本文所列的染色體制備常見問題及可能方案均征集自微信專業(yè)交流群(去年8月份做過一次微信調(diào)查)。所列的十一個問題均是來自全國各地、從事細(xì)胞遺傳學(xué)實驗室工作的一線專業(yè)技術(shù)人員比較關(guān)注的問題，解決方案也是來自一線人員的工作經(jīng)驗總結(jié)，非常接地氣，也具有很強的可操作性，因此匯集成文供行業(yè)內(nèi)從業(yè)人員參考，再次感謝所有參與這一活動的同行。需要事先說明的是，考慮到全國各地氣候條件、實驗室環(huán)境、儀器設(shè)備、試劑耗材、操作方法以及人員經(jīng)驗等條件均存在較大差異，加之染色體制備流程涉及標(biāo)本采集、培養(yǎng)、收獲、制片、染色等多個環(huán)節(jié)，文中所列的某些方法和措施可能僅適用于當(dāng)?shù)鼗蛱囟ǖ膶嶒炇?，不能做到放之四海而皆?zhǔn)。因此，本文提供的可能解決方案僅供參考，實驗室對任何既有實驗流程的更改均需做預(yù)實驗以確定是否可靠有效，以免造成不良后果，這一點務(wù)請讀者知悉。問題01:羊水細(xì)胞生長不良如何解決?·如批量出現(xiàn)，應(yīng)對手術(shù)環(huán)境、標(biāo)本情況、培養(yǎng)環(huán)境、試劑進行排查并做原因分析?！癫榭礈貪穸仁欠窈线m，調(diào)整培養(yǎng)液PH值或更換培養(yǎng)基?！窦?xì)胞貼壁換液后，每天輕輕晃動，讓它生長均勻，隔2、3天再讓細(xì)胞分散重新貼壁生長。·傳代(上清轉(zhuǎn)種培養(yǎng))?！と鍌€克隆，用細(xì)胞刮片在克隆位置刮取細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)?？寺≥^多，可用胰酶消化后原瓶培養(yǎng)?！?yīng)同時加做分子項目做補充，通知開單醫(yī)生，做好相關(guān)知情告要點或補充說明：批量出現(xiàn)細(xì)胞生長不良，需對涉及培養(yǎng)的各種影響因素進行逐項排查，找到最可能的因素，及時補救。如細(xì)胞生長緩慢，可考慮采取表中的措施進行補救，估計有羊水培養(yǎng)失敗可能的需盡快報告臨床醫(yī)生。問題02:樣本母血污染如何處理?●常規(guī)接種，培養(yǎng)第6-7天添液，視貼壁情況進行半換液、換液、·如果有凝血塊，就用一次性無菌吸管用力吹打，然后將凝血塊挑出，將細(xì)胞沉淀接種進去?！ぶ囟饶秆廴九囵B(yǎng)第5天半換液，吸走一半舊培養(yǎng)液，加入一半新的，第7天觀察，如果可以換液，之后就正常操作?！ぶ囟饶秆廴?，建議放一兩滴肝素后再離心接種培養(yǎng)，若沒放肝素直接離心培養(yǎng)，則建議培養(yǎng)后第五或第六天搖動培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至第八天觀察?！ぶ囟饶秆廴究稍陔x心后吸血羊水細(xì)胞層接種，貼壁生長后及時換液，視情況還可能需要傳代?！耜惻f性母血污染標(biāo)本粘度大，非羊水細(xì)胞也能貼在瓶底影響細(xì)胞生長，及時換液，幾乎都需要傳代才能收獲。補簽?zāi)秆廴镜闹橥鈺Ｃ鞔_輕度和重度母血污染的區(qū)別，接種前做好標(biāo)記，接種后能有效區(qū)分，定期總結(jié)哪些母血污染對細(xì)胞培養(yǎng)的影響情況，并反饋給臨輕度母血污染與常規(guī)標(biāo)本操作一樣，重度母血污染應(yīng)先做預(yù)處理，細(xì)胞貼壁后提早換液，必要時傳代，如細(xì)胞生長不良及時通知臨床。問題03:培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌污染如何處理?·注重預(yù)防：無菌標(biāo)準(zhǔn)操作，培養(yǎng)箱定期酒精擦拭，接種前紫外照射操作臺，安全柜使用完畢及時清理消毒，酒精擦拭。實驗用品盡量使用一次性無菌的，使用前應(yīng)該放入生物安全柜內(nèi)紫外消毒30min,從外界拿進生物安全柜前要噴酒精消毒。手套臟了，應(yīng)該及時更換。定時更換過濾網(wǎng)，定期檢查管道通風(fēng)系統(tǒng)?！