2023-07-20發(fā)布2023-09-20實(shí)施I州)生物技術(shù)有限公司?？刂浦行?、中國動物疫病預(yù)防控制中心、禾旭(鄭州)生物技術(shù)有限公司。對本文件的修改意見和建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局(烏魯木齊市天山區(qū)新華南路中國動物疫病預(yù)防控制中心(北京市大興區(qū)生物醫(yī)藥基地天貴大街17號)、禾旭(鄭州)生物技術(shù)有限公司(河南自貿(mào)試驗(yàn)區(qū)鄭州片區(qū)(經(jīng)開)第十五大街烘云路交匯處佳林國際4號樓1101室)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(新疆烏魯木齊市天山區(qū)新華南路167號新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：中國動物疫病預(yù)防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：102618禾旭(鄭州)生物技術(shù)有限公司聯(lián)系電話傳真郵編：450000新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：8300041本文件規(guī)定了馬傳染性貧血病毒抗體熒光層析檢測方法。本文件適用于馬屬動物血清中馬傳染性貧血病毒抗體的快速檢測。僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義病。產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，從而得出待測物濃度的檢測方法。檢測線發(fā)光值與質(zhì)控線發(fā)光值之比。采用雙抗原夾心檢測馬屬動物血清樣本中的馬傳染性貧血病毒抗體。當(dāng)血清樣本中抗體與熒光納米微球標(biāo)記的馬傳染性貧血抗原接觸反應(yīng)后形成抗原-抗體復(fù)合物，繼續(xù)與硝酸纖維素(NC)膜上檢測線(Text,簡稱T)包被的馬傳染性貧血特異性抗原反應(yīng)形成抗原-抗體-抗原復(fù)合物反應(yīng)，其余物質(zhì)繼續(xù)向2前層析在質(zhì)控線(Control,簡稱C)被馬傳染性貧血兔多抗捕獲形成復(fù)合物，最后用熒光免疫分析儀讀取檢測卡上的熒光信號。5儀器與試劑5.1.1便攜式熒光免疫分析儀，檢測波長為365/610nm。5.1.3分析天平：精度0.0001g。5.1.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速300g～8000g。5.1.5冰箱：2℃~8℃,-20℃。5.2.1實(shí)驗(yàn)用水：符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。5.2.2樣品稀釋液：見附錄A。5.2.3馬傳染性貧血病毒抗體熒光層析法檢測試劑卡：見附錄B。也可使用商品化馬傳染性貧血病毒血液樣品以3000g離心8min～10min,取上層血清用于檢測。血清應(yīng)清亮，無溶血，血清量大于血清樣品在2℃~8℃冷藏保存，如需長期保存應(yīng)置-20℃或-80℃。7操作步驟式熒光免疫分析儀連接成功。7.3取檢測卡3在室溫下從鋁箔包裝中取出檢測試劑卡，置于平整、潔凈的臺面上。7.4加樣及孵育7.5檢測讀值讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID卡插入便攜式熒光免疫分析儀，之后將檢測卡加樣口朝里放入便攜式熒光免疫分析儀檢測，5min內(nèi)完成讀值。8結(jié)果判定8.1試驗(yàn)成立條件用馬傳染性貧血標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測，T/C值<0.1時(shí)，試驗(yàn)成立。用標(biāo)準(zhǔn)馬傳染性貧血陽性血清檢測，T/C值≥0.1時(shí)，試驗(yàn)8.2.1當(dāng)陰性對照和陽性對照的檢測結(jié)果均成立，檢測結(jié)果有效。當(dāng)陰性或陽性對照的檢測結(jié)果不成立，表明操作過程不正確或檢測試劑卡已損壞、失效。8.2.2當(dāng)T/C值<0.1時(shí)，判為馬傳染性貧血病毒抗體陰性。當(dāng)T/C值≥0.1時(shí)，判為馬傳染性貧血9生物安全措施4(規(guī)范性)A.1樣品稀釋液稱取磷酸氫二鈉(十二水磷酸氫二鈉)3.0g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.5g,溶于純化水至800mL,再加入ProcLin-300400μL,純化水定容至1L,保存于4℃?zhèn)溆?。純化?自制1000.0g十二水磷酸氫二鈉17.0g二水磷酸二氫鈉0.414g保護(hù)劑2.0g海藻糖5.0gA.3馬傳貧病毒P26重組蛋白的制備A.3.1生產(chǎn)用菌液繁殖A.3.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將生產(chǎn)用菌液加入IPTG至終濃度為0.75mmoL/L,16℃下繼續(xù)誘導(dǎo)12h,收集誘導(dǎo)表達(dá)菌液。在2℃~8℃條件下，將誘導(dǎo)后的菌液以8000g離心10min,棄上清，收集菌體沉淀，用PBS(0.01moL/L,pH值7.4)洗菌體沉淀三次，以8000g離心10min,用6mLPBS(0.01moL/L,pH值7.4)重懸菌體沉淀，在150W功率的超聲波的作用下冰浴裂解，有效時(shí)間為10min,工作時(shí)間為5秒，間隔5秒。將超聲裂解物在2℃~8℃、以12000g離心15min,保留上清。將制備的上清穿過預(yù)處理過的樹脂柱，重復(fù)5次～7次，依次用10mmoL/L咪唑緩沖液、20mmoL/L袋中(8kd)浸泡在2L、0.1moL的PBS透析液中，每隔3h～4h換一次透析液，更換3次～4次，將純5(規(guī)范性)B.1試劑條制備測線工作液和質(zhì)控線工作液劃至硝酸纖維素(NC)膜上；采用熒光微