蛋白質檢測技術操作手冊引言蛋白質作為生命活動的主要承擔者，其定性與定量分析是生命科學研究、臨床診斷、藥物開發(fā)及食品工業(yè)等領域不可或缺的基礎技術手段。本手冊旨在系統(tǒng)介紹實驗室中常用的蛋白質檢測技術，包括分光光度法定量、電泳分離與鑒定等核心方法，為相關實驗操作人員提供標準化的操作指引和注意事項，以確保實驗結果的準確性、重復性與可靠性。本手冊適用于具備基本生物化學實驗技能的科研人員及實驗室技術人員。在進行任何實驗操作前，請務必熟悉相關原理、試劑特性及安全規(guī)范。第一部分：分光光度法定量檢測分光光度法基于蛋白質分子對特定波長光的吸收特性或其與顯色試劑的特異性反應產物的吸光度進行定量，具有操作簡便、快速的特點。1.1Lowry法（福林-酚試劑法）1.1.1原理概述蛋白質中的肽鍵在堿性條件下與銅離子形成絡合物，進而將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑）還原，產生藍色化合物。在一定濃度范圍內，藍色深淺與蛋白質含量成正比，于特定波長（通常650nm或750nm）處測定吸光度。1.1.2主要試劑與器材試劑A（堿性銅溶液）：含碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉。試劑B（福林-酚試劑）：市售或自行配制，使用前需按說明稀釋。標準蛋白質溶液：如牛血清白蛋白（BSA），梯度濃度。待測蛋白質樣品。分光光度計、恒溫水浴鍋、微量移液器、離心管、試管等。1.1.3操作步驟1.標準曲線制備：取潔凈試管若干，分別加入梯度濃度的標準蛋白質溶液及適量蒸餾水補足體積。各管加入試劑A，混勻，室溫放置（或按特定溫度保溫）一定時間?？焖偌尤脒m量試劑B，立即混勻，避免局部濃度過高。于規(guī)定溫度下保溫顯色特定時間。2.樣品測定：待測樣品按適當比例稀釋，確保其濃度落在標準曲線線性范圍內。其余操作同標準曲線制備。3.吸光度測定：以空白管（不含蛋白質的試劑溶液）調零，在選定波長處測定各管吸光度。4.結果計算：以標準蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。根據樣品吸光度，從標準曲線上查得對應蛋白質濃度，再乘以稀釋倍數(shù)。1.1.4注意事項試劑B加入后應迅速混勻，其在堿性條件下易分解。顯色反應受溫度、時間影響較大，應嚴格控制反應條件。許多物質如酚類、游離氨基酸、還原劑等可能干擾測定，需確保樣品無此類干擾物或進行預處理。1.2BCA法（二喹啉甲酸法）1.2.1原理概述在堿性環(huán)境中，蛋白質將Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑（二喹啉甲酸）結合形成穩(wěn)定的紫色復合物，于562nm處有最大吸收峰。該復合物的吸光度與蛋白質濃度成正比。1.2.2主要試劑與器材BCA工作液：由BCA試劑A與試劑B按比例混合而成（通常50:1）。標準蛋白質溶液（如BSA）。待測蛋白質樣品。分光光度計、恒溫水浴鍋或酶標儀、微量移液器、96孔板或試管。1.2.3操作步驟1.標準曲線制備與樣品處理：設置標準蛋白梯度濃度管和樣品管，用緩沖液調整體積一致。2.顯色反應：各管加入適量BCA工作液，充分混勻。置于規(guī)定溫度（如37℃或室溫）水浴中保溫特定時間，或根據試劑盒說明進行。3.吸光度測定：冷卻至室溫（若加熱），以空白調零，測定562nm處吸光度。4.結果計算：同Lowry法。1.2.4注意事項BCA法對樣品中去污劑（如SDS）的兼容性較好，但高濃度還原劑（如DTT）仍有干擾。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，混合均勻。確保顯色時間和溫度的一致性，以保證標準曲線的線性和樣品測定的準確性。1.3Bradford法（考馬斯亮藍法）1.3.1原理概述考馬斯亮藍G-250在酸性條件下呈棕紅色，與蛋白質結合后轉變?yōu)樗{色，最大吸收峰從465nm轉移至595nm。