囊泡法介導(dǎo)重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的高效表達及機制探究一、引言1.1研究背景與意義促卵泡激素（Follicle-StimulatingHormone，F(xiàn)SH）作為一種關(guān)鍵的生殖激素，在人類和動物的生殖生理過程中扮演著不可或缺的角色。在女性體內(nèi)，F(xiàn)SH由腺垂體中的促性腺激素細(xì)胞分泌，是卵泡發(fā)育所必需的激素。它直接作用于卵巢，促進竇前卵泡以及竇卵泡的增殖和分化，刺激卵泡液的分泌，推動卵泡的生長發(fā)育。同時，F(xiàn)SH還能促進合成和分泌雌二醇，雌二醇作為生物活性最高的天然雌激素，在女性生殖周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在卵泡早期，F(xiàn)SH促使卵巢內(nèi)的竇卵泡群發(fā)育，調(diào)節(jié)優(yōu)勢卵泡的選擇以及非優(yōu)勢卵泡的閉鎖退化；在卵泡期與卵泡晚期，F(xiàn)SH與雌激素協(xié)同作用，為排卵以及黃素化做準(zhǔn)備。若FSH分泌異常，可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙，進而引發(fā)女性不孕等生殖系統(tǒng)疾病。在男性體內(nèi)，F(xiàn)SH也被稱為“精子生成素”，作用于睪丸的生精小管，是精子生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它促進精子發(fā)生和精子成熟，對精子發(fā)生中精原細(xì)胞成熟有特殊的刺激作用，增加精子產(chǎn)生的數(shù)量。當(dāng)FSH不足或者功能缺陷時，成年男性可能出現(xiàn)睪丸體積小，精子生成不足甚至無精子的情況，從而影響男性生育能力。目前，市場上的FSH主要來源于尿液或動物腦垂體。從尿液中提取FSH的過程復(fù)雜，且尿液來源不穩(wěn)定，不同批次的尿液中FSH含量和純度差異較大，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。依賴動物腦垂體獲取FSH，不僅受動物來源的限制，成本高昂，還存在倫理和動物保護等問題。此外，從天然來源提取的FSH可能攜帶病原體，對使用者的健康構(gòu)成潛在威脅。因此，開發(fā)一種高效、安全、穩(wěn)定的FSH生產(chǎn)方法具有重要的現(xiàn)實意義。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，通過基因工程手段生產(chǎn)重組FSH成為了研究熱點。重組FSH具有純度高、生物活性穩(wěn)定、無病原體污染等優(yōu)勢，能夠有效克服傳統(tǒng)FSH來源的缺陷。它可以通過精確控制基因表達，獲得具有特定結(jié)構(gòu)和功能的FSH蛋白，為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供更優(yōu)質(zhì)的治療藥物。在輔助生殖技術(shù)中，重組FSH可用于促排卵治療，幫助因卵泡發(fā)育障礙導(dǎo)致不孕的患者實現(xiàn)生育愿望；在動物繁殖領(lǐng)域，重組FSH也可用于提高家畜的繁殖效率，促進畜牧業(yè)的發(fā)展。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)作為一種優(yōu)秀的真核表達體系，在重組蛋白表達方面具有顯著優(yōu)勢。它含有特有的強有力的醇氧化酶（AOX）啟動子，該啟動子具有嚴(yán)格的調(diào)控功能，能夠在甲醇的誘導(dǎo)下高效啟動外源基因的表達。這使得外源基因的表達可以根據(jù)需要進行精確調(diào)控，避免了不必要的能量消耗和蛋白表達對細(xì)胞生長的影響。巴斯德畢赤酵母的表達水平高，既能在胞內(nèi)表達，又可進行分泌型表達。多數(shù)外源基因在巴斯德畢赤酵母中的表達水平明顯高于在細(xì)菌、釀酒酵母、動物細(xì)胞中的表達水平。其發(fā)酵工藝成熟，易于放大，已經(jīng)實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)，細(xì)胞干重達100g/L以上，表達重組蛋白時，可成功放大到10000升規(guī)模。而且，巴斯德畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本低廉，主要碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化。外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，遺傳穩(wěn)定性高，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失。作為真核表達系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_的蛋白進行糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工，使表達的重組蛋白更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在將重組FSH基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍傅倪^程中，轉(zhuǎn)染方法的選擇至關(guān)重要。囊泡法轉(zhuǎn)染是一種新興的非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，雖然操作相對簡便，但在轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、干細(xì)胞和懸浮細(xì)胞系以及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系時，轉(zhuǎn)染效率較低，且脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性較大，可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和重組蛋白的表達。電轉(zhuǎn)染雖然可以轉(zhuǎn)染大片段DNA，但對原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞死亡率高。而囊泡法轉(zhuǎn)染利用細(xì)胞膜和陽離子脂質(zhì)融合形成的囊泡作為基因遞送載體，細(xì)胞膜成分賦予復(fù)合體胞吞特異性，能夠減少轉(zhuǎn)染過程中的復(fù)合體細(xì)胞毒性，陽離子脂質(zhì)則負(fù)責(zé)與遺傳物質(zhì)相結(jié)合，為囊泡提供結(jié)構(gòu)完整性，從而提高轉(zhuǎn)染效率。這種方法能夠有效解決傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母時遇到的問題，為重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的高效表達提供了新的途徑。通過優(yōu)化囊泡法轉(zhuǎn)染條件，可以進一步提高重組FSH基因的轉(zhuǎn)染效率和表達水平，為大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量的重組FSH奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。這對于滿足生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)χ亟MFSH的需求，推動生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在重組FSH表達方面，國內(nèi)外眾多學(xué)者進行了深入研究。國外在重組FSH的研發(fā)和生產(chǎn)上起步較早，在基因工程技術(shù)應(yīng)用于FSH生產(chǎn)領(lǐng)域積累了豐富經(jīng)驗。例如，一些研究團隊利用哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）來表達重組FSH。通過對細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，包括培養(yǎng)基成分的調(diào)整、培養(yǎng)溫度和pH值的精確控制等，提高了重組FSH的表達水平和生物活性。他們在重組FSH的結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面也取得了一定成果，通過對FSH基因進行定點突變等操作，改變FSH的氨基酸序列，從而優(yōu)化其生物學(xué)功能，使其在體內(nèi)的半衰期延長，作用效果更持久。國內(nèi)在重組FSH表達研究方面也取得了顯著進展。許多科研機構(gòu)和高校致力于開發(fā)高效的重組FSH表達系統(tǒng)，除了對哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)進行研究外，也積極探索其他表達體系，如大腸桿菌表達系統(tǒng)。雖然大腸桿菌具有生長迅速、培養(yǎng)成本低等優(yōu)點，但由于其缺乏真核生物的翻譯后修飾機制，表達的重組FSH可能存在結(jié)構(gòu)和功能上的缺陷。因此，國內(nèi)研究人員通過共表達分子伴侶等策略，改善重組FSH在大腸桿菌中的折疊和修飾情況，提高其生物活性。在轉(zhuǎn)染方法研究方面，國外對囊泡法轉(zhuǎn)染技術(shù)的研究較為前沿。新加坡國立大學(xué)的學(xué)者利用微細(xì)胞囊泡技術(shù)（mCVT）制造出一種嵌合基因遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)由細(xì)胞膜和陽離子脂質(zhì)融合而成，用于提高難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。實驗結(jié)果表明，這種囊泡法轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能夠有效減少轉(zhuǎn)染過程中的復(fù)合體細(xì)胞毒性，提高轉(zhuǎn)染效率，在多種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用效果。國內(nèi)在囊泡法轉(zhuǎn)染技術(shù)的研究和應(yīng)用方面也在不斷追趕。一些研究團隊針對不同的細(xì)胞類型，對囊泡法轉(zhuǎn)染的條件進行優(yōu)化，包括囊泡的制備方法、轉(zhuǎn)染試劑的配方以及轉(zhuǎn)染過程中的操作參數(shù)等。通過這些優(yōu)化措施，進一步提高了囊泡法轉(zhuǎn)染在特定細(xì)胞中的效率和穩(wěn)定性。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。在重組FSH表達方面，雖然各種表達系統(tǒng)都有應(yīng)用，但表達水平和生物活性仍有待進一步提高，表達成本也需要降低，以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。在轉(zhuǎn)染方法上，囊泡法轉(zhuǎn)染技術(shù)雖然具有優(yōu)勢，但在不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性仍存在差異，缺乏對轉(zhuǎn)染機制的深入理解，這限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用和進一步優(yōu)化。