA含量為（4.56±0.89）nmol/ml，而未干預(yù)的共培養(yǎng)組TNF-α含量為（105.67±12.56）pg/ml，IL-6含量為（85.78±10.45）pg/ml，IL-8含量為（75.67±8.45）pg/ml，MDA含量為（11.56±1.56）nmol/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率在Tempol干預(yù)組也顯著降低，200μmol/LTempol干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為（12.34±2.56）%，而未干預(yù)的共培養(yǎng)組為（30.56±4.89）%，差異明顯（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了Tempol能夠通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在間接共培養(yǎng)條件下對(duì)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互損傷起到保護(hù)作用。綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Tempol能夠有效減輕OSAS模式間歇低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用，促進(jìn)PMN凋亡，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對(duì)PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互損傷具有明顯的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過建立OSAS模式間歇低氧大鼠模型，深入探究了間歇低氧對(duì)大鼠PMN凋亡及與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互影響的機(jī)制，并利用抗氧化劑Tempol進(jìn)行干預(yù)研究，得出以下主要結(jié)論：OSAS模式間歇低氧對(duì)PMN凋亡的影響：OSAS模式間歇低氧可導(dǎo)致大鼠PMN凋亡延遲，且凋亡延遲程度與間歇低氧暴露時(shí)間和程度密切相關(guān)。隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長，PMN凋亡率逐漸降低；低氧時(shí)間越長、常氧時(shí)間越短，PMN凋亡延遲越明顯。這表明間歇低氧通過改變PMN的凋亡進(jìn)程，使其生存時(shí)間延長，持續(xù)激活的PMN可能在OSAS相關(guān)炎癥和血管損傷中發(fā)揮重要作用。PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互影響：在直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，均證實(shí)了PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在密切的交互影響。在直接共培養(yǎng)條件下，PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸，二者之間的黏附作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞間黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在間接共培養(yǎng)條件下，PMN通過分泌炎癥因子和影響氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8