在一定范圍內，595nm處的吸光度與蛋白質濃度成正比。1.3.2主要試劑與器材Bradford試劑：考馬斯亮藍G-250溶于磷酸及乙醇（或甲醇）溶液。標準蛋白質溶液（如BSA）。待測蛋白質樣品。分光光度計、微量移液器、離心管、試管或96孔板。1.3.3操作步驟1.標準曲線制備與樣品處理：制備標準蛋白質濃度梯度，樣品適當稀釋。2.顯色反應：各管加入適量Bradford試劑，立即混勻。室溫放置一定時間（通常5-15分鐘），使顯色穩(wěn)定。3.吸光度測定：以空白調零，測定595nm處吸光度。4.結果計算：同前。1.3.4注意事項此法靈敏度高，但對不同蛋白質的響應可能存在差異。強酸性緩沖液、去污劑可能影響顯色，樣品緩沖體系應盡量簡單。顯色反應較快，但需注意顯色穩(wěn)定時間窗口，避免超過最佳測定時間?？捡R斯亮藍試劑有一定毒性，操作時避免接觸皮膚，廢液需妥善處理。第二部分：電泳技術分離與鑒定電泳技術利用蛋白質分子在電場中泳動速度的差異進行分離，是蛋白質分析的核心手段，可用于分子量測定、純度分析及樣品制備。2.1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）2.1.1原理概述十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種陰離子去污劑，能與蛋白質結合，使蛋白質分子帶上大量負電荷，并破壞其天然構象，形成具有恒定電荷/質量比的桿狀顆粒。在聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）的分子篩效應下，蛋白質的泳動速度主要取決于其分子量大小，從而實現(xiàn)分離。2.1.2主要試劑與器材丙烯酰胺（Acr）、N,N'-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）：凝膠單體與交聯(lián)劑。Tris-HCl緩沖液（不同pH值，用于配制濃縮膠、分離膠及電泳緩沖液）。SDS、過硫酸銨（APS，引發(fā)劑）、四甲基乙二胺（TEMED，加速劑）。上樣緩沖液：含SDS、β-巰基乙醇（或DTT，還原劑）、溴酚藍（指示劑）、甘油。電泳緩沖液：含Tris、甘氨酸、SDS。蛋白質分子量標準品。待測蛋白質樣品。垂直板電泳槽及電源、制膠模具、微量移液器、搖床、染色與脫色液（如考馬斯亮藍R-250、脫色液）。2.1.3操作步驟1.凝膠制備：根據分離蛋白質的分子量范圍，選擇合適濃度的分離膠（如10%、12%）。按配方依次混合分離膠緩沖液、Acr/Bis混合液、去離子水、APS、TEMED，迅速混勻后注入制膠模具，上層覆蓋一層水或異丙醇以隔絕空氣并使膠面平整。待分離膠完全聚合后，傾去上層覆蓋液，用去離子水沖洗膠面。配制濃縮膠，按配方混合各組分，注入分離膠上層，插入梳子，待濃縮膠聚合。2.樣品處理與上樣：待測樣品與上樣緩沖液按比例混合，沸水浴加熱一定時間使蛋白質變性。凝膠聚合完成后，小心拔出梳子，將凝膠板裝入電泳槽，加入電泳緩沖液，確保沒過電極。用微量移液器將處理好的標準品及樣品分別加入樣品孔中。3.電泳：連接電源，設定初始電壓（恒壓或恒流），待溴酚藍指示劑進入分離膠后，調整至目標電壓/電流。電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部附近時停止。4.染色與脫色：卸下凝膠，放入考馬斯亮藍染色液中，室溫或37℃染色一定時間（如1-2小時或過夜）。棄去染色液，用脫色液浸泡凝膠，期間更換脫色液數(shù)次，直至背景清晰，蛋白條帶顯現(xiàn)。2.1.4注意事項Acr和Bis具有神經毒性，操作時務必佩戴手套和口罩，稱量在通風櫥內進行。APS和TEMED應新鮮配制或正確儲存，以保證凝膠聚合效率。制膠過程中避免氣泡產生，梳子插入時應垂直且無氣泡。樣品變性要充分，但加熱時間不宜過長，以防蛋白質降解。電泳緩沖液可重復使用1-2次，但離子強度會下降，需注意觀察。