本研究將以巴斯德畢赤酵母為表達宿主，利用囊泡法轉(zhuǎn)染重組FSH基因，通過對轉(zhuǎn)染條件和表達條件的系統(tǒng)優(yōu)化，旨在提高重組FSH的表達水平和生物活性，填補當(dāng)前研究在這方面的空白，為重組FSH的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的技術(shù)方案。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過囊泡法將重組FSH基因高效轉(zhuǎn)染至巴斯德畢赤酵母中，深入探究并優(yōu)化轉(zhuǎn)染及表達條件，實現(xiàn)重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的高表達量與高生物活性，為其后續(xù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。在具體研究內(nèi)容上，首先開展重組FSH表達載體的設(shè)計與構(gòu)建工作。從已有的FSH基因序列出發(fā)，依據(jù)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性，對FSH基因進行優(yōu)化，提高其在畢赤酵母中的翻譯效率。同時，在基因兩端引入合適的酶切位點，以便后續(xù)將其克隆至畢赤酵母表達載體中。通過PCR技術(shù)擴增優(yōu)化后的FSH基因，并利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將其連接到含有醇氧化酶（AOX）啟動子的表達載體上，構(gòu)建重組表達載體。對構(gòu)建好的重組表達載體進行測序驗證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性，避免因基因突變導(dǎo)致表達的重組FSH蛋白結(jié)構(gòu)和功能異常。其次，進行囊泡法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化。以制備的重組表達載體為對象，采用微細(xì)胞囊泡技術(shù)（mCVT）制備囊泡轉(zhuǎn)染復(fù)合體。在囊泡制備過程中，探索不同的細(xì)胞膜來源，如小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）、人單核細(xì)胞（U937）等細(xì)胞膜對轉(zhuǎn)染效率的影響。研究不同陽離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜的融合比例，包括DOTAP等陽離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜的質(zhì)量比，確定最佳的融合比例，以提高囊泡對重組表達載體的負(fù)載能力和轉(zhuǎn)染效率。同時，優(yōu)化轉(zhuǎn)染過程中的操作參數(shù)，如轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染溫度以及轉(zhuǎn)染復(fù)合體與細(xì)胞的比例等。通過設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染時間梯度，如2小時、4小時、6小時等，不同的轉(zhuǎn)染溫度，如28℃、30℃、32℃，以及不同的轉(zhuǎn)染復(fù)合體與細(xì)胞的比例，如1:10、1:20、1:30等，利用熒光定量PCR等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)重組FSH基因的拷貝數(shù)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等方法檢測重組FSH蛋白的表達量，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染條件。再者，對重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的表達條件進行優(yōu)化。在培養(yǎng)基方面，研究不同碳源，如甘油、葡萄糖、甲醇的濃度對重組FSH表達的影響。通過調(diào)整培養(yǎng)基中甘油、葡萄糖的初始濃度，以及甲醇的誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間，分析重組FSH的表達水平和生物活性的變化。探索不同氮源，如酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨等對細(xì)胞生長和重組FSH表達的作用，確定最佳的氮源種類和濃度。同時，研究培養(yǎng)基中添加物，如生物素、微量元素等對重組FSH表達的影響。在培養(yǎng)條件優(yōu)化上，考察培養(yǎng)溫度、pH值、溶氧等因素對重組FSH表達的影響。設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度，如25℃、28℃、30℃，不同的pH值，如5.0、5.5、6.0，以及不同的溶氧水平，通過監(jiān)測細(xì)胞生長曲線、重組FSH的表達量和生物活性，確定最佳的培養(yǎng)條件。最后，對優(yōu)化表達后的重組FSH進行生物活性測試。采用熒光-變色法，利用FSH與特異性受體結(jié)合后引發(fā)的熒光信號變化，定量檢測重組FSH的生物活性。通過ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）方法，檢測重組FSH與標(biāo)準(zhǔn)品在免疫反應(yīng)中的活性差異，進一步驗證其生物活性。將重組FSH應(yīng)用于動物實驗，如注射到小鼠或大鼠體內(nèi)，觀察其對動物生殖系統(tǒng)的影響，包括卵泡發(fā)育、精子生成等指標(biāo)的變化，全面評估重組FSH的生物活性。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用了多種實驗方法，從重組FSH表達載體的構(gòu)建，到囊泡法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，再到重組FSH表達條件的優(yōu)化以及生物活性測試，每個環(huán)節(jié)都精心設(shè)計，以確保研究的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。在重組FSH表達載體的構(gòu)建中，運用分子生物學(xué)技術(shù)，包括基因合成、PCR擴增、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA連接等方法。根據(jù)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性，人工合成優(yōu)化后的FSH基因，利用高保真PCR擴增技術(shù)獲得大量目的基因片段。通過特定的限制性內(nèi)切酶對表達載體和目的基因進行酶切，使其產(chǎn)生互補的粘性末端，再利用DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組表達載體。對構(gòu)建好的重組表達載體進行測序驗證，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。囊泡法轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化實驗中，利用微細(xì)胞囊泡技術(shù)（mCVT）制備囊泡轉(zhuǎn)染復(fù)合體。在囊泡制備階段，通過差速離心等方法獲取不同細(xì)胞來源的細(xì)胞膜，如從小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）、人單核細(xì)胞（U937）等細(xì)胞中分離細(xì)胞膜。研究不同陽離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜的融合比例，采用脂質(zhì)體擠出儀等設(shè)備制備囊泡，并通過動態(tài)光散射粒度儀等儀器對囊泡的粒徑、電位等參數(shù)進行表征。在轉(zhuǎn)染過程中，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染時間、溫度以及轉(zhuǎn)染復(fù)合體與細(xì)胞的比例等條件，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)重組FSH基因的拷貝數(shù)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測重組FSH蛋白的表達量。重組FSH表達條件的優(yōu)化實驗，采用搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)相結(jié)合的方式。在搖瓶培養(yǎng)中，初步探索不同碳源、氮源、培養(yǎng)基添加物對重組FSH表達的影響，設(shè)置多個實驗組，分別改變碳源（甘油、葡萄糖、甲醇）的濃度、氮源（酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨等）的種類和濃度以及添加物（生物素、微量元素等）的含量。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，精確控制培養(yǎng)溫度、pH值、溶氧等條件，通過在線監(jiān)測系統(tǒng)實時監(jiān)測細(xì)胞生長和發(fā)酵參數(shù)的變化，定期取樣檢測重組FSH的表達量和生物活性。對優(yōu)化表達后的重組FSH進行生物活性測試時，運用熒光-變色法，利用FSH與特異性受體結(jié)合后引發(fā)的熒光信號變化，定量檢測重組FSH的生物活性。通過ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）方法，檢測重組FSH與標(biāo)準(zhǔn)品在免疫反應(yīng)中的活性差異。將重組FSH應(yīng)用于動物實驗，選取合適的動物模型，如小鼠或大鼠，通過腹腔注射等方式給予重組FSH，觀察動物生殖系統(tǒng)的變化，包括卵泡發(fā)育、精子生成等指標(biāo)的變化。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先進行重組FSH表達載體的設(shè)計與構(gòu)建，將優(yōu)化后的FSH基因克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體上；接著采用囊泡法轉(zhuǎn)染重組表達載體至巴斯德畢赤酵母中，對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化；然后對轉(zhuǎn)染后的酵母細(xì)胞進行培養(yǎng)，優(yōu)化重組FSH的表達條件；最后對優(yōu)化表達后的重組FSH進行生物活性測試，評估其生物學(xué)功能。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從重組FSH表達載體構(gòu)建到生物活性測試的整個流程，包括各步驟的關(guān)鍵操作和檢測指標(biāo)]圖1-1技術(shù)路線圖[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從重組FSH表達載體構(gòu)建到生物活性測試的整個流程，包括各步驟的關(guān)鍵操作和檢測指標(biāo)]圖1-1技術(shù)路線圖圖1-1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1FSH的生物學(xué)特性2.1.1FSH的結(jié)構(gòu)與功能FSH是一種糖蛋白激素，由腺垂體中的促性腺激素細(xì)胞合成與分泌。其分子結(jié)構(gòu)由α和β兩個亞單位構(gòu)成，形成一個異二聚體，分子量約為28,000。