そ臃N和換液過程中在酒精燈10cm范圍內(nèi)操作。打開或蓋上瓶蓋需過火燒灼?！ち⒖虒⑽廴镜呐囵B(yǎng)瓶拿出來，看能不能收獲?！ち⒓礄z查同批培養(yǎng)的其他樣本，及時查找原因。觀察是整批樣本污染還是單個樣本污染：如果是兩線污染(這種情況在外周血培養(yǎng)中很少出現(xiàn))需先排除低滲液污染，排除取材(羊水穿刺)過程的污染，必須徹底消毒清潔培養(yǎng)室、超凈工作臺、培養(yǎng)箱；對于外周血單個樣本污染，先觀察留存的全血是否溶血并直接涂片染色，是抽血過程還是接種過程的污染，或此瓶培養(yǎng)基本身的污染(接種前可肉眼觀察培養(yǎng)基是否渾濁);如果僅僅一線則要考慮接種過程的污染，加強無菌.立即換液，并加入適量抗生素。●及早處理，可用滅菌生理鹽水沖洗后，加入低濃度抗生素?！o菌生理鹽水清洗三遍，再用培養(yǎng)基清洗兩遍，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。嚴(yán)格遵守?zé)o菌室的各項規(guī)章制度，樹立嚴(yán)格的無菌觀念，在操作過程中養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣。細(xì)菌真菌污染重在預(yù)防，如一旦發(fā)生，需立即隔離發(fā)生污染的培重采樣本等。問題04:羊水最佳收獲時機如何把握?·羊水細(xì)胞貼壁長至70%時為最適合?！Q液后細(xì)胞活性高，鏡下觀察多個細(xì)胞島，梭形細(xì)胞為背景，圓形細(xì)胞點綴，就像葉子和果實，并且表面有較多圓而亮的細(xì)胞說明可以收獲了?！ぴ诘捅剁R下有5~6個滿視野的大克隆，克隆中央細(xì)胞集中，邊緣有大而圓分散的羊水細(xì)胞?！駥τ陂L勢較差和生長過老的可以用胰酶消化后做原瓶或者傳代培養(yǎng)，第二天或三天細(xì)胞能長勢較好。.長梭形細(xì)胞克隆覆蓋一個或一個以上的4倍鏡視野；培養(yǎng)瓶有2-3個這類克隆；克隆中間細(xì)胞開始老化。.有5至7個充滿20倍鏡的大克隆，培養(yǎng)瓶內(nèi)有大克隆和小克隆加一起15個左右就可收獲。大克隆要正處在對數(shù)生長期沒有老化的·顯微鏡下看到細(xì)胞生長旺盛，未消化的細(xì)胞則取克隆中間老化，周邊生長旺盛，一個克隆鋪滿一個低倍視野，一瓶中有6-8個克隆。消化的細(xì)胞則細(xì)胞平鋪瓶底80%以上，且小圓細(xì)胞占30%。要點或補充說明：羊水細(xì)胞收獲時機應(yīng)把握“質(zhì)”與“量”兩個維度。“質(zhì)”是指細(xì)胞分裂的旺盛程度，可通過中期細(xì)胞占比，即其中的圓形細(xì)胞的比例推測。“量”是指細(xì)胞的總量，可通過觀察到的細(xì)胞總量和細(xì)胞類型推測。在合適的時機進行換液操作，同時進行做好羊水上清備份，減少失敗的可能性。問題05:如何提高絨毛培養(yǎng)的成功率、絨毛染色體的分辨率?解決方案：.取絨毛的量要足夠，絨毛必須剪切細(xì)碎，消化時間充分?！で薪q毛的時候可在培養(yǎng)皿先滴一小滴培養(yǎng)基，切的時候360度旋轉(zhuǎn)角度，切干的絨毛時候可用刀片沾一點培養(yǎng)基再濕切一下，切完用培養(yǎng)基沖洗刀片及培養(yǎng)皿，盡量收集完全。.可使用胰酶消化加機械研磨法制備懸液?！衽囵B(yǎng)基的量不宜太多，否則絨毛懸浮不易貼壁。·克隆貼壁生長不大但是已經(jīng)老化要刮下來吹散重新貼壁。·用質(zhì)量好的、新打開的培養(yǎng)基，如glbco培養(yǎng)基?！裾莆蘸檬斋@時機?！ぜ忧锪坎灰啵瑫r間短點。·臨床送檢要求：不要胎停時間過長的標(biāo)本；絨毛顏色過于暗黃或灰色或接種時完全沒有彈性的，不建議做培養(yǎng)?！さ纹瑫r懸液濃度不宜太濃，玻片傾斜30度左右分散更好?！と旧珪r，胰酶消化時間比羊水稍短。要點或補充說明：絨毛標(biāo)本與羊水標(biāo)本相比，對標(biāo)本質(zhì)量的要求更高、培養(yǎng)前的預(yù)處理和消化過程更為關(guān)鍵，其他因素可參考羊水染色體制備流程。問題06:季節(jié)交替或天氣變化時，如何保證在沒有分散儀的情況下維持滴片條件穩(wěn)定?