2.2蛋白質印跡（WesternBlotting）2.2.1原理概述WesternBlotting是將SDS分離的蛋白質條帶通過電泳轉移至固相支持膜（如硝酸纖維素膜NC或聚偏氟乙烯膜PVDF）上，然后利用特異性抗體檢測目標蛋白質的技術。它結合了電泳的高分辨率和抗原抗體反應的高特異性，可對目標蛋白進行定性和半定量分析。2.2.2主要試劑與器材SDS分離的蛋白質凝膠及對應的蛋白質樣品。轉移緩沖液：含Tris、甘氨酸，通常加入甲醇。固相支持膜、濾紙。封閉液：含脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的緩沖液（如TBST）。一抗（特異性識別目標蛋白的抗體）、二抗（偶聯(lián)有酶或熒光基團的抗一抗的抗體）。洗滌緩沖液（如TBST：含Tris、NaCl、Tween-20）。顯色底物：根據二抗標記物選擇，如HRP標記二抗對應ECL化學發(fā)光底物或DAB顯色液；AP標記對應BCIP/NBT底物。轉膜裝置（半干轉或濕轉）、雜交袋/培養(yǎng)皿、搖床、成像系統(tǒng)（化學發(fā)光儀或凝膠成像儀）。2.2.3操作步驟1.轉膜：根據凝膠大小裁剪膜和濾紙，PVDF膜需先用甲醇浸泡活化。按“海綿-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿”的順序在轉膜夾中組裝“三明治”，確保各層對齊、無氣泡。將轉膜夾放入轉膜槽，根據膜的類型和目標蛋白分子量設置轉膜條件（電流、電壓、時間）。濕轉通常需要冰浴降溫。2.封閉：轉膜完成后，取出膜，用TBST短暫洗滌。將膜放入封閉液中，室溫或4℃搖床孵育一定時間，以封閉膜上非特異性結合位點。3.抗體孵育：一抗孵育：棄去封閉液，加入用封閉液或專用抗體稀釋液按適當比例稀釋的一抗，室溫孵育或4℃過夜，緩慢搖動。洗滌：用TBST洗滌膜數(shù)次，每次一定時間，以去除未結合的一抗。二抗孵育：加入稀釋好的二抗，室溫孵育一定時間，緩慢搖動。洗滌：用TBST徹底洗滌膜，次數(shù)較一抗洗滌更多，確保背景降低。4.顯色與檢測：根據二抗標記選擇合適的顯色方法。如化學發(fā)光法，將膜與ECL底物反應后，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影；如顯色底物法，將膜與底物溶液反應，直至條帶清晰，蒸餾水終止反應。2.2.4注意事項轉膜效率是關鍵，需優(yōu)化轉膜時間、電流/電壓，可通過預染Marker監(jiān)測轉膜效果。一抗和二抗的稀釋比例、孵育時間和溫度需根據抗體特性及說明書優(yōu)化。封閉不充分或洗滌不徹底會導致高背景；抗體濃度過高或孵育時間過長也可能增加非特異性信號。PVDF膜較NC膜結合力強，但脆性大，操作時需輕柔。顯色反應需注意觀察，避免過曝或顯色過度。第三部分：通用注意事項與實驗安全3.1實驗設計與準備實驗前應充分理解實驗目的、原理及各步驟關鍵點，熟悉所用試劑的安全數(shù)據表（SDS）。合理規(guī)劃實驗，確保所有試劑、器材齊全且在有效期內。標準品應正確儲存和稀釋，避免反復凍融。樣品制備過程中應注意保持蛋白質的穩(wěn)定性，避免降解或變性（除非實驗設計需要）。3.2操作規(guī)范嚴格按照試劑說明書或本手冊規(guī)定的步驟操作，不得隨意更改試劑比例、反應溫度和時間等關鍵參數(shù)。使用移液計時，選擇合適量程，確保操作規(guī)范，避免交叉污染。同一實驗應使用同一批次移液器吸頭。分光光度計、電泳儀等精密儀器應定期校準，使用后及時清潔保養(yǎng)。實驗數(shù)據應及時、準確記錄，包括樣品信息、試劑批號、儀器參數(shù)、觀察現(xiàn)象等。3.3安全防護實驗時應穿著實驗服，佩戴一次性手套、護目鏡，必要時佩戴口罩。接觸有毒、腐蝕性或揮發(fā)性試劑時，務必在通風櫥內操作。廢棄試劑和耗材應分類收集，按照實驗室規(guī)定進行處理，不得隨意丟棄。實驗結束后，及時清潔實驗臺面，洗手消毒。結語蛋白質檢測技術是生命科學研究的基石。本手冊所涵蓋的分光光度法定量和電泳分析技術，