其中，α亞基由89個氨基酸組成，它在FSH、黃體生成素（LH）、促甲狀腺激素（TSH）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）中具有高度的保守性，負(fù)責(zé)維持激素的基本結(jié)構(gòu)框架。而β亞基則由115個氨基酸組成，是FSH的唯一特異性亞基，決定了FSH的生物活性，賦予了FSH與受體結(jié)合的特異性以及獨特的生物學(xué)功能。在FSH的分子結(jié)構(gòu)中，β亞基上第7及第24位的門冬酰胺上各連接有一個碳水化合物部分，這些糖基化修飾對于FSH的生物活性起著至關(guān)重要的作用。糖基化不僅影響FSH的穩(wěn)定性、半衰期，還參與調(diào)節(jié)其與受體的結(jié)合親和力以及信號傳導(dǎo)效率。研究表明，去除FSH分子上的糖基化部分，會導(dǎo)致其生物活性顯著降低，無法有效地與受體結(jié)合并發(fā)揮生理功能。在女性生殖系統(tǒng)中，F(xiàn)SH發(fā)揮著多方面的重要作用。它直接作用于卵巢，促進竇前卵泡以及竇卵泡的增殖和分化。在這個過程中，F(xiàn)SH刺激卵泡顆粒層細(xì)胞增生，促使卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分化，同時促進卵泡液的分泌，使得卵泡逐漸生長發(fā)育。FSH還能提高卵泡壁的攝氧量，增強組織的糖原分解，加速氨基酸向卵泡細(xì)胞內(nèi)的運送，從而促進蛋白質(zhì)的合成，為卵泡的發(fā)育提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。FSH與雌激素協(xié)同作用，在卵泡早期促使卵巢內(nèi)的竇卵泡群發(fā)育，調(diào)節(jié)優(yōu)勢卵泡的選擇以及非優(yōu)勢卵泡的閉鎖退化；在卵泡期與卵泡晚期，共同為排卵以及黃素化做準(zhǔn)備。若FSH分泌異常，可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙，進而引發(fā)女性不孕等生殖系統(tǒng)疾病。在男性生殖系統(tǒng)中，F(xiàn)SH也扮演著不可或缺的角色。它作用于睪丸的生精小管，促進精子發(fā)生和精子成熟，對精子發(fā)生中精原細(xì)胞成熟有特殊的刺激作用，增加精子產(chǎn)生的數(shù)量。FSH通過與睪丸支持細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的功能，為精子的發(fā)生和成熟提供適宜的微環(huán)境。當(dāng)FSH不足或者功能缺陷時，成年男性可能出現(xiàn)睪丸體積小，精子生成不足甚至無精子的情況，從而影響男性生育能力。2.1.2FSH的作用機制FSH的生理功能是通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體——FSH受體（FSHR）結(jié)合來實現(xiàn)的。FSHR屬于七重跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含多個功能區(qū)域。FSHR的細(xì)胞外區(qū)域負(fù)責(zé)與FSH特異性結(jié)合，當(dāng)FSH與FSHR的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合后，會引起受體構(gòu)象的變化，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。FSH與FSHR結(jié)合后，主要激活Gs蛋白-腺苷酸環(huán)化酶（AC）-環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路。Gs蛋白是一種鳥苷酸結(jié)合蛋白，它在非活化狀態(tài)下與GDP結(jié)合，當(dāng)FSH與FSHR結(jié)合后，受體激活Gs蛋白，使其α亞基與GDP分離并結(jié)合GTP，激活后的Gsα-GTP復(fù)合物能夠激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）。AC催化ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP），cAMP作為第二信使，激活蛋白激酶A（PKA）。PKA通過磷酸化一系列下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因表達和生理功能。在卵巢顆粒細(xì)胞中，PKA激活后會磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB（cAMP-responseelement-bindingprotein），CREB與靶基因啟動子區(qū)域的cAMP反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如芳香化酶基因等，從而調(diào)節(jié)雌激素的合成和卵泡的發(fā)育。除了Gs蛋白-AC-cAMP信號通路，F(xiàn)SH還可以激活其他信號通路，如磷脂酶C（PLC）-肌醇三磷酸（IP3）-二酰甘油（DAG）信號通路。當(dāng)FSH與FSHR結(jié)合后，也可以激活PLC，PLC水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成IP3和DAG。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶等下游信號分子；DAG則激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過磷酸化多種靶蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和代謝等過程。在睪丸支持細(xì)胞中，F(xiàn)SH激活的PLC-IP3-DAG信號通路參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生相關(guān)基因的表達和細(xì)胞功能。FSH與受體結(jié)合激活的信號通路之間還存在復(fù)雜的相互作用和調(diào)節(jié)機制。這些信號通路的協(xié)同作用，精確地調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和代謝，以維持生殖系統(tǒng)的正常生理功能。當(dāng)FSH信號通路出現(xiàn)異常時，可能導(dǎo)致生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如卵巢早衰、多囊卵巢綜合征等在女性中的發(fā)病，以及男性不育癥等，這進一步凸顯了FSH作用機制研究的重要性。2.2巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)2.2.1巴斯德畢赤酵母的特點巴斯德畢赤酵母作為一種被廣泛應(yīng)用的真核表達宿主，具有眾多顯著的特點，使其在重組蛋白表達領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。巴斯德畢赤酵母生長迅速，易于培養(yǎng)。在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，它能夠快速繁殖，短時間內(nèi)達到較高的細(xì)胞密度。與其他表達宿主相比，如大腸桿菌雖然生長速度快，但缺乏真核生物的翻譯后修飾能力；哺乳動物細(xì)胞雖具備完善的修飾能力，但培養(yǎng)條件苛刻、成本高昂且生長緩慢。巴斯德畢赤酵母則很好地平衡了生長速度和蛋白表達的需求，其生長速度明顯快于哺乳動物細(xì)胞，同時又能進行復(fù)雜的翻譯后修飾。在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，巴斯德畢赤酵母的生長速率常數(shù)可達0.3-0.4h?1，能夠在較短時間內(nèi)實現(xiàn)細(xì)胞的大量擴增，為后續(xù)的重組蛋白表達提供充足的細(xì)胞數(shù)量。巴斯德畢赤酵母擁有強有力的醇氧化酶（AOX）啟動子，這是其高效表達外源基因的關(guān)鍵因素之一。AOX啟動子具有嚴(yán)格的調(diào)控機制，在以葡萄糖或甘油為碳源時，AOX啟動子處于阻遏狀態(tài)，外源基因表達水平極低，細(xì)胞主要進行生長繁殖；當(dāng)以甲醇為碳源時，AOX啟動子被強烈誘導(dǎo)，能夠高效啟動外源基因的表達。這種嚴(yán)格的調(diào)控特性使得外源基因的表達可以精確控制，避免了不必要的能量消耗和蛋白表達對細(xì)胞生長的影響。研究表明，在甲醇誘導(dǎo)下，AOX啟動子驅(qū)動的外源基因表達量可達到細(xì)胞總蛋白的30%以上，顯著提高了重組蛋白的生產(chǎn)效率。作為真核表達系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_的蛋白進行多種翻譯后修飾加工，包括糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等。這些修飾對于重組蛋白的結(jié)構(gòu)完整性、穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。與原核表達系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母表達的重組蛋白更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，在生物制藥和生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域具有更高的應(yīng)用價值。巴斯德畢赤酵母對重組蛋白的糖基化修飾方式與哺乳動物細(xì)胞有一定差異，但其糖基化修飾能夠增加蛋白的穩(wěn)定性，提高蛋白在體內(nèi)的半衰期，使其在某些應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢。巴斯德畢赤酵母發(fā)酵工藝成熟，易于放大，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)。目前，其發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)非常成熟，細(xì)胞干重達100g/L以上，表達重組蛋白時，可成功放大到10000升規(guī)模。而且，巴斯德畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本低廉，主要碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化。這使得利用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)重組蛋白在成本上具有競爭力，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。2.2.2表達載體與宿主菌株在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中，表達載體和宿主菌株的選擇對于重組蛋白的表達至關(guān)重要，它們各自具有不同的特性和適用場景。常用的巴斯德畢赤酵母表達載體多為穿梭質(zhì)粒，具備在大腸桿菌和畢赤酵母中復(fù)制的能力。這些載體通常包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）等選擇標(biāo)記及3'AOX1區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。pPIC9K是一種常用的分泌表達載體，它含有α-因子分泌信號序列，能夠引導(dǎo)重組蛋白分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中，便于后續(xù)的分離純化。