《傳染性胰臟壞死病診斷方法》

征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

一、工作簡(jiǎn)況（包括任務(wù)來(lái)源、制定背景、起草過(guò)程等）

（一）任務(wù)來(lái)源

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目信息：2024年1月2日，傳染性胰臟壞死病診斷方法（計(jì)劃號(hào)：

20233360-T-326）修訂工作正式啟動(dòng)，歸口單位為全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)，主管部門(mén)

為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，項(xiàng)目周期16個(gè)月，2024年12月27日前完成組織起草，2025年4月28日前完成

報(bào)批。

本標(biāo)準(zhǔn)是修訂原國(guó)標(biāo)《GB/T15085.1-2008魚(yú)類檢疫方法第1部分：傳染性胰臟壞死病

毒（IPNV）》，由全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站申請(qǐng)修訂。修訂后的標(biāo)

準(zhǔn)名稱為：傳染性胰臟壞死病診斷方法GB/T15085.1-202X。起草單位為：全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推

廣總站、北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所。依據(jù)GB/T1.1-2020

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》中的要求進(jìn)行編寫(xiě)。

（二)制定背景

1、傳染性胰臟壞死病的危害性

傳染性胰臟壞死?。↖nfectiouspancreaticnecrosis,IPN）是一種嚴(yán)重危害漁業(yè)生產(chǎn)，可

造成鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的魚(yú)類疫病。IPN最早發(fā)生在加拿大、美國(guó)，隨著水產(chǎn)品貿(mào)易

的增加，擴(kuò)散至世界各地。在20世紀(jì)80年代傳入我國(guó)，遼寧、山西、山東、甘肅等我國(guó)虹

鱒產(chǎn)區(qū)均有IPN發(fā)生，造成流行區(qū)域虹鱒的大規(guī)模死亡，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于IPN嚴(yán)

重危害性，在我國(guó)被列為三類動(dòng)物疫病，國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃中規(guī)定的專項(xiàng)調(diào)查對(duì)

象。

IPN主要感染虹鱒Oncorhynchusmykiss，由于毒株、宿主和環(huán)境因素的不同，可造成虹

鱒10﹪～90﹪的死亡率，急性感染時(shí)累計(jì)死亡率可達(dá)100﹪。發(fā)病魚(yú)體色發(fā)黑、眼突出、

腹部膨大、皮膚和鰭條出血、腸內(nèi)無(wú)食物且充滿了黃色黏液，胃幽門(mén)部出血。組織病理變

化為胰腺組織壞死，細(xì)胞壞死；黏膜上皮壞死；腸系膜，胰腺泡壞死，脂肪病變。大多數(shù)

急性感染的魚(yú)都出現(xiàn)上述病癥。被感染了的成年魚(yú)則沒(méi)有病理解剖學(xué)上的變化。

該病呈急性流行，且發(fā)病后殘存未死的魚(yú)可數(shù)年以上直到終身帶毒，依然能夠傳播病

毒。目前，國(guó)內(nèi)虹鱒苗種場(chǎng)陽(yáng)性率較高，近5年來(lái)國(guó)內(nèi)虹鱒場(chǎng)陽(yáng)性檢出率均在10%以上，且

1

分布地域較廣（北京、河北、山西、山東、遼寧、吉林、黑龍江、甘肅、青海、云南等），

目前及未來(lái)一段時(shí)間我國(guó)虹鱒養(yǎng)殖業(yè)，尤其是苗種產(chǎn)業(yè)會(huì)受到較大影響，全國(guó)范圍內(nèi)虹鱒

苗種發(fā)生IPV風(fēng)險(xiǎn)較高。

2、IPN病原簡(jiǎn)介

IPN病原為傳染性胰臟壞死病毒（Infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV），IPNV特點(diǎn)

之一是非常穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境的抵抗力極強(qiáng)。在水中能存活一年以上，且有非常廣泛的宿主。

另一特點(diǎn)是對(duì)三個(gè)月以內(nèi)的虹鱒魚(yú)苗有極強(qiáng)的殺傷力，可達(dá)到較高的死亡率，由此可導(dǎo)致

無(wú)法提供足夠的虹鱒苗種。

IPNV屬于雙鏈RNA病毒科，水生雙鏈RNA病毒屬，病毒顆粒呈20面體，無(wú)囊膜，有92

個(gè)殼粒。衣殼內(nèi)有由2個(gè)片段組成的雙股RNA基因，片段A編碼一個(gè)多聚蛋白，包括VP2、

VP3、VP4,并通過(guò)間隔的ORF編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白VP5。其中，VP2蛋白是IPNV的主要外衣

