PCR崗位技能考核試題2025年附答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶的作用是（）A.解開(kāi)DNA雙鏈B.催化引物與模板結(jié)合C.催化dNTP聚合形成DNA鏈D.調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值答案：C。TaqDNA聚合酶具有5'-3'聚合酶活性，能以dNTP為原料，在引物的引導(dǎo)下催化合成DNA鏈，而不是解開(kāi)DNA雙鏈，也不參與引物與模板結(jié)合以及調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，所以選C。2.PCR反應(yīng)中變性溫度一般為（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：C。變性步驟是使雙鏈DNA解鏈為單鏈，需要較高溫度，通常為94℃左右，所以選C。3.以下哪種物質(zhì)不是PCR反應(yīng)體系的必需成分（）A.模板DNAB.dNTPC.RNA聚合酶D.引物答案：C。PCR反應(yīng)體系的必需成分包括模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等，不需要RNA聚合酶，所以選C。4.在PCR實(shí)驗(yàn)中，若引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致（）A.產(chǎn)物產(chǎn)量過(guò)高B.非特異性擴(kuò)增C.退火溫度升高D.模板降解答案：B。引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，如引物與非目標(biāo)序列有互補(bǔ)區(qū)域，就會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，所以選B。5.熒光定量PCR中，Ct值的含義是（）A.達(dá)到熒光閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值時(shí)的循環(huán)數(shù)C.反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的循環(huán)數(shù)D.反應(yīng)結(jié)束時(shí)的循環(huán)數(shù)答案：A。Ct值即循環(huán)閾值，是指在熒光定量PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，所以選A。6.PCR反應(yīng)的延伸溫度通常設(shè)置為（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：B。延伸階段是在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料合成新的DNA鏈，最適溫度一般為72℃，所以選B。7.下列關(guān)于PCR引物設(shè)計(jì)的原則，錯(cuò)誤的是（）A.引物長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)核苷酸B.引物的GC含量應(yīng)在40%-60%之間C.引物3'端可以是A或TD.引物應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)答案：C。引物3'端最好是G或C，這樣可以提高引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性，而不是A或T，所以選C。8.PCR反應(yīng)中，引物的作用是（）A.提供模板B.激活Taq酶C.引導(dǎo)DNA合成的起始D.調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度答案：C。引物是一小段單鏈DNA或RNA，它能與模板DNA特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶從引物的3'端開(kāi)始合成新的DNA鏈，所以選C。9.以下關(guān)于PCR反應(yīng)中Mg2+濃度的說(shuō)法，正確的是（）A.Mg2+濃度越高，PCR反應(yīng)越靈敏B.Mg2+濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增C.Mg2+主要影響TaqDNA聚合酶的活性D.Mg2+濃度不影響PCR反應(yīng)結(jié)果答案：C。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，主要影響TaqDNA聚合酶的活性，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響PCR反應(yīng)的結(jié)果，過(guò)高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，過(guò)低則會(huì)使酶活性降低，所以選C。10.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的第一步是（）A.變性B.反轉(zhuǎn)錄C.退火D.延伸答案：B。RT-PCR是先以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后再進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增，所以第一步是反轉(zhuǎn)錄，選B。11.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常用的熒光染料是（）A.溴化乙錠B.SYBRGreenIC.考馬斯亮藍(lán)D.甲基綠答案：B。SYBRGreenI是實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常用的熒光染料，它能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，可用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況，所以選B。12.在PCR反應(yīng)中，模板DNA的質(zhì)量和濃度會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果，模板DNA濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致（）A.產(chǎn)物產(chǎn)量過(guò)低B.非特異性擴(kuò)增C.引物二聚體形成D.退火溫度升高答案：B。模板DNA濃度過(guò)高時(shí)，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，因?yàn)樵诟邼舛认?，TaqDNA聚合酶可能會(huì)結(jié)合到非目標(biāo)序列上進(jìn)行擴(kuò)增，所以選B。13.PCR反應(yīng)中，dNTP的作用是（）A.提供能量B.作為DNA合成的原料C.調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值D.穩(wěn)定TaqDNA聚合酶答案：B。dNTP（脫氧核苷三磷酸）是合成DNA的原料，在TaqDNA聚合酶的作用下，dNTP的磷酸二酯鍵斷裂釋放能量，用于合成新的DNA鏈，所以選B。14.下列關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng)，錯(cuò)誤的是（）A.所有試劑和耗材要嚴(yán)格滅菌B.操作過(guò)程中要戴口罩和手套C.可以在同一區(qū)域進(jìn)行模板DNA的制備和PCR產(chǎn)物的分析D.避免試劑的反復(fù)凍融答案：C。為了防止PCR產(chǎn)物污染，不能在同一區(qū)域進(jìn)行模板DNA的制備和PCR產(chǎn)物的分析，所以選C。