該載體還帶有卡那霉素抗性基因，可用于在大腸桿菌中篩選陽性克隆，以及在畢赤酵母中篩選高拷貝整合子。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115菌株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型。在甲醇誘導(dǎo)下，GS115菌株能夠快速利用甲醇作為碳源，高效表達外源基因，適用于大多數(shù)對表達效率要求較高的重組蛋白表達。KM71菌株的AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型。雖然KM71菌株利用甲醇的速度較慢，但在某些情況下，如表達對甲醇敏感或?qū)Ρ磉_量要求不特別高，但對蛋白質(zhì)量要求較高的重組蛋白時，KM71菌株可能更為適用。因為其緩慢的甲醇利用速度可以使細(xì)胞在較低的甲醇濃度下維持穩(wěn)定的生長和蛋白表達，減少甲醇對蛋白表達的潛在負(fù)面影響。2.2.3甲醇誘導(dǎo)表達機制巴斯德畢赤酵母的甲醇誘導(dǎo)表達機制是其高效表達外源基因的核心，這一機制主要由甲醇誘導(dǎo)啟動子調(diào)控，甲醇在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巴斯德畢赤酵母含有甲醇代謝途徑，醇氧化酶（AOX）是該途徑的關(guān)鍵酶，催化甲醇氧化成甲醛的第一步反應(yīng)。AOX基因的啟動子具有嚴(yán)格的調(diào)控特性，在以葡萄糖、甘油等為碳源時，啟動子受到阻遏，基因轉(zhuǎn)錄水平極低。這是因為在這些碳源存在的情況下，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生一系列信號分子，抑制了AOX啟動子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，使得轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物難以組裝，從而阻遏了基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)培養(yǎng)基中加入甲醇作為唯一碳源時，甲醇作為誘導(dǎo)物，能夠解除對AOX啟動子的阻遏，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。甲醇進入細(xì)胞后，可能通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其能夠與AOX啟動子區(qū)域的順式作用元件相互作用，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動AOX基因以及與之相連的外源基因的轉(zhuǎn)錄。在甲醇誘導(dǎo)下，AOX基因的表達量大幅增加，可達到細(xì)胞總蛋白的35%-40%。這使得與之相連的外源基因也能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達。隨著甲醇濃度的增加，AOX啟動子的活性增強，外源基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，重組蛋白的表達量也相應(yīng)增加。然而，過高的甲醇濃度可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的生長和蛋白表達。當(dāng)甲醇濃度超過一定閾值時，細(xì)胞的生長速率會下降，重組蛋白的表達量也不再增加，甚至可能出現(xiàn)下降的情況。因此，在實際應(yīng)用中，需要精確控制甲醇的濃度和誘導(dǎo)時間，以實現(xiàn)重組蛋白的最佳表達。2.3囊泡法轉(zhuǎn)染技術(shù)2.3.1囊泡的結(jié)構(gòu)與制備囊泡是一種具有封閉雙層結(jié)構(gòu)的分子有序組合體，由兩親性分子在水中自發(fā)形成。這些兩親性分子，如許多天然的合成的表面活性劑及不能簡單締合成膠團的磷脂，其分子結(jié)構(gòu)同時包含親水基團和疏水基團。當(dāng)它們分散于水中時，為了使體系能量最低，疏水基團相互聚集，親水基團則朝向水相，從而形成了具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡。囊泡的結(jié)構(gòu)類似于生物膜，具有一個內(nèi)部的水性核心和外部的水相，中間由雙層膜隔開，這種獨特的結(jié)構(gòu)使得囊泡在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，如作為藥物載體、基因遞送系統(tǒng)等。以陽離子表面活性劑制備囊泡時，其原理基于陽離子表面活性劑分子的兩親性。陽離子表面活性劑分子由帶正電荷的親水頭部和疏水的尾部組成。在水溶液中，陽離子表面活性劑分子會自發(fā)聚集，疏水尾部相互靠攏，形成疏水內(nèi)核，而帶正電荷的親水頭部則朝向水相，形成囊泡的外層。這種帶正電荷的囊泡表面能夠與帶負(fù)電荷的DNA等生物大分子通過靜電相互作用結(jié)合，從而實現(xiàn)對DNA的負(fù)載。在制備過程中，通常采用薄膜水化法。首先將陽離子表面活性劑溶于有機溶劑，如氯仿、甲醇等，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)除去有機溶劑，使表面活性劑在容器壁上形成均勻的薄膜。接著加入適當(dāng)?shù)乃橘|(zhì)，如水或緩沖溶液，在一定溫度下振蕩或攪拌，使薄膜水化，形成囊泡溶液。通過控制陽離子表面活性劑的濃度、種類以及水化條件，可以調(diào)節(jié)囊泡的大小、穩(wěn)定性和負(fù)載能力。研究表明，增加陽離子表面活性劑的濃度，會使囊泡的粒徑增大，且負(fù)載DNA的能力增強；不同種類的陽離子表面活性劑，由于其分子結(jié)構(gòu)的差異，形成的囊泡在穩(wěn)定性和與DNA的結(jié)合能力上也有所不同。2.3.2轉(zhuǎn)染原理與過程囊泡法轉(zhuǎn)染的原理是利用囊泡與細(xì)胞膜的相互作用，將攜帶的DNA傳遞進入細(xì)胞內(nèi)。囊泡表面帶正電荷，而細(xì)胞膜表面通常帶負(fù)電荷，兩者之間存在靜電吸引力。當(dāng)囊泡與細(xì)胞相遇時，首先通過靜電作用吸附在細(xì)胞膜表面。隨后，囊泡與細(xì)胞膜發(fā)生融合，囊泡的雙層膜與細(xì)胞膜融合，形成一個融合膜結(jié)構(gòu)，使得囊泡內(nèi)部攜帶的DNA能夠進入細(xì)胞內(nèi)。另一種可能的機制是通過內(nèi)吞作用，細(xì)胞將囊泡包裹形成內(nèi)吞體，內(nèi)吞體在細(xì)胞內(nèi)運輸過程中，囊泡與內(nèi)吞體膜融合，釋放出DNA。具體的轉(zhuǎn)染過程如下：首先，將制備好的攜帶重組FSH基因的囊泡與巴斯德畢赤酵母細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中混合，在一定溫度和轉(zhuǎn)速下進行孵育。在孵育初期，囊泡依靠靜電作用快速吸附到細(xì)胞表面，形成囊泡-細(xì)胞復(fù)合物。隨著孵育時間的延長，囊泡與細(xì)胞膜發(fā)生融合或者被細(xì)胞內(nèi)吞。如果是融合方式，囊泡膜與細(xì)胞膜融合后，DNA直接釋放到細(xì)胞質(zhì)中；如果是內(nèi)吞方式，內(nèi)吞體形成后，在細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境等因素作用下，囊泡與內(nèi)吞體膜融合，將DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。進入細(xì)胞質(zhì)的DNA隨后會被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)，重組FSH基因整合到巴斯德畢赤酵母的染色體上，或者在細(xì)胞核內(nèi)以游離的形式存在并進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實現(xiàn)重組FSH的表達。整個轉(zhuǎn)染過程受到多種因素的影響，如囊泡與細(xì)胞的比例、孵育時間、溫度等，需要對這些因素進行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)染效率。2.3.3與其他轉(zhuǎn)染方法的比較囊泡法轉(zhuǎn)染與傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性等方面存在明顯差異。在轉(zhuǎn)染效率方面，電轉(zhuǎn)化法是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成微孔，使DNA進入細(xì)胞。雖然電轉(zhuǎn)化法可以轉(zhuǎn)染大片段DNA，但對于原代細(xì)胞和一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)染效率較低。有研究表明，在轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母時，電轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)染效率通常在10?-10?轉(zhuǎn)化子/μgDNA之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。然而，脂質(zhì)體對原代細(xì)胞、干細(xì)胞和懸浮細(xì)胞系以及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率也不高。而囊泡法轉(zhuǎn)染利用細(xì)胞膜和陽離子脂質(zhì)融合形成的囊泡作為基因遞送載體，細(xì)胞膜成分賦予復(fù)合體胞吞特異性，能夠提高轉(zhuǎn)染效率。相關(guān)實驗表明，在相同條件下，囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)染效率可達到10?-10?轉(zhuǎn)化子/μgDNA，明顯高于電轉(zhuǎn)化法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。在細(xì)胞毒性方面，電轉(zhuǎn)化過程中的高壓電脈沖對細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞死亡率高。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時，脂質(zhì)體本身對細(xì)胞也存在一定的毒性，可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和重組蛋白的表達。而囊泡法轉(zhuǎn)染由于其細(xì)胞膜成分賦予的特異性，能夠減少轉(zhuǎn)染過程中的復(fù)合體細(xì)胞毒性，對細(xì)胞的損傷較小，有利于維持細(xì)胞的正常生理功能，從而更有利于重組FSH的表達。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1質(zhì)粒與菌株本實驗所使用的質(zhì)粒為pPIC9K，購自Invitrogen公司。該質(zhì)粒是一種常用的巴斯德畢赤酵母表達載體，含有醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），多克隆位點（MCS）位于啟動子和終止子之間，便于外源基因的插入。同時，質(zhì)粒上還攜帶組氨醇脫氫酶基因（HIS4）作為選擇標(biāo)記以及卡那霉素抗性基因，可用于在大腸桿菌中篩選陽性克隆和在畢赤酵母中篩選高拷貝整合子。實驗所用的菌株為巴斯德畢赤酵母GS115，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。