湘產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸的分離與鑒定[摘要]目的：分析并鑒定湘產(chǎn)土牛膝中所含化學(xué)成分。方法：化合物分離純化采用正相硅膠柱層析、反相硅膠柱層析、萃取法、溶劑重結(jié)晶法等多種方法，在單體結(jié)構(gòu)鑒定時采用核磁共振法。結(jié)果：成功地從湘產(chǎn)土牛膝中分得了一個化合物，即齊墩果酸。結(jié)論：湘產(chǎn)土牛膝中所含主要化學(xué)成分為齊墩果酸。[關(guān)鍵詞]土牛膝；分離與純化；齊墩果酸牛膝資源在我國廣泛分布，古語有云：“無牛膝，不過膝”，說的即是廣為人知的“四大懷藥”之一懷牛膝，其以引血下行補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨等收效而聞名，從古至今皆是活血良藥。此外，牛膝商品種類較多，川牛膝、土牛膝等在臨床亦有一定的使用。本次的研究對象為湖湘特色藥材土牛膝，土牛膝被2009版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄，來源于莧科植物土牛膝AchyranthesasperaLinnacus的干燥根及根莖，在秋冬時節(jié)采挖凋落地上部分；在初春時節(jié)，發(fā)苗時進(jìn)行采挖。作為民間藥，土牛膝主要用途在于治療白喉，且療效顯著?，F(xiàn)如今，在土牛膝的抗炎藥用研究方面。]在組氨所致炎癥模型的基礎(chǔ)上，觀測鄂產(chǎn)土牛膝的影響中發(fā)現(xiàn)其有一定的抑制作用效果，由此可以看出土牛膝具有一定的抗炎藥用價值，支持民間用于白喉等炎癥的治療。最好的例子為，建立家兔聲帶炎癥模型，通過觀測發(fā)現(xiàn)土牛膝提取物對家兔急性咽喉炎的癥狀有顯著抑制作用。鑒于現(xiàn)階段國內(nèi)外關(guān)于土牛膝的研究報道較少，為了進(jìn)一步充分開發(fā)和利用我省土牛膝植物資源，同時為以后的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考價值，本實驗對湘產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸（結(jié)構(gòu)式如圖1）的提取、分離與純化以及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了研究。圖1齊墩果酸(C30H48O3)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式1、試藥與儀器1.1材料土牛膝根,（產(chǎn)于湖南在冬末初春時期或秋季經(jīng)采摘、將莖葉及須根去除，清洗除去泥沙，洗凈，曬干）。經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智老師鑒定為莧科植物土牛膝AchyranthesasperaLinnacus的干燥根及根莖，現(xiàn)如今，其制作而成的憑證標(biāo)本在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心保存。1.2試劑甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯等試劑(分析純，湖南匯虹試劑有限公司）、香草醛硫酸顯色劑（自制），蒸餾水（自制）。柱層層析硅膠（100-200目）、反相硅膠ODS、薄層層析硅膠H（青島海洋化工有限公司）。1.3儀器三用電熱恒溫水浴箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）、ZF-1三用紫外分光光度計(北京啟航博達(dá)科技有限公司）、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）、R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）、SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、INOVA-600MHz核磁共振波譜儀、Agilent-ll00LC/MSD四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀等。2、實驗方法2.1湘產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸的提取取土牛膝粗粉4.45kg，乙醇回流提取3次，65℃減壓回收溶劑，加適量水分散，首先采用石油醚充分萃取，萃取后繼續(xù)采用乙酸乙酯充分萃取，減壓回收溶劑得乙酸乙酯浸膏45.9g。2.2湘產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸的分離純化用硅膠常壓柱色譜分離乙酸乙酯萃取物，使用石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇等洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)過硅膠薄層層析檢測后，總共獲得了155個組分（E1-155）。其中E97-106部分經(jīng)過ODS柱色譜，水-甲醇梯度洗脫(10%、30%、50%、70%、90%、100%甲醇)，共獲得81個亞組分（E97-106/1-81）。E97-106/15-17經(jīng)過ODS柱色譜，50%甲醇洗脫，又分得26個組分（E97-106/15-17/1-26）。E91-93部分，經(jīng)過ODS柱色譜，80%甲醇洗脫分離，分得主要化合物1（36.1mg）。2.3湘產(chǎn)土牛膝中齊墩果酸的結(jié)構(gòu)鑒定2.3.1薄層色譜分析對化合物1（a)、乙醇總提取物(b)、乙酸乙酯萃取物(c)用不同配比的展開劑進(jìn)行薄層色譜分析，化合物1的無色針狀結(jié)晶用甲醇溶解后點(diǎn)樣展開，再經(jīng)香草醛-濃硫酸反應(yīng)a點(diǎn)均呈顯紫色斑點(diǎn)，提示該化合物為三萜類化合物且濃度較純。