殼蛋白，含有病毒的主要抗原決定簇，并含有病毒特異性中和抗原表位，常作為IPNV的診

斷及疫苗研究的主要靶點(diǎn)。IPNV分離株含有10個(gè)血清型，包括A組血清型A1（West

Buxton,WB）、A2（Spajarup,Sp）、A3（Abild,Ab）、A4（Hecht,He）、A5（Tellina,Te）、

A6（Canada,C1）、A7（Canada2,C2）、A8（Canada3,C3）、A9（Jasper,Ja），B組血清型

B1（Tellinavirus,TV-1），根據(jù)IPNV的多聚蛋白氨基酸序列，IPNV分為6個(gè)基因簇（Genogroup

1-6）。不同IPN病毒株對(duì)鱒魚(yú)的毒力相差很大。國(guó)際上公認(rèn)的強(qiáng)毒株是歐洲的sp株（即A2

血清型或基因5型）和美洲的VR299株（即A9血清型或基因1型）。我國(guó)目前流行的IPNV基

因型為5型和1型，其中5型對(duì)應(yīng)的是A2血清型（即sp株），是強(qiáng)毒株；而1型對(duì)應(yīng)2個(gè)血清型，

一個(gè)是強(qiáng)毒株（VR299），1個(gè)是弱毒株（WB）。

3、修訂國(guó)標(biāo)的必要性

IPN診斷主要依賴于對(duì)IPNV的檢測(cè)?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15805.1-2008《魚(yú)類檢疫方

法第1部分：傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）》，采用CHSE、PG、RTG-2細(xì)胞分離病毒，

病魚(yú)組織接種細(xì)胞3～4天即出現(xiàn)明顯的CPE(細(xì)胞破碎、崩解)；再用中和試驗(yàn)或ELISA方法

進(jìn)一步鑒定。2000年版世界動(dòng)物衛(wèi)生組織OIE發(fā)布的《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》，關(guān)于IPN

的診斷技術(shù)，也是采取細(xì)胞分離IPN病毒后，再采取中和試驗(yàn)或ELISA等免疫學(xué)技術(shù)鑒定。

由于IPN在世界范圍分布廣泛，從2008年起將IPN診斷相關(guān)章節(jié)從OIE《水生動(dòng)物疾病診斷

手冊(cè)》中移除。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB/T15805.1-2008就是參考2000年版OIE手冊(cè)相關(guān)章節(jié)編制而成。

由于較多水生動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室不具備抗體制備技術(shù)，或不熟悉免疫學(xué)技術(shù)，且

IPNV鑒定采用的中和試驗(yàn)、ELISA的檢測(cè)方法，操作相對(duì)繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，因此開(kāi)展IPNV檢

2

測(cè)時(shí)采用國(guó)標(biāo)方法的實(shí)驗(yàn)室僅選擇性采用細(xì)胞分離病毒部分，較少采用中和試驗(yàn)、ELISA

等檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定，而是選擇分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。

國(guó)內(nèi)外已有多篇關(guān)于IPNV分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究報(bào)道；起草單位關(guān)于IPNV分子生

物學(xué)檢測(cè)也開(kāi)展了多年的研究工作，有較好的研究基礎(chǔ)，研制的成果已經(jīng)用于國(guó)家水生動(dòng)

物疫病監(jiān)測(cè)工作中。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室對(duì)IPNV分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的需求，本項(xiàng)目申

請(qǐng)對(duì)原國(guó)標(biāo)進(jìn)行修訂，標(biāo)準(zhǔn)中增加RT-PCR、RT-qPCR檢測(cè)方法，并修訂綜合判定部分相關(guān)

內(nèi)容。既豐富IPNV的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法，也有利于各實(shí)驗(yàn)室便于使用該標(biāo)準(zhǔn)。以盡早確診病原，

切斷病毒傳播途徑，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶及相關(guān)推廣管理部門(mén)制定下一步防控措施，以達(dá)到降低我

國(guó)鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的目的。

4、具有較好的標(biāo)準(zhǔn)制修訂工作基礎(chǔ)

本標(biāo)準(zhǔn)起草組成員在標(biāo)準(zhǔn)制修定方面具有較強(qiáng)的工作基礎(chǔ)和豐富的工作經(jīng)驗(yàn)。已主持

或參與制定國(guó)標(biāo)、水產(chǎn)行標(biāo)、地標(biāo)共30多項(xiàng)。包括：GB/T25878-2010蛙病毒感染檢疫技

術(shù)規(guī)范，SC/T7016.13-2019魚(yú)類細(xì)胞系第13部分：鯽細(xì)胞系，SC/T7229-2019鯉浮腫病診

斷規(guī)程，SC/T7221-2016蛙病毒檢測(cè)方法，DB11/T374—2021水生動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管