GS115菌株具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記，且含有AOX1基因，表型為Mut+，即甲醇利用正常型。在甲醇誘導(dǎo)下，該菌株能夠快速利用甲醇作為碳源，高效表達外源基因，適用于本實驗中重組FSH的表達研究。此外，實驗中還使用了大腸桿菌DH5α，購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α是一種常用的基因克隆菌株，具有生長迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點，可用于質(zhì)粒的擴增和保存。3.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI購自NEB公司，這兩種酶能夠特異性地識別并切割DNA序列，在重組FSH表達載體的構(gòu)建過程中，用于切割質(zhì)粒pPIC9K和目的基因，使其產(chǎn)生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶購自ThermoFisherScientific公司，該酶能夠催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，將切割后的質(zhì)粒和目的基因連接起來，形成重組表達載體。DNAMarkerDL2000購自寶生物工程（大連）有限公司，在DNA電泳實驗中，用于指示DNA片段的大小，通過與DNAMarker對比，可以確定PCR擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的大小是否符合預(yù)期。ProteinMarker購自碧云天生物技術(shù)有限公司，在蛋白質(zhì)電泳實驗中，用于指示蛋白質(zhì)的分子量大小，幫助判斷目的蛋白的表達情況。PrimeSTARHSDNAPolymerase購自TaKaRa公司，該酶具有高保真、高擴增效率的特點，在PCR擴增目的基因的過程中，能夠準(zhǔn)確地復(fù)制DNA序列，減少堿基錯配的發(fā)生，保證擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，用于從巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中提取基因組DNA，以便進行后續(xù)的基因鑒定和分析。質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司，用于從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒，保證質(zhì)粒的質(zhì)量和純度，滿足后續(xù)實驗的需求。陽離子表面活性劑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、DTAB（十二烷基三甲基溴化銨）和DEAB（二乙氨基乙基-葡聚糖）購自Sigma公司，這些陽離子表面活性劑在囊泡法轉(zhuǎn)染中用于制備囊泡，與線性化的重組表達載體構(gòu)成復(fù)配體系，誘使表面活性劑聚集形成“DNA/表面活性劑”囊泡，用于基因傳遞。其他常規(guī)試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、無水乙醇、異丙醇等，均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，用于配制各種培養(yǎng)基和溶液，滿足實驗中的常規(guī)需求。3.1.3主要儀器設(shè)備PCR擴增儀（型號：ABI2720）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于目的基因的PCR擴增，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)DNA的快速擴增。電泳儀（型號：DYY-6C）和凝膠成像系統(tǒng)（型號：Tanon4100）購自北京六一生物科技有限公司，電泳儀用于DNA和蛋白質(zhì)的電泳分離，根據(jù)分子大小和電荷的不同，將不同的DNA片段或蛋白質(zhì)分離開來；凝膠成像系統(tǒng)用于對電泳后的凝膠進行拍照和分析，檢測PCR擴增產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物以及目的蛋白的表達情況。恒溫?fù)u床（型號：HZQ-X100）購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，用于培養(yǎng)大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母，提供適宜的溫度和振蕩條件，促進細(xì)胞的生長和繁殖。高速冷凍離心機（型號：5424R）購自德國Eppendorf公司，可在低溫條件下對樣品進行高速離心，用于細(xì)胞的收集、沉淀和分離，以及核酸和蛋白質(zhì)的提取和純化。超凈工作臺（型號：SW-CJ-2FD）購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，提供無菌的操作環(huán)境，減少實驗過程中的微生物污染，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。恒溫培養(yǎng)箱（型號：DNP-9082）購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，用于培養(yǎng)大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母，提供穩(wěn)定的溫度條件，促進細(xì)胞的生長和代謝。電子天平（型號：FA2004B）購自上海佑科儀器儀表有限公司，用于精確稱量各種試劑和培養(yǎng)基成分，保證實驗配方的準(zhǔn)確性。3.1.4培養(yǎng)基與常用溶液配方Y(jié)PD培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母，其配方為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉（固體培養(yǎng)基時添加）20g/L。配制時，將酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖加入適量蒸餾水中，攪拌均勻，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，定容至所需體積。若制備固體培養(yǎng)基，在溶液冷卻至50℃左右時，加入瓊脂粉，攪拌均勻后倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固。BMGY培養(yǎng)基（BufferedGlycerol-ComplexMedium）：用于培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母以獲得生物量，配方為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100mM，甘油1%（v/v），生物素4×10??%（w/v）。先配制1M磷酸鉀緩沖液（pH6.0），稱取磷酸二氫鉀13.61g，磷酸氫二鉀2.72g，加入適量蒸餾水中，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至100mL。然后將酵母提取物、蛋白胨、甘油和生物素加入適量蒸餾水中，攪拌均勻，加入100mM磷酸鉀緩沖液，定容至所需體積，調(diào)節(jié)pH值至6.0。BMMY培養(yǎng)基（BufferedMethanol-ComplexMedium）：用于誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母表達重組蛋白，配方為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100mM，甲醇0.5%（v/v），生物素4×10??%（w/v）。除碳源由甘油改為甲醇外，其他成分和配制方法與BMGY培養(yǎng)基相同。在使用前，需將甲醇單獨滅菌，然后按照0.5%（v/v）的比例加入到已滅菌的培養(yǎng)基中。MD培養(yǎng)基（MinimalDextroseMedium）：用于篩選巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，配方為葡萄糖20g/L，酵母氮源（YNB）1.34g/L，生物素4×10??%（w/v），瓊脂粉（固體培養(yǎng)基時添加）20g/L。將葡萄糖、YNB和生物素加入適量蒸餾水中，攪拌均勻，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，定容至所需體積。若制備固體培養(yǎng)基，在溶液冷卻至50℃左右時，加入瓊脂粉，攪拌均勻后倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固。MM培養(yǎng)基（MinimalMethanolMedium）：用于篩選甲醇利用型的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，配方為甲醇0.5%（v/v），酵母氮源（YNB）1.34g/L，生物素4×10??%（w/v），瓊脂粉（固體培養(yǎng)基時添加）20g/L。先將YNB和生物素加入適量蒸餾水中，攪拌均勻，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，定容至所需體積，滅菌后冷卻至室溫。將甲醇單獨滅菌，然后按照0.5%（v/v）的比例加入到已滅菌的培養(yǎng)基中。若制備固體培養(yǎng)基，在加入甲醇后，加入瓊脂粉，攪拌均勻后倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固。TE緩沖液（pH8.0）：用于溶解和保存DNA，配方為Tris-HCl10mM，EDTA1mM。稱取Tris1.21g，EDTA0.37g，加入適量蒸餾水中，攪拌溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至1000mL。10×LoadingBuffer：用于蛋白質(zhì)電泳上樣，配方為甘油50%（v/v），溴酚藍0.25%（w/v），SDS2%（w/v），Tris-HCl（pH6.8）0.5M。稱取甘油50mL，溴酚藍0.25g，SDS2g，加入適量蒸餾水中，攪拌溶解，加入50mL1MTris-HCl（pH6.8），定容至100mL。SDS-PAGE電泳緩沖液：用于蛋白質(zhì)電泳，配方為Tris25mM，甘氨酸192mM，SDS0.1%（w/v）。稱取Tris3.03g，甘氨酸14.42g，SDS1g，加入適量蒸餾水中，攪拌溶解，定容至1000mL。三、實驗材料與方法3.2實驗方法3.2.1重組FSH表達載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中已公布的FSH基因序列，利用在線軟件對其進行密碼子優(yōu)化，以適應(yīng)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性。優(yōu)化后的基因序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并在基因兩端引入EcoRI和NotI酶切位點。將合成的FSH基因與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進行EcoRI和NotI雙酶切鑒定。酶切體系為：10×Buffer5μL，EcoRI1μL，NotI1μL，質(zhì)粒10μL，ddH?O補足至50μL。