b點(diǎn)為乙醇總提取物，極性較大，點(diǎn)樣處有深黑色斑點(diǎn)，提示在此三種配比的展開條件下其未完全展開。結(jié)果圖示如下，測得在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中化合物1的Rf值分別為0.57、0.60、0.31。二氯甲烷：甲醇（97：3）與三氯甲烷：甲醇（25：1）作為展開劑均可找到相對應(yīng)的斑點(diǎn)，但b、c二點(diǎn)處斑點(diǎn)不純，改用極性再小一點(diǎn)的二氯甲烷：甲醇（49：1）展開，可找到較純的紫色斑點(diǎn)，此條件展開適宜。ⅠⅡⅢ圖2化合物1（a)、乙醇總提取物(b)、乙酸乙酯萃取物(c)薄層色譜圖2.3.2波譜分析結(jié)合上述TLC分析，紫外燈下未見明顯熒光，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯紫色，說明該化合物可能為一三萜類。氫譜中，δ0.75-1.16范圍內(nèi)出現(xiàn)7個甲基質(zhì)子信號，說明為一齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，δ5.30（1H,m）該質(zhì)子歸屬為H-12，δ3.25（1H,m）歸屬為H-3。碳譜中，δ：182.9(C-28)(為羧基)，143.5(C-13)，122.6(C-12)，79.0(C-3)，55.2(C-5)，47.6(C-9)，46.5(C-17)，45.8(C-19)，41.6(C-18)，41.0(C-14)，39.2(C-8)，38.7(C-1)，38.4(C-4)，37.0(C-10)，33.8(C-21)，33.0(C-29)，32.6(C-7)，32.4(C-22)，30.6(C-20)，28.1(C-23)，27.6(C-15)，27.1(C-2)，25.9(C-27)，23.5(C-16)，23.4(C-30)，22.9(C-11)，18.3(C-6)，17.1(C-26)，15.5(C-24)，15.3(C-25)。以上碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致，確定其為齊墩果酸。3、實驗結(jié)論本文對土牛膝的根及根莖主要化學(xué)成分進(jìn)行研究，獲得了化合物1，并通過核磁共振數(shù)據(jù)分析鑒定化合物1為齊墩果酸。薄層分析中，選擇二氯甲烷：甲醇（49：1）展開，可找到較純的紫色斑點(diǎn)，展開條件適宜。且分離與鑒定出的齊墩果酸在湘產(chǎn)土牛膝中有一定的含量。結(jié)論縱觀我國牛膝植物資源，其種類復(fù)雜，即便是在同科之間，牛膝也會因為產(chǎn)地不同或種屬不同而在臨床應(yīng)用上有所區(qū)分。如主產(chǎn)于河南等地的懷牛膝，其引血下行而在下半身疾病治療上療效顯著；川牛膝主要產(chǎn)于四川等地，其抗炎活血之效遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于懷牛膝；而主要來源于安徽、湖南、浙江等地的土牛膝卻有極佳的清熱解毒之功效。比如采用土牛膝局部噴射治療白喉患者，結(jié)果顯示出患者癥膚消退，由此可證明土牛膝治漆白喉是有一定的作用。本文通過對湘產(chǎn)土牛膝的化學(xué)成分進(jìn)行研究，為挖掘湘產(chǎn)土牛膝的藥用價值提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。在市面上土牛膝與廣東土牛膝常?；煜?，廣東土牛膝為菊科植物華澤蘭EupatoriumchinenseL．的干燥根，研究者在性狀比較和顯微鑒別兩方面發(fā)現(xiàn)了二者的顯著差別。廣東土牛膝是廣東地區(qū)治療喉科疾病的要藥，其有效成分為黃酮苷、生物堿等，而作為湖南道地藥材，土牛膝當(dāng)之無愧的為我省獨(dú)家產(chǎn)品“喉咽清口服液”的君藥，該藥的處方來源于民間秘方，所謂“高手在民間”，而該藥目前已被開發(fā)成國家級新藥，收錄于《中國藥典2010年版一部》。雖然土牛膝具有顯著的抗炎活性，但目前其物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚。比較了不同形態(tài)的土牛膝與牛膝中齊墩果酸含量的差異，結(jié)果顯示出雖然土牛膝的質(zhì)地不如牛膝，但其齊墩果酸的含量卻高于后者。土牛膝臨床應(yīng)用相對廣泛，現(xiàn)代的科學(xué)研究表明，土牛膝具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗病毒、抗瘧、利尿、通便、緩瀉、平喘驅(qū)痰、抗過敏等多種重要的藥用功能。對土牛膝的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化研究，已經(jīng)從中分離鑒定出包括多糖、皂苷、生物堿、長鏈脂肪族、二羥基酮類化合物等。齊墩果酸多見于女貞子、龍膽等中草藥，同時鑒于其保護(hù)肝的藥理作用，齊墩果酸早已注冊成為保肝藥，此外還具有廣譜抗腫瘤作用，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，齊墩果酸的藥理作用有待更深的探索。本文對湘產(chǎn)土牛膝中的主要化學(xué)成分齊墩果酸進(jìn)行了分離與鑒定，以此為基礎(chǔ)，可以對土牛膝的化學(xué)成分進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，一則可以對其他活性成分進(jìn)行探索（如具有調(diào)節(jié)糖代謝等作用的植物甾酮類化合物等），二則可以對齊墩果酸的含量及提取方法進(jìn)行改良。[參考文獻(xiàn)][1]湖南省食品藥品監(jiān)督管理局.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版,2009:292.[2]劉翠霞