理規(guī)范，DB11/T376—2021養(yǎng)殖魚(yú)類疫病防控技術(shù)規(guī)范等。

起草組成員包括3名以上全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治分技術(shù)委員會(huì)

委員，能及時(shí)跟進(jìn)和掌握相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂的前沿動(dòng)態(tài)，把握標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容中各參數(shù)的技術(shù)依據(jù)

和應(yīng)用信息，為標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

5、國(guó)標(biāo)修訂后的目標(biāo)

規(guī)范傳染性胰臟壞死病的診斷方法，保障傳染性胰臟壞死病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、

檢疫和監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為疫病監(jiān)測(cè)、診斷、防控提供技術(shù)支撐。

修訂后的內(nèi)容力求實(shí)用、可靠；文字表達(dá)力求準(zhǔn)確、規(guī)范、無(wú)歧異。

(三)起草過(guò)程

1、立項(xiàng)前的工作基礎(chǔ)

準(zhǔn)備階段：標(biāo)準(zhǔn)修訂的承擔(dān)單位密切合作，開(kāi)展了相關(guān)準(zhǔn)備工作。認(rèn)真查閱文獻(xiàn)，收

集國(guó)內(nèi)外關(guān)于傳染性胰臟壞死病的發(fā)病信息及檢測(cè)方法等相關(guān)資料，并對(duì)資料進(jìn)行分析、

歸納和總結(jié)。

研究階段：起草組先后承擔(dān)了北京市漁業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)病毒病防控崗位、北京市農(nóng)業(yè)農(nóng)村

局科技項(xiàng)目，研究建立了IPNV的RT-qPCR方法，并引用借鑒了中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)

3

研究所研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法，收集大量疑似感染IPNV樣品組織，利用RT-qPCR方

法、RT-PCR方法進(jìn)行鑒定和研究。

2、編制起草階段

根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》（GB/T1.1—2020），

前期研究結(jié)果以及參考文獻(xiàn)，制定了標(biāo)準(zhǔn)草案和編制說(shuō)明。

申報(bào)修訂國(guó)標(biāo)階段：申報(bào)修訂項(xiàng)目。

制定征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明：組成起草工作小組，制定傳染性胰臟壞死病診斷方法

（GB/T15085.1-202X）征求意見(jiàn)稿和完善編制說(shuō)明。

到2024年4月完成了標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明。

3、第三方驗(yàn)證機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2024年4月，由起草組提供樣品，分別由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所、

大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院、青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心等3家單位實(shí)施該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

證工作。驗(yàn)證的主要內(nèi)容包括：病毒分離、RT-qPCR方法、RT-PCR方法。4月底，三家驗(yàn)

證單位將報(bào)告反饋至起草組。驗(yàn)證結(jié)果表明：本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)路線合理，操作流程清晰明確，

結(jié)果易于判斷；樣品檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，具有較高的特異性、靈敏度；可操作性強(qiáng)。

4、征求意見(jiàn)階段

2024年5月，起草組面向全國(guó)家單位位專家進(jìn)行征求意見(jiàn)，發(fā)出《征求意見(jiàn)稿》。

共收到家單位的位專家的回復(fù)意見(jiàn)共條。其中研究單位，出入境系統(tǒng)，高校系

統(tǒng)，檢測(cè)單位家。研究回復(fù)意見(jiàn)，采納或部分采納條，無(wú)重大分歧意見(jiàn)。

（四）標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及主要所做的工作

起草單位：全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江

水產(chǎn)研究所。

標(biāo)準(zhǔn)主要起草人見(jiàn)下表。

起草人工作單位研究方向任務(wù)分工

組織修訂工作，編寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)

徐立蒲北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站魚(yú)病診斷與防控研究

和編制說(shuō)明

RT-qPCR檢測(cè)方法建立及

張文北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站分子生物學(xué)研究驗(yàn)證工作，編寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)和編

制說(shuō)明

馮東岳全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站標(biāo)準(zhǔn)研究與管理標(biāo)準(zhǔn)適用性評(píng)價(jià)

4

張翔全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站標(biāo)準(zhǔn)研究與管理標(biāo)準(zhǔn)適用性評(píng)價(jià)

呂曉楠北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站快檢技術(shù)研究標(biāo)準(zhǔn)文本修訂等

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江

徐黎明魚(yú)類病害防治技術(shù)研究建立RT-PCR檢測(cè)方法

水產(chǎn)研究所

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江RT-PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證

盧彤巖魚(yú)類病害防控技術(shù)研究

水產(chǎn)研究所及適應(yīng)性評(píng)價(jià)

王靜波北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站魚(yú)病診斷與防控研究參與標(biāo)準(zhǔn)的起草研制等