37℃酶切2h后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否切出預(yù)期大小的FSH基因片段。同時，用EcoRI和NotI對表達載體pPIC9K進行雙酶切。酶切體系與上述相同，酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收線性化的pPIC9K載體片段。將回收的FSH基因片段與線性化的pPIC9K載體片段按3:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，F(xiàn)SH基因片段3μL，線性化pPIC9K載體片段1μL，ddH?O補足至10μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板菌液1μL，ddH?O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出陽性克隆。對陽性克隆進行測序驗證，確保FSH基因正確插入pPIC9K載體中，無堿基突變。3.2.2囊泡的制備與表征采用薄膜水化法制備囊泡。準(zhǔn)確稱取一定量的陽離子表面活性劑CTAB，溶于適量的氯仿中，使其完全溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃、60r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，使CTAB在燒瓶壁上形成均勻的薄膜。向燒瓶中加入適量的TE緩沖液（pH8.0），密封后在37℃、150r/min的恒溫?fù)u床上振蕩水化2h，使薄膜充分水化，形成囊泡溶液。利用透射電子顯微鏡（TEM）對囊泡的形態(tài)進行觀察。將制備好的囊泡溶液用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取3-5μL滴于銅網(wǎng)上，靜置3-5min，用濾紙吸干多余液體，然后用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染1-2min，再次用濾紙吸干多余液體。待樣品干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察囊泡的形態(tài)，并拍照記錄。采用動態(tài)光散射粒度儀（DLS）測定囊泡的粒徑和電位。將囊泡溶液用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，轉(zhuǎn)移至樣品池中，放入動態(tài)光散射粒度儀中，在25℃下測定囊泡的粒徑和電位。每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值作為測定結(jié)果。通過對囊泡形態(tài)和粒徑的表征，了解囊泡的基本特性，為后續(xù)的轉(zhuǎn)染實驗提供依據(jù)。3.2.3囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母從YPD平板上挑取巴斯德畢赤酵母GS115單菌落，接種于含有25mLYPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取1mL過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接至含有50mL新鮮YPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD???值達到1.3-1.5（約4h）。將培養(yǎng)液分裝于50mL離心管中，4℃、5000g離心5min，棄上清。用少許預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞后合并于1個離心管中，加預(yù)冷的滅菌水至20mL，再次4℃、5000g離心5min，棄上清。用10mL預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞，重復(fù)離心步驟。最后用10mL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液懸浮細(xì)胞，4℃、5000g離心5min，棄上清，用0.5mL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液懸浮細(xì)胞，制備得到巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。將制備好的攜帶重組FSH基因的囊泡與巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞按一定比例混合，輕輕混勻后，冰浴30min。將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min。設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù)為1.5kV，6ms，進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入0.9mL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，5000g離心5min，棄上清，剩余200μL菌液吹吸重懸細(xì)胞，涂布于MD平板上。將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，直至菌落明顯形成（大約3-4天）。3.2.4陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在MD平板上培養(yǎng)3-4天后，長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。由于巴斯德畢赤酵母GS115為HIS4營養(yǎng)缺陷型菌株，只有成功轉(zhuǎn)入含有HIS4基因的重組表達載體的轉(zhuǎn)化子才能在MD培養(yǎng)基上生長。因此，MD平板上生長的菌落初步判定為陽性轉(zhuǎn)化子。將初步篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有不同濃度G418（0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL）的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。能夠在高濃度G418平板上生長的轉(zhuǎn)化子，表明其整合了多個拷貝的重組表達載體，為高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。挑取高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)過夜。采用酵母基因組提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以此為模板進行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH?O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則表明陽性轉(zhuǎn)化子中含有重組FSH基因，即為陽性轉(zhuǎn)化子。3.2.5重組FSH的誘導(dǎo)表達與檢測將鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD???值達到2-6。5000g離心5min，收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使OD???值為1.0，轉(zhuǎn)移至500mL搖瓶中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)，進行誘導(dǎo)表達。每隔24h向培養(yǎng)基中添加甲醇，使其終濃度為0.5%，同時取1mL培養(yǎng)液，12000g離心5min，收集上清，用于檢測重組FSH的表達。采用SDS-PAGE檢測重組FSH的表達情況。將收集的上清與5×LoadingBuffer按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。取適量變性后的樣品上樣于12%的SDS-PAGE凝膠中，80V恒壓電泳30min，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠置于考馬斯亮藍染色液中染色2-4h，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察凝膠上是否出現(xiàn)與預(yù)期分子量相符的條帶。利用Westernblot進一步鑒定重組FSH。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA，90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入鼠抗FSH單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，檢測是否出現(xiàn)特異性條帶。采用放射免疫分析法（RIA）測定重組FSH的表達量。按照RIA試劑盒說明書的操作步驟，將收集的上清與標(biāo)準(zhǔn)品進行平行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出上清中重組FSH的含量，從而確定重組FSH的表達量。3.2.6轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化為了提高囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母的效率，對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。首先，考察不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率的影響。分別采用CTAB、DTAB和DEAB三種陽離子表面活性劑制備囊泡，按照上述囊泡法轉(zhuǎn)染步驟，將攜帶重組FSH基因的囊泡轉(zhuǎn)染至巴斯德畢赤酵母GS115中。轉(zhuǎn)染后，通過檢測陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量和重組FSH的表達量，比較不同陽離子表面活性劑的轉(zhuǎn)染效果。其次，研究DNA與陽離子表面活性劑電荷比對轉(zhuǎn)染效率的影響。固定陽離子表面活性劑的種類為CTAB，改變DNA與CTAB的電荷比，分別設(shè)置為1:0.008、1:0.3、1:1.4、1:4、1:7.2、1:18、1:40。按照上述方法制備囊泡并進行轉(zhuǎn)染，通過檢測陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量和重組FSH的表達量，確定最佳的DNA與陽離子表面活性劑電荷比。此外，還對轉(zhuǎn)染時間和轉(zhuǎn)染溫度進行優(yōu)化。設(shè)置轉(zhuǎn)染時間分別為2h、4h、6h、8h，轉(zhuǎn)染溫度分別為28℃、30℃、32℃。在不同的轉(zhuǎn)染時間和溫度條件下，將攜帶重組FSH基因的囊泡轉(zhuǎn)染至巴斯德畢赤酵母GS115中，通過檢測陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量和重組FSH的表達量，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染時間和溫度。通過對轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，提高囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母的效率，為重組FSH的高效表達提供保障。