15.多重PCR是指（）A.多個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行B.在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段C.對(duì)同一個(gè)目標(biāo)片段進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增D.用多種PCR方法進(jìn)行檢測(cè)答案：B。多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段，所以選B。二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共30分）1.以下屬于PCR反應(yīng)體系組成成分的有（）A.模板DNAB.dNTPC.TaqDNA聚合酶D.引物E.緩沖液答案：ABCDE。PCR反應(yīng)體系包含模板DNA提供擴(kuò)增的起始序列，dNTP作為合成DNA的原料，TaqDNA聚合酶催化DNA合成，引物引導(dǎo)合成起始，緩沖液提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，所以全選。2.PCR反應(yīng)的基本步驟包括（）A.變性B.退火C.延伸D.轉(zhuǎn)錄E.翻譯答案：ABC。PCR反應(yīng)的基本步驟為變性、退火和延伸，轉(zhuǎn)錄和翻譯是基因表達(dá)過(guò)程，并非PCR反應(yīng)步驟，所以選ABC。3.引物設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的因素有（）A.引物長(zhǎng)度B.GC含量C.引物的特異性D.引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)E.引物3'端堿基答案：ABCDE。引物長(zhǎng)度一般在18-25個(gè)核苷酸；GC含量應(yīng)在40%-60%之間；要保證引物的特異性，避免與非目標(biāo)序列結(jié)合；應(yīng)避免引物形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等；引物3'端堿基對(duì)PCR反應(yīng)影響較大，最好是G或C。所以全選。4.熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)有（）A.靈敏度高B.特異性強(qiáng)C.可進(jìn)行定量分析D.能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程E.無(wú)需電泳檢測(cè)答案：ABCDE。熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行定量分析，能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，且無(wú)需像常規(guī)PCR那樣進(jìn)行電泳檢測(cè)，所以全選。5.影響PCR反應(yīng)特異性的因素有（）A.引物設(shè)計(jì)B.退火溫度C.Mg2+濃度D.模板質(zhì)量E.TaqDNA聚合酶的用量答案：ABCDE。引物設(shè)計(jì)不合理會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度不合適可能使引物與非目標(biāo)序列結(jié)合；Mg2+濃度過(guò)高或過(guò)低會(huì)影響Taq酶活性從而影響特異性；模板質(zhì)量差可能含有雜質(zhì)影響反應(yīng)；TaqDNA聚合酶用量過(guò)多也可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。所以全選。6.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)中污染的說(shuō)法，正確的有（）A.模板污染會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果B.氣溶膠污染是常見(jiàn)的污染類型C.實(shí)驗(yàn)室分區(qū)操作可減少污染D.定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔和消毒可防止污染E.陽(yáng)性對(duì)照的污染不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果答案：ABCD。模板污染會(huì)使非目標(biāo)模板進(jìn)入反應(yīng)體系導(dǎo)致假陽(yáng)性；氣溶膠污染是PCR實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的污染類型；實(shí)驗(yàn)室分區(qū)操作能有效減少不同區(qū)域之間的交叉污染；定期清潔和消毒實(shí)驗(yàn)室可以降低污染的可能性。而陽(yáng)性對(duì)照污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，可能導(dǎo)致誤判，所以E錯(cuò)誤，選ABCD。7.在PCR反應(yīng)中，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗的原因有（）A.引物設(shè)計(jì)不合理B.模板DNA質(zhì)量差C.TaqDNA聚合酶失活D.反應(yīng)條件不合適E.試劑過(guò)期答案：ABCDE。引物設(shè)計(jì)不合理無(wú)法引導(dǎo)正確擴(kuò)增；模板DNA質(zhì)量差可能無(wú)法提供有效的起始序列；TaqDNA聚合酶失活則無(wú)法催化DNA合成；反應(yīng)條件如溫度、時(shí)間等不合適，以及試劑過(guò)期都會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，所以全選。8.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）涉及的酶有（）A.反轉(zhuǎn)錄酶B.TaqDNA聚合酶C.RNA聚合酶D.限制性內(nèi)切酶E.DNA連接酶答案：AB。反轉(zhuǎn)錄PCR先由反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用TaqDNA聚合酶進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，不涉及RNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，所以選AB。9.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常用的定量方法有（）A.絕對(duì)定量B.相對(duì)定量C.終點(diǎn)定量D.內(nèi)參定量E.外參定量答案：AB。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的定量方法有絕對(duì)定量和相對(duì)定量，終點(diǎn)定量不是常用方法，內(nèi)參和外參是輔助定量的概念，并非獨(dú)立的定量方法，所以選AB。10.PCR技術(shù)在以下哪些領(lǐng)域有應(yīng)用（）A.疾病診斷B.親子鑒定C.基因克隆D.物種鑒定E.藥物研發(fā)答案：ABCDE。PCR技術(shù)在疾病診斷中可檢測(cè)病原體；親子鑒定通過(guò)分析遺傳物質(zhì)；基因克隆中用于獲取目的基因；物種鑒定可分析物種的特定基因；藥物研發(fā)中也可用于相關(guān)基因的研究。所以全選。三、判斷題（每題2分，共20分）1.PCR反應(yīng)中，退火溫度越高，引物與模板的結(jié)合越穩(wěn)定。