標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證和適用性

王姝北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站病毒性疾病研究

評(píng)價(jià)等

曹歡北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站病害防控技術(shù)研究標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范的驗(yàn)證等

王小亮北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站病害防控技術(shù)研究檢測(cè)條件優(yōu)化及試驗(yàn)驗(yàn)證

王澎北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站病害防控技術(shù)研究標(biāo)準(zhǔn)文本修訂等

二、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)，修訂前后技術(shù)內(nèi)容的對(duì)

比

(一)標(biāo)準(zhǔn)編制原則

標(biāo)準(zhǔn)修訂嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)

則》（GB/T1.1—2020）[1]的要求；編制說(shuō)明按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局“國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)管理辦法”第三章

第十六條和《農(nóng)業(yè)部國(guó)家（行業(yè)）標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)劃編制、制定和審查管理辦法》第二章的基本

要求而編寫(xiě)。在編寫(xiě)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循一致性、協(xié)調(diào)性、易用性等原則；同時(shí)還遵照以下

原則。

通用性強(qiáng)原則：本標(biāo)準(zhǔn)的修訂主要是充分考慮方法成熟性、檢測(cè)工作效率、試劑耗材

獲取的難易程度以及操作的難易程度，以適合各級(jí)疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、檢驗(yàn)檢疫部門(mén)、高

等院校和研究所相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員的使用。標(biāo)準(zhǔn)中主要技術(shù)內(nèi)容修訂是增加了RT-qPCR方

法、RT-PCR方法鑒定IPNV，以及其他相關(guān)內(nèi)容。增加的RT-qPCR方法、RT-PCR方法，均

為起草單位多年來(lái)的研究成果，并經(jīng)過(guò)大量樣品檢驗(yàn)，且為國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃中

IPN監(jiān)測(cè)的指定方法。通過(guò)上述工作，已經(jīng)充分驗(yàn)證了所使用的檢測(cè)技術(shù)方法成熟，準(zhǔn)確性

高；且試劑耗材易獲取，操作技術(shù)易掌握，實(shí)用性較高，通用性較強(qiáng)。

病原為主線原則：在修訂中嚴(yán)格遵循以病原為主線，不論健康、患病魚(yú)的IPN診斷的判

定以病原為第一要素。

5

方便疫病監(jiān)測(cè)工作使用原則：在IPN監(jiān)測(cè)工作中，多數(shù)還是陰性結(jié)果，需要出具檢測(cè)報(bào)

告作為監(jiān)測(cè)工作的支撐。但原標(biāo)準(zhǔn)中綜合判定中沒(méi)有陰性結(jié)果（病或病原）的判定，給疫

病監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)不便。本次修訂，在綜合判定部分給出陰性結(jié)果判定。

(二)主要內(nèi)容及其確定依據(jù)

1、主要內(nèi)容

標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容包括：規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、試劑和材料、儀器設(shè)備、臨床癥狀、

樣品、病毒分離、中和試驗(yàn)、ELISA、RT-PCR檢測(cè)、RT-qPCR檢測(cè)、綜合判定、附錄。

檢測(cè)流程：樣品經(jīng)病毒分離后，采用中和試驗(yàn)、ELISA、RT-PCR或RT-qPCR進(jìn)行鑒定，

判定結(jié)果。

2、確定依據(jù)

在標(biāo)準(zhǔn)修訂過(guò)程中，保留了原標(biāo)準(zhǔn)病毒分離、中和試驗(yàn)、ELISA檢測(cè)。新增加了兩種

檢測(cè)技術(shù)（RT-PCR、RT-qPCR），均為起草組研制成果[2-3]，已經(jīng)過(guò)大量樣品檢驗(yàn)，并作為

國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃IPN監(jiān)測(cè)指定的方法。研究表明，兩種方法的特異性、靈敏度滿

足開(kāi)展IPN診斷、監(jiān)測(cè)、檢疫、流行病學(xué)調(diào)查使用。

（1）新增加的臨床癥狀和附錄（IPN）部分

臨床癥狀部分參照2000版OIE手冊(cè)中IPN的相關(guān)描述[4]，以及歷年《傳染性胰壞死病(IPN)

狀況分析》（來(lái)源：我國(guó)水生動(dòng)物重要疫病狀況分析）相關(guān)描述[5-6]。

附錄（IPN蛋白片段）來(lái)自病毒測(cè)序結(jié)果。

（2）病毒分離

①樣品處理

采樣按GB/T18088的規(guī)定執(zhí)行。采集鮭鱒魚(yú)類，尤其是5月齡以內(nèi)的虹鱒魚(yú)苗。對(duì)體長(zhǎng)