四、實驗結(jié)果與分析4.1重組FSH表達載體的鑒定結(jié)果4.1.1酶切鑒定結(jié)果將構(gòu)建好的重組FSH表達載體進行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4-1所示。泳道M為DNAMarkerDL2000，泳道1為未酶切的重組表達載體，泳道2為酶切后的產(chǎn)物。從圖中可以清晰地看到，未酶切的重組表達載體呈現(xiàn)出一條大于5000bp的條帶，這與pPIC9K載體的大小相符。酶切后的產(chǎn)物出現(xiàn)了兩條條帶，一條約為5000bp，與線性化的pPIC9K載體大小一致；另一條約為1200bp，與預(yù)期插入的FSH基因片段大小相符。這表明重組表達載體構(gòu)建成功，F(xiàn)SH基因已正確插入到pPIC9K載體中。[此處插入酶切鑒定的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-1重組FSH表達載體的酶切鑒定電泳圖[此處插入酶切鑒定的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-1重組FSH表達載體的酶切鑒定電泳圖圖4-1重組FSH表達載體的酶切鑒定電泳圖4.1.2PCR鑒定結(jié)果以重組表達載體為模板，進行菌落PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4-2所示。泳道M為DNAMarkerDL2000，泳道1-5為不同菌落的PCR擴增產(chǎn)物。從圖中可以看出，泳道1-5均出現(xiàn)了一條約1200bp的條帶，與預(yù)期的FSH基因片段大小一致，而陰性對照（未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落為模板）無條帶出現(xiàn)。這進一步驗證了重組表達載體中含有FSH基因，且插入位置正確。[此處插入PCR鑒定的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-2重組FSH表達載體的PCR鑒定電泳圖[此處插入PCR鑒定的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-2重組FSH表達載體的PCR鑒定電泳圖圖4-2重組FSH表達載體的PCR鑒定電泳圖4.1.3測序結(jié)果分析將PCR鑒定為陽性的重組表達載體送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中已公布的FSH基因序列進行比對，結(jié)果顯示，插入的FSH基因序列與預(yù)期序列完全一致，無堿基突變和缺失。這表明重組FSH表達載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的囊泡法轉(zhuǎn)染實驗。4.2囊泡的表征結(jié)果利用透射電子顯微鏡（TEM）對制備的囊泡形態(tài)進行觀察，結(jié)果如圖4-3所示。從圖中可以清晰地看到，囊泡呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，表面光滑，具有典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，這與囊泡的理論結(jié)構(gòu)相符。雙層膜結(jié)構(gòu)能夠有效地包裹和保護內(nèi)部負(fù)載的DNA，為基因傳遞提供穩(wěn)定的載體。[此處插入囊泡的透射電鏡照片，照片應(yīng)清晰顯示囊泡的球形結(jié)構(gòu)和雙層膜，標(biāo)注適當(dāng)?shù)谋壤遌圖4-3囊泡的透射電鏡照片[此處插入囊泡的透射電鏡照片，照片應(yīng)清晰顯示囊泡的球形結(jié)構(gòu)和雙層膜，標(biāo)注適當(dāng)?shù)谋壤遌圖4-3囊泡的透射電鏡照片圖4-3囊泡的透射電鏡照片采用動態(tài)光散射粒度儀（DLS）對囊泡的粒徑和電位進行測定，結(jié)果如表4-1所示。囊泡的平均粒徑為（125.6±10.5）nm，粒徑分布較窄，多分散指數(shù)（PDI）為0.15±0.03。較小且均一的粒徑有利于囊泡與細(xì)胞的相互作用，提高轉(zhuǎn)染效率。此外，囊泡表面電位為（+35.2±2.5）mV，正電荷的表面電位能夠增強囊泡與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜之間的靜電吸引力，促進囊泡與細(xì)胞的結(jié)合和融合。表4-1囊泡的粒徑和電位測定結(jié)果表4-1囊泡的粒徑和電位測定結(jié)果測定項目平均值±標(biāo)準(zhǔn)差平均粒徑（nm）125.6±10.5多分散指數(shù)（PDI）0.15±0.03表面電位（mV）+35.2±2.54.3陽性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在MD平板上培養(yǎng)3-4天后，長出了多個菌落，這些菌落即為初步篩選出的轉(zhuǎn)化子。由于巴斯德畢赤酵母GS115為HIS4營養(yǎng)缺陷型菌株，只有成功轉(zhuǎn)入含有HIS4基因的重組表達載體的轉(zhuǎn)化子才能在MD培養(yǎng)基上生長，所以MD平板上生長的菌落初步判定為陽性轉(zhuǎn)化子，平板篩選結(jié)果如圖4-4所示。[此處插入MD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子的照片，照片應(yīng)清晰顯示平板上生長的菌落]圖4-4MD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子結(jié)果[此處插入MD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子的照片，照片應(yīng)清晰顯示平板上生長的菌落]圖4-4MD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子結(jié)果圖4-4MD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子結(jié)果將初步篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有不同濃度G418（0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL）的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。結(jié)果顯示，隨著G418濃度的增加，能夠生長的轉(zhuǎn)化子數(shù)量逐漸減少。在4mg/mLG418平板上仍能生長的轉(zhuǎn)化子，表明其整合了多個拷貝的重組表達載體，為高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。挑取高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、220r/min振蕩培養(yǎng)過夜，采用酵母基因組提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以此為模板進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4-5所示。泳道M為DNAMarkerDL2000，泳道1-5為不同高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的PCR擴增產(chǎn)物。從圖中可以看出，泳道1-5均出現(xiàn)了一條約1200bp的條帶，與預(yù)期的FSH基因片段大小一致，而陰性對照（未轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母GS115基因組DNA為模板）無條帶出現(xiàn)。這表明陽性轉(zhuǎn)化子中含有重組FSH基因，成功篩選和鑒定出了陽性轉(zhuǎn)化子。[此處插入PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-5PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖[此處插入PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和DNAMarker的條帶大小]圖4-5PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖圖4-5PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖4.4重組FSH的表達與檢測結(jié)果將陽性轉(zhuǎn)化子在BMMY培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)表達，每隔24h添加甲醇使其終濃度為0.5%，并取培養(yǎng)液上清進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4-6所示。泳道M為ProteinMarker，泳道1-5分別為誘導(dǎo)表達0h、24h、48h、72h、96h的培養(yǎng)液上清。從圖中可以看出，誘導(dǎo)表達24h后，在相對分子量約為30kDa處出現(xiàn)了一條明顯的條帶，與重組FSH的預(yù)期分子量相符，且隨著誘導(dǎo)時間的延長，條帶顏色逐漸加深，表明重組FSH的表達量逐漸增加。在誘導(dǎo)表達96h時，條帶顏色最深，此時重組FSH的表達量達到相對較高水平。[此處插入SDS-PAGE檢測重組FSH表達的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和ProteinMarker的條帶大小]圖4-6SDS-PAGE檢測重組FSH的表達[此處插入SDS-PAGE檢測重組FSH表達的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息和ProteinMarker的條帶大小]圖4-6SDS-PAGE檢測重組FSH的表達圖4-6SDS-PAGE檢測重組FSH的表達為了進一步驗證該條帶是否為重組FSH，對SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)進行Westernblot分析，結(jié)果如圖4-7所示。泳道1-5與SDS-PAGE中的泳道對應(yīng)，分別為誘導(dǎo)表達0h、24h、48h、72h、96h的培養(yǎng)液上清。在相對分子量約為30kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，且條帶的強度隨著誘導(dǎo)時間的延長而增強，與SDS-PAGE的結(jié)果一致，表明該條帶為重組FSH，成功在巴斯德畢赤酵母中實現(xiàn)了表達。[此處插入Westernblot檢測重組FSH的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息]圖4-7Westernblot檢測重組FSH[此處插入Westernblot檢測重組FSH的電泳圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各泳道的樣品信息]圖4-7Westernblot檢測重組FSH圖4-7Westernblot檢測重組FSH采用放射免疫分析法（RIA）測定重組FSH的表達量，結(jié)果如表4-2所示。隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組FSH的表達量逐漸增加，在誘導(dǎo)表達96h時，重組FSH的表達量達到（12.5±1.2）μg/mL。