（×）解析：退火溫度過(guò)高，引物與模板難以結(jié)合，只有合適的退火溫度才能使引物與模板穩(wěn)定結(jié)合，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。2.熒光定量PCR中，Ct值越大，說(shuō)明樣本中目標(biāo)核酸的初始含量越高。（×）解析：Ct值與樣本中目標(biāo)核酸的初始含量呈反比，Ct值越大，說(shuō)明樣本中目標(biāo)核酸的初始含量越低，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。3.PCR反應(yīng)中，dNTP的濃度過(guò)高不會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果。（×）解析：dNTP濃度過(guò)高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的可能性，影響反應(yīng)結(jié)果，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。4.引物二聚體的形成會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性和效率。（√）解析：引物二聚體形成后會(huì)消耗引物和dNTP等反應(yīng)成分，降低PCR反應(yīng)的效率，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，影響反應(yīng)特異性，所以該說(shuō)法正確。5.反轉(zhuǎn)錄PCR可以將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA。（√）解析：反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的第一步就是以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，所以該說(shuō)法正確。6.PCR反應(yīng)中，模板DNA的量越多，擴(kuò)增效果越好。（×）解析：模板DNA量過(guò)多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題，并非越多越好，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR不需要設(shè)置陰性對(duì)照。（×）解析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要設(shè)置陰性對(duì)照，用于檢測(cè)是否存在污染等情況，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。8.PCR反應(yīng)的延伸時(shí)間主要取決于待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。（√）解析：待擴(kuò)增片段越長(zhǎng)，延伸所需時(shí)間就越長(zhǎng)，所以延伸時(shí)間主要取決于待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，該說(shuō)法正確。9.在PCR實(shí)驗(yàn)中，只要使用高質(zhì)量的試劑和儀器，就不會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題。（×）解析：除了試劑和儀器，實(shí)驗(yàn)操作、反應(yīng)條件等多種因素都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。10.PCR技術(shù)只能用于擴(kuò)增DNA，不能用于擴(kuò)增RNA。（×）解析：通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR可以先將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所以該說(shuō)法錯(cuò)誤。四、簡(jiǎn)答題（每題10分，共20分）1.簡(jiǎn)述PCR反應(yīng)的基本原理和主要步驟。答：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的基本原理是模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過(guò)程，在體外特異性地?cái)U(kuò)增所需要的DNA片段。它利用DNA在不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的特性，通過(guò)控制溫度使雙鏈DNA變性、引物與模板退火結(jié)合以及在DNA聚合酶作用下延伸合成新的DNA鏈，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。主要步驟如下：（1）變性：將反應(yīng)體系加熱至94℃左右，使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，為后續(xù)引物與模板結(jié)合做準(zhǔn)備。這個(gè)過(guò)程破壞了DNA雙鏈之間的氫鍵，使DNA分子分離成兩條單鏈。（2）退火：將溫度降低至引物的退火溫度（一般為55-65℃），引物與單鏈DNA模板的互補(bǔ)序列特異性結(jié)合。引物是一小段單鏈DNA或RNA，它能引導(dǎo)DNA聚合酶從其3'端開(kāi)始合成新的DNA鏈。（3）延伸：將溫度升高至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開(kāi)始，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。這三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量就會(huì)增加一倍。通常PCR反應(yīng)需要進(jìn)行25-35個(gè)循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)目的DNA片段的大量擴(kuò)增。2.請(qǐng)說(shuō)明熒光定量PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別。答：熒光定量PCR與常規(guī)PCR有以下區(qū)別：（1）檢測(cè)方法：常規(guī)PCR主要是在PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳等方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，只能進(jìn)行定性分析，判斷是否有目標(biāo)片段的擴(kuò)增。而熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，能夠?qū)δ繕?biāo)核酸進(jìn)行定量分析。（2）靈敏度：熒光定量PCR的靈敏度通常比常規(guī)PCR高。它可以檢測(cè)到極微量的目標(biāo)核酸，因?yàn)樗軌驅(qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，即使初始模板量很少，也能在反應(yīng)過(guò)程中準(zhǔn)確檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)。常規(guī)PCR在檢測(cè)低豐度模板時(shí)可能效果不佳。（3）特異性：熒光定量PCR通過(guò)熒光探針或熒光染料的特異性結(jié)合，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別目標(biāo)核酸，特異性更強(qiáng)。常規(guī)PCR則主要依賴引物的特異性，在某些情況下可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。（4）操作復(fù)雜性：常