≥6cm的魚(yú)，取腎、肝、脾、腦；體長(zhǎng)4cm～6cm的魚(yú)，取所有內(nèi)臟；體長(zhǎng)≤4cm的魚(yú)，

取整條魚(yú)；帶卵黃囊的魚(yú)去掉卵黃囊；成熟雌魚(yú)還需取卵巢液。魚(yú)卵則取卵殼。取樣應(yīng)加

貼標(biāo)簽，標(biāo)簽上清楚標(biāo)明樣品編號(hào)、采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)。樣品應(yīng)活體送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，立即

取樣檢測(cè)。

在10℃以下環(huán)境下，先用組織研磨器將樣品勻漿，勻漿后，再用含有抗菌素（1000

IU/mL的青霉素和1000μg/mL的鏈霉素）的細(xì)胞培養(yǎng)液，按1:10的最終稀釋度懸浮。

于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育過(guò)夜，7000r／min離心15min，收集上清液。卵巢

液不必勻漿，稀釋兩倍以上。用相同的方法離心卵巢液樣品并在以后的步驟中直接用其上

6

清液。

②病毒分離

用細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)1：10的組織勻漿上清液再2次10倍稀釋，然后將這1:10、1:100和

1:1000三種稀釋度的上清液分別接種到生長(zhǎng)約24h的BF-2、RTG-2、CHSE或者PG細(xì)胞

單層中，每孔（2cm2）的細(xì)胞單層接種100μL稀釋液，接種后細(xì)胞板置于18℃±2℃

培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（接種IPNV參考株細(xì)胞）和空白對(duì)照（未接種病毒的細(xì)胞）。

陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品都接種細(xì)胞后，7d內(nèi)每天用40倍～100倍倒置顯微鏡檢查?？?/p>

白對(duì)照細(xì)胞應(yīng)正常，陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)CPE。如接種待測(cè)樣品勻漿上清稀釋液的細(xì)胞在

培養(yǎng)中出現(xiàn)CPE，應(yīng)立即進(jìn)行IPNV的鑒定。在培養(yǎng)7d后如無(wú)CPE出現(xiàn)應(yīng)進(jìn)行盲傳。盲

傳時(shí)，將接種了組織勻漿上清稀釋液的單層細(xì)胞培養(yǎng)物凍融1次，以7000r/min，4℃離

心15min，收集上清液，將上清液接種于24h內(nèi)新鮮培養(yǎng)的單層細(xì)胞中，培養(yǎng)7d，每天

用40倍～100倍倒置顯微鏡檢查。盲傳培養(yǎng)期間出現(xiàn)CPE，應(yīng)立即進(jìn)行IPNV的鑒定。

如果陽(yáng)性對(duì)照也未出現(xiàn)CPE，則應(yīng)換用敏感細(xì)胞和一批新的組織樣品重新進(jìn)行病毒分

離。

此外，新增加分離病毒的細(xì)胞系BF-2，原國(guó)標(biāo)中分離IPNV的細(xì)胞系有3種，即CHSE、

RTG和PG?，F(xiàn)新增加BF-2細(xì)胞系。在2000版OIE手冊(cè)中，分離IPNV的細(xì)胞系就包括

BF-2；但在當(dāng)年國(guó)標(biāo)制定過(guò)程中，由于考慮到國(guó)內(nèi)還沒(méi)有BF-2細(xì)胞系，因此就沒(méi)有包括

BF-2。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)已經(jīng)有BF-2細(xì)胞系，因此依據(jù)OIE手冊(cè)要求，在分離IPNV的細(xì)胞系中

增加BF-2，便于各實(shí)驗(yàn)室有更多的選擇。

（3）中和試驗(yàn)

參照2000版—2008版OIE手冊(cè)中有關(guān)IPN的中和試驗(yàn)檢測(cè)方法。

①試驗(yàn)準(zhǔn)備

◆把BF-2（或RTG-2、CHSE、PG等）細(xì)胞培養(yǎng)于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上。

◆病毒：用IPNV參考株，傳代后制成病毒懸液。

◆抗血清：抗IPNV的參考血清，使用前于56℃滅活60min。

◆待檢樣品（病毒分離培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)物））；凍融一次，除去細(xì)胞

碎片后使用。

②操作步驟

◆用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋待檢樣品至1:（101～108），每管體積為0.5mL

7

◆取兩排離心管，分別從上述各稀釋度的待檢樣品中取出0.2mL于兩排離心管中，

然后第一排管加入0.2mL抗IPNV參考血清，第二排管加入0.2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，

充分混合均勻。

◆25℃溫育60min，

◆溫育后分別將第一排管與第二排管的樣品接種于已長(zhǎng)滿細(xì)胞單層的96孔微量

細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度4孔，每孔0.1mL。

◆將抗IPNV參考血清倍比稀釋后（1：8至1：64）接種于上述培養(yǎng)板，每個(gè)稀

釋度2孔，每孔0.05mL，作為參考抗血清對(duì)照。

◆將IPNV參考病毒按照1:（101～108）稀釋，并和參考血清混合反應(yīng)后加入細(xì)