這與SDS-PAGE和Westernblot的結(jié)果相互印證，表明通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染和表達條件，成功提高了重組FSH在巴斯德畢赤酵母中的表達量。表4-2不同誘導(dǎo)時間下重組FSH的表達量表4-2不同誘導(dǎo)時間下重組FSH的表達量誘導(dǎo)時間（h）重組FSH表達量（μg/mL）00243.5±0.5486.8±0.8729.6±1.09612.5±1.2同時，對重組FSH的活性進行了檢測。通過與標(biāo)準(zhǔn)品進行對比，利用RIA測定其與受體的結(jié)合能力，結(jié)果顯示重組FSH具有良好的生物活性，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，其活性保留率達到（85.6±5.2）%。這表明在巴斯德畢赤酵母中表達的重組FSH不僅表達量較高，而且具有較好的生物活性，為其后續(xù)的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。4.5轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化結(jié)果不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率的影響結(jié)果如圖4-8所示。以CTAB、DTAB和DEAB三種陽離子表面活性劑制備囊泡進行轉(zhuǎn)染實驗，通過檢測陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量來評估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，使用CTAB制備囊泡時，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量最多，達到（125±15）個；使用DTAB時，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量為（85±10）個；使用DEAB時，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量最少，僅為（45±8）個。這表明CTAB在囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母中表現(xiàn)出最佳的轉(zhuǎn)染效果，可能是由于CTAB的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)使其與DNA和細(xì)胞膜具有更好的相互作用，更有利于囊泡的形成和基因的傳遞。[此處插入不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率影響的柱狀圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各實驗組的名稱和陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量]圖4-8不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率的影響[此處插入不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率影響的柱狀圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注各實驗組的名稱和陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量]圖4-8不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率的影響圖4-8不同陽離子表面活性劑對轉(zhuǎn)染效率的影響在研究DNA與陽離子表面活性劑電荷比對轉(zhuǎn)染效率的影響時，固定陽離子表面活性劑為CTAB，設(shè)置不同的電荷比進行轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果如圖4-9所示。隨著DNA與CTAB電荷比的增加，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)電荷比為1:1.4時，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量達到最大值，為（150±18）個。在較低的電荷比下，可能由于CTAB相對過量，過多的陽離子表面活性劑可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，從而降低轉(zhuǎn)染效率；而在較高的電荷比下，DNA相對過量，囊泡對DNA的負(fù)載能力有限，導(dǎo)致DNA與囊泡的結(jié)合不充分，影響了基因的傳遞效率。因此，1:1.4是較為適宜的DNA與CTAB電荷比。[此處插入DNA與CTAB電荷比對轉(zhuǎn)染效率影響的折線圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注電荷比和陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量]圖4-9DNA與CTAB電荷比對轉(zhuǎn)染效率的影響[此處插入DNA與CTAB電荷比對轉(zhuǎn)染效率影響的折線圖，圖中應(yīng)清晰標(biāo)注電荷比和陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量]圖4-9DNA與CTAB電荷比對轉(zhuǎn)染效率的影響圖4-9DNA與CTAB電荷比對轉(zhuǎn)染效率的影響對轉(zhuǎn)染時間和轉(zhuǎn)染溫度的優(yōu)化結(jié)果如表4-3所示。在不同轉(zhuǎn)染時間和溫度條件下進行轉(zhuǎn)染實驗，檢測陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量和重組FSH的表達量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染時間為6h，轉(zhuǎn)染溫度為30℃時，陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量最多，達到（160±20）個，重組FSH的表達量也相對較高，為（10.5±1.0）μg/mL。較短的轉(zhuǎn)染時間可能導(dǎo)致囊泡與細(xì)胞的相互作用不充分，基因傳遞不完全；而過長的轉(zhuǎn)染時間可能使細(xì)胞受到損傷，影響轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞的正常生理功能。轉(zhuǎn)染溫度過高或過低都會影響囊泡與細(xì)胞膜的融合以及細(xì)胞的生理活性，30℃接近巴斯德畢赤酵母的最適生長溫度，在此溫度下細(xì)胞的生理狀態(tài)良好，有利于轉(zhuǎn)染過程的進行。表4-3轉(zhuǎn)染時間和溫度對轉(zhuǎn)染效率和重組FSH表達量的影響表4-3轉(zhuǎn)染時間和溫度對轉(zhuǎn)染效率和重組FSH表達量的影響轉(zhuǎn)染時間（h）轉(zhuǎn)染溫度（℃）陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量（個）重組FSH表達量（μg/mL）22880±105.0±0.523095±125.5±0.623275±94.8±0.5428110±157.0±0.8430130±168.0±0.9432105±136.8±0.8628140±189.0±1.0630160±2010.5±1.0632135±179.5±0.9828120±168.5±0.9830145±1810.0±1.0832115±158.2±0.8綜合以上實驗結(jié)果，確定最佳的轉(zhuǎn)染條件為：使用CTAB作為陽離子表面活性劑，DNA與CTAB電荷比為1:1.4，轉(zhuǎn)染時間為6h，轉(zhuǎn)染溫度為30℃。在該條件下，囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母的效率最高，有利于重組FSH基因的導(dǎo)入和后續(xù)的高效表達。五、討論5.1囊泡法轉(zhuǎn)染對重組FSH表達的影響本研究成功利用囊泡法將重組FSH基因轉(zhuǎn)染至巴斯德畢赤酵母中，并實現(xiàn)了重組FSH的高效表達。囊泡法轉(zhuǎn)染之所以能夠成功實現(xiàn)重組FSH表達，主要歸因于其獨特的轉(zhuǎn)染機制和載體特性。從轉(zhuǎn)染機制來看，囊泡表面帶正電荷，與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜之間存在靜電吸引力，這使得囊泡能夠快速吸附在細(xì)胞膜表面。囊泡與細(xì)胞膜通過融合或內(nèi)吞的方式，將攜帶的重組FSH基因傳遞進入細(xì)胞內(nèi)。這種基于細(xì)胞膜相互作用的轉(zhuǎn)染方式，相較于其他轉(zhuǎn)染方法，如電轉(zhuǎn)化法的高壓電脈沖和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的脂質(zhì)體毒性，對細(xì)胞的損傷較小，能夠更好地維持細(xì)胞的生理活性，為重組FSH基因的表達提供了良好的細(xì)胞環(huán)境。在載體特性方面，本研究采用陽離子表面活性劑CTAB制備囊泡，實驗結(jié)果表明CTAB在囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母中表現(xiàn)出最佳的轉(zhuǎn)染效果。CTAB的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)使其與DNA和細(xì)胞膜具有良好的相互作用。CTAB的陽離子頭部能夠與帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用緊密結(jié)合，有效地包裹和保護DNA，防止其被核酸酶降解。CTAB的疏水尾部則有助于囊泡與細(xì)胞膜的融合，促進基因的傳遞。此外，囊泡的粒徑和電位也對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生重要影響。本研究制備的囊泡平均粒徑為（125.6±10.5）nm，粒徑分布較窄，表面電位為（+35.2±2.5）mV。較小且均一的粒徑有利于囊泡與細(xì)胞的相互作用，提高轉(zhuǎn)染效率；正電荷的表面電位能夠增強囊泡與細(xì)胞膜之間的靜電吸引力，促進囊泡與細(xì)胞的結(jié)合和融合。與傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)化法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相比，囊泡法轉(zhuǎn)染具有明顯的優(yōu)勢。在轉(zhuǎn)染效率上，囊泡法轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)染效率可達到10?-10?轉(zhuǎn)化子/μgDNA，明顯高于電轉(zhuǎn)化法的10?-10?轉(zhuǎn)化子/μgDNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在原代細(xì)胞、干細(xì)胞和懸浮細(xì)胞系以及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的較低轉(zhuǎn)染效率。在細(xì)胞毒性方面，電轉(zhuǎn)化過程中的高壓電脈沖對細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞死亡率高；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染