解決方案：·注意滴片溫濕度，放置室內(nèi)溫濕度計，干燥時開加濕器或?qū)⒖照{(diào)調(diào)制冷模式會增加濕度；濕度過大時，用空調(diào)抽濕模式除濕。.設(shè)置一小范圍操作空間，方便使用加濕器或使用其它小型設(shè)備來維持需要的溫度或濕度?！駶穸瘸^30可以嘗試用干片(玻片不用浸水)。濕度在30以下用水片。·滴片前用濕抹布擦實驗臺，可地面噴水，增加濕度?！け狈降貐^(qū)天氣干燥時選擇蒸汽熏制法，夏天濕度60到70時用冰片過火方式進行制片。滴片時維持穩(wěn)定的溫濕度非常關(guān)鍵，應(yīng)采用各種加濕、除濕設(shè)備和措施加以維持，也可購買專用的儀器(如ChromprepS以及CDS-5)。如干片法滴片，玻片的處理要盡量一致；如用濕片法滴片，玻片缸的溫度要穩(wěn)定，比如加冰或者快速滴完。問題07:制備的染色體短小、發(fā)泡、發(fā)毛、條帶不清晰、肥胖、分散不足或過度分散、分裂相少，應(yīng)如何處理?·滴片時濕度過大導(dǎo)致，濕度控制在60以下。.可使用同步化試劑可改善條帶?！ふ{(diào)整滴片時的溫度、濕度，有條件可探索分散儀條件?！じ鼡Q秋水仙素品牌，或調(diào)整秋水仙素的濃度、加入量及處理時·分散不足可以冰片滴，在玻片拿起來即滴，然后放烤片機上；分散過度可先將玻片放置烤片機上，等水分干了再滴。·重新用更好的胰酶，或者降低胰酶濃度?！さ纹皟蓚€小時，把玻片放到-20℃冰箱急凍，滴片時，拿出玻片，先用吸管把玻片的水膜吹掉，然后再滴片。要點或補充說明：玻片老化程度、緩沖液PH值、胰酶效價、作用時間、水浴箱溫度、染液質(zhì)量、染色時間、玻片質(zhì)量、染色體長度等均可影響顯帶。玻片消化前預(yù)處理和消化后及時終止消化過程也很關(guān)鍵。問題08:N顯帶效果不好，如何處理?解決方案：·整個操作過程盡量避光進行?！衽渲圃噭┧俣纫?，配制硝酸銀溶液時要等硝酸銀完全溶解在水中后，再和配好的甲酸進行混合?！せ旌舷跛徙y和甲酸之后盡快滴到片子上，5分鐘以后的反應(yīng)液不要使用(長時間再使用容易使玻片出現(xiàn)背景很臟),想重新做，可以重新配制反應(yīng)液?！さ蝺傻畏磻?yīng)液到片子以后，用另外一張玻片輕輕蓋住(不要滑動玻片),放到60度的水浴箱溫浴5分鐘，取出玻片后用水沖洗，擦拭背面，放到配制好的吉姆薩染液染5到10秒左右，不用太久，否則容易出現(xiàn)銀染的隨體出現(xiàn)深染。·蓋玻片要夠重，大，覆蓋整個細(xì)胞面，不留氣泡?！て右欢ㄒ靖桑偃旧??！裣跛徙y一定要現(xiàn)配現(xiàn)用，滴硝酸銀的時候應(yīng)注意一次不要滴太多，并且也不要在同一個點滴，否則流出來，背景很臟，不利于觀看隨體?！袢酒⒁獗芄?，放置時間不能超過20分鐘，如硝酸銀溶液出現(xiàn)混濁不宜再用?！げ羚R紙用三到五層，一定要讓玻片上擦鏡紙變黑后再沖洗。沖洗要干凈。要點或補充說明：盡量避光操作、現(xiàn)配試劑、快速操作、及時沖洗干凈。問題09:核型分散不好，如何改善?解決方案：●胞漿多時，可在懸液中滴一滴冰乙酸。.不分散時，可以降低滴片溫度，或提高滴片高度?！み^于分散時，升高溫度或降低滴片高度。要點或補充說明增加固定液中冰醋酸比例有助于分散，滴片高度對分散質(zhì)量影響很小，因為分散過程是玻片上固定液蒸發(fā)的后期才開始的。如是低滲的問題，則需要重種細(xì)胞。問題10:如何減少染色體核型分析中導(dǎo)致的錯發(fā)，漏發(fā)報告?解決方案：·至少三個人審看報告。●條帶著絲粒盡量對齊擺放，遇到疑似的加大分析量?！窦訌娕R床與實驗室溝通，結(jié)合病人臨床信息，對可能存在易位等異常樣本進行認(rèn)真檢查。。對于不同的帶留夠不同的分析時間(550條帶每個病例的審核時間至少要留夠15分鐘)?！裉岣唛喥藛T的閱片水平，對帶紋譜，條帶特點有一個清晰的認(rèn)識。一般隱匿性的平衡易位患者多為反復(fù)流產(chǎn)或者懷過畸形胎兒的越長的染色體重疊的可能性就越大，如有遮擋，需增加分析量來減少漏診率。問題11:絨毛染色體發(fā)現(xiàn)嵌合，如何發(fā)放報告?解決方案：·排除母源污染，如實報告，并建議后