胞板，每個(gè)稀釋度2孔，每孔0.1mL，作為“參考病毒十參考血清”對(duì)照，細(xì)胞

板中剩余8孔中4孔作正常細(xì)胞對(duì)照，4孔接參考病毒原液做病毒對(duì)照。

◆各孔再加入細(xì)胞培養(yǎng)液0.1mL。

◆放入20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變，按下表填寫(xiě)試驗(yàn)結(jié)果。

樣品類型

稀釋度待檢樣品＋參考血清待檢樣品＋細(xì)胞培養(yǎng)液參考病毒＋參考血清參考血清對(duì)照

123456789101112

A10-11:8

細(xì)

B10-21:8胞

C10-31:16對(duì)

照

D10-41:16

E10-51:32

病

F10-61:32毒

G10-71:64對(duì)

照

H10-81:64

此外，更改了中和試驗(yàn)結(jié)果判定，即當(dāng)細(xì)胞接種了經(jīng)特異的抗IPNV參考血清處理的

懸液（即“待檢樣品+參考血清”）后，細(xì)胞的CPE被阻斷或明顯延遲產(chǎn)生，而其它未經(jīng)

特異的抗IPNV參考血清處理的懸液（即“待檢樣品+細(xì)胞培養(yǎng)液”）有明顯的CPE，則判

定中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，否則為陰性。原國(guó)標(biāo)中中和試驗(yàn)判定部分較為復(fù)雜，且難理解

和執(zhí)行，修改后的判定方法比較實(shí)用。

（4）ELISA

參照2000版—2008版OIE手冊(cè)中有關(guān)IPN的ELISA檢測(cè)方法。

①包被羊抗IPNV抗體

8

將羊抗IPNV的IgG用包被稀釋液稀釋成工作濃度后包被酶標(biāo)板，每孔0.1ml。4℃孵

育12h～24h或者37℃反應(yīng)1.5h～2b。倒出孔內(nèi)液體。

②洗滌

將PBST加滿小孔，2min后倒出，拍干。如此重復(fù)3次

③加入待測(cè)樣品

待檢樣品為用細(xì)胞培養(yǎng)液按1:10的比例稀釋的組織研磨上清液或接種了組織研磨上

清液的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，每個(gè)待檢樣品兩孔，每孔0.1mL。另將IPNV參考株或接種IPNV

參考株且出現(xiàn)典型CPE的細(xì)胞懸液（陽(yáng)性對(duì)照）、不含IPNV的組織研磨上清液或未接種

IPNV的細(xì)胞碎片（陰性對(duì)照）和PBST（空白對(duì)照）也各加兩孔。37℃反應(yīng)1.5h～2h。倒

出孔內(nèi)液體。用PBST洗3次。

④加入兔抗IPNV血清

每孔加0.1mL稀釋到工作濃度的免抗IPNV參考血清（用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋）。37℃反

應(yīng)1.5h～2h。倒出孔內(nèi)液體。用PBST洗兩次。

⑤消除非特異性過(guò)氧化物酶

每孔加0.1mL0.1％的H2O2（用雙蒸水稀釋）。37℃反應(yīng)15min以除掉非特異性的過(guò)氧

化物酶。倒出孔內(nèi)液體。用PBST洗兩次。

⑥加入酶標(biāo)羊抗兔IgG結(jié)合物（酶標(biāo)二抗）

每孔加入0.1mL稀釋到工作濃度的酶標(biāo)羊抗兔IgG（用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋）。37℃反應(yīng)

1.5h～2h。倒出孔內(nèi)液體。用PBST洗3次。

⑦加底物OPD溶液

每孔加入0.1mLOPD溶液。室溫下避光反應(yīng)顯色約10min。

⑧加終止液

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)明顯棕黃色，陰性對(duì)照無(wú)色時(shí)，立即每孔加入0.2mL濃度為2mol/L硫

酸終止反應(yīng)。

⑨結(jié)果計(jì)算和判定

陽(yáng)性對(duì)照孔的A450值（P）與陰性對(duì)照孔的A450值（N）之比大于等于2.1（即P／

N≥2.1），則檢測(cè)有效。

當(dāng)待測(cè)樣品孔的A450值（P）與陰性對(duì)照孔的A450值（N）之比大于等于2.1（即P

／N≥2.1），判定ELISA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，否則為陰性。

（5）RT-PCR檢測(cè)

9

①RNA提取

采用CTAB抽提核酸，或采用等效的商品化RNA提取試劑盒。這兩種方法均為檢測(cè)實(shí)

驗(yàn)室常用方法，參照標(biāo)準(zhǔn)流程或試劑盒說(shuō)明書(shū)即可。

②cDNA合成

采用反向引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑合成，或采用等效的商品化cDNA合成試劑盒，

或采用等效的商品化一步法RT-PCR試劑盒，省略cDNA合成步驟。以上方法均為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

室常用方法，參照標(biāo)準(zhǔn)流程或試劑盒說(shuō)明書(shū)即可。

③引物序列及退火溫度確定

采用2篇文獻(xiàn)建立的IPNVRT-PCR檢測(cè)方法中引物序列及退火溫度[3,7]。

④臨床樣品驗(yàn)證

回顧性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保藏的虹鱒魚(yú)組織樣品，包括2017年（36份）、2018年（88份）、

2019年（15份）、2020年（5份），共144份樣品，對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得25個(gè)序

列信息，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2（以1#樣品為例）。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分

析，見(jiàn)圖3。

10

圖1電泳結(jié)果

圖2比對(duì)結(jié)果

結(jié)果表明，2017年—2020年，在甘肅檢出Genogroup5和Genogroup1；遼寧檢出

Genogroup1；北京檢出Genogroup5和Genogroup1。結(jié)合參考文獻(xiàn)，自1986年至今，我國(guó)

山西、遼寧、山東、甘肅、北京等地，主要檢出的基因型為Genogroup1和Genogroup5。

通過(guò)對(duì)144份樣品25份陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)及序列分析，結(jié)果表明，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳有

明顯目的條帶，經(jīng)測(cè)序所獲得的序列與參考序列同源性均可達(dá)到99%～100%。考慮到實(shí)驗(yàn)

室間檢測(cè)技術(shù)差異，明確當(dāng)待測(cè)樣品有明顯目的條帶，經(jīng)測(cè)序結(jié)果與參考序列一致性＞98%

時(shí)，可判為RT-PCR檢測(cè)核酸陽(yáng)性。

11

1#2020年甘肅

6#2019年甘肅

34#2019年甘肅

2#2020年北京

21#2019年甘肅

10#2019年甘肅

20#2019年甘肅

6525#2020年甘肅

5#2019年甘肅

9#2019年甘肅

22#2019年甘肅

8#2019年甘肅

91Genogroup5

11#2019年甘肅

19#2019年甘肅

6624#2020年甘肅

12#2019年甘肅

18#2019年甘肅

65

KF279643SP

43AJ4892221146

43

AF342728SP

57MH614926SP

99

AJ622822SP

D00701N1

76

76AY354520SP

Genogroup4

AF342732Canada1

AJ489228578

6161

AJ4892232284Genogroup3

100

AJ4892242290

AF342734Canada3

100JF440810Connecticut-1Genogroup2

99AF342733Canada2

69AF342727WB

AF342735Jasper

JX174178Mexican

100

AF343573Buh1

51AJ4892252310

100

67D26526DRT

AF343572VR299

77

70M18049Jasper

Genogroup1

17#2019年甘肅

65

3043#2020年甘肅

83

33#2019年甘肅

38#2018年甘肅

年甘肅

899335#2018

36#2018年甘肅

88KX234591ChRtm213

3830#2018年遼寧

2640#2017年北京

AF342730He

Genogroup6

0.05

12

圖3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

（6）RT-qPCR檢測(cè)

①RNA提取

采用CTAB抽提核酸，或采用等效的商品化RNA提取試劑盒。這兩種方法均為檢測(cè)實(shí)

驗(yàn)室常用方法，參照標(biāo)準(zhǔn)流程或試劑盒說(shuō)明書(shū)。

②cDNA合成

采用反向引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑合成，或采用等效的商品化cDNA合成試劑盒，

或采用等效的商品化一步法RT-PCR試劑盒，省略cDNA合成步驟。以上方法均為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

室常用方法，參照標(biāo)準(zhǔn)流程或試劑盒說(shuō)明書(shū)。

③引物及探針序列確定

IPNV分為6個(gè)基因簇（Genogroup1-6）,將GenBank上公布的6種基因簇126個(gè)代表株的

VP2序列輸入DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析，確定目標(biāo)區(qū)域，作為引物和TaqMan探針

序列設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)，部分代表序列信息見(jiàn)表1。

表1病毒分離株信息

序號(hào)基因型毒株GenBank登錄號(hào)國(guó)家或地區(qū)

112310AJ489225northwesternSpain

21Chrtm213KX234591China

31VR299AF343572USA

41BuhlAF343573USA

51DRTD26526Korea

61MexicanJX174178Mexico

71WestBuxtonAF342727USA

81JasperAF342735USA

92Connecticut-1JF440810USA

102Canada2AF342733Canada

112Canada3AF342734Canada

1232284AJ489223northwesternSpain

1332290AJ489224northwesternSpain

143578AJ489228northwesternSpain

154Canada1AF342732Canada

165SpAF342728USA

175SpMH614926Turkey

185SPKF279643Iran

195SPAJ622822FRANCE

13

205SpAY354520USA

216HeAF342730USA

采用PrimerPremier6.0設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針序列，代表序列信息見(jiàn)表2，探針5’

端由FAM標(biāo)記，3’端由BHQ1標(biāo)記。引物探針序列由北京六合華大基因科技有限公司合成。

提取實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏的IPNV陽(yáng)性樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，對(duì)7組引物探針序

列進(jìn)行評(píng)估，確定最佳引物探針組合。

表2引物和TaqMan探針序列

序號(hào)引物序列(5’→3’)大小(bp)

F1GGCAACCGCAACTTACTT18

1R1TATGAYGAGGTCTCTTGT18

Probe1ATCCATTATGCTTCC15

F2ATACGTCCGCCTWGAGGA18

2R2GGATGGGAGGTCGATYTC18

Probe2GATGAGGTGCACAGCTGC18

F3ATACGTCCGCCTDGAGGA18

3R3GGATGGGAGGTCGATYTC18

Probe3GATGAGGTGCACAGCTGC18

F4CGTCATATAACYTAGAGGTMTC22

4R4CCGTCTGGTTCTSATTCC18

Probe4GAATCAGGAAGTGG14

F5GYCTYAACTATGCCAAGATG20

5R5TGTATTCCTCAGTCCTCCA19

Probe5ATCCTGTCCCACAG14

F6AAGAACGACCTCACMGAYC19

6R6TKGGCTTCTCTTGGTGYT18

Probe6ACATGTACGAGTGGTC16

F7CRACCGACATGRACAARA18

7R7ACTGCTTSGTAGAAATCST19

Probe7CTAGCCAACAGTG13

按照商品化熒光PCR試劑盒推薦反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，以IPNV陽(yáng)性樣品cDNA為模

板進(jìn)行熒光擴(kuò)增，篩選最佳引物探針序列。結(jié)果顯示，第3組引物探針?biāo)@得的Ct值最小，

與另外6組相比，擴(kuò)增曲線更早出現(xiàn)向上的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4。因此，確定第3組引物探針進(jìn)

行反應(yīng)條件的優(yōu)化。

14

圖4引物和探針篩選結(jié)果

注：1～7.傳染性胰臟壞死病毒；8.空白對(duì)照

同時(shí)，將引物探針序列與GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中62個(gè)IPNV代表序列進(jìn)行比對(duì)，序列

信息見(jiàn)3。比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5（上游引物與IPNV代表序列比對(duì)結(jié)果）、圖6（探針與IPNV

代表序列比對(duì)結(jié)果）、圖7（下游引物的反向互補(bǔ)序列與IPNV代表序列比對(duì)結(jié)果），未發(fā)

現(xiàn)有個(gè)別堿基與62個(gè)代表序列不一致的情況。

表3IPNV代表序列信息

序號(hào)序列編號(hào)序號(hào)序列編號(hào)

1AJ48922532EF493156

2KX23459133HQ833317

3AF34357234HQ833318

4M1804935HQ833319

5AF34357336HQ833320

6D2652637KU609570

7JX17417838KU609572

8AF34357039KU609574

9AY28378040KU609577

10KU60959341KU609578

11MH01054442KU609579

12AF34272843KU609580

13MH61492644KU609581

14KF27964345KU609584

15AJ48922246KU609585

16AJ62282247KU609587

17D0070148KU609590

18AY35452049KU609592

19AY35451950KX523802

20AY37443551KX523805

21AJ48922952KY548511

22AY37973553KY548514

23AY37973654KY548515

24AY37973755MH614927

25AY37973856MH614928

26AY37974057MH614929

27AY37974258MH614930

15

28AY37974459MH614931

29AY82363260MH614932

30DQ53609061U48225

31DQ53609162U56907

序列網(wǎng)址：NucleotideBLAST:Searchnucleotidedatabasesusinganucleotidequery()

16

圖5上游引物與IPNV代表序列比對(duì)結(jié)果

17

圖6探針與IPNV代表序列比對(duì)結(jié)果

18

圖7下游引物的反向互補(bǔ)序列與IPNV代表序列比對(duì)結(jié)果

④引物及探針檢測(cè)濃度確定

提取實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏的IPNV強(qiáng)陽(yáng)性樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，采用確定的

19

最佳引物探針對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送至北京天成新脈生物技術(shù)有限公司，克隆到