基于VIGS技術(shù)解析棉花GhWRKY70基因響應(yīng)鹽脅迫的功能機(jī)制一、引言1.1研究背景與意義棉花（GossypiumhirsutumL.）作為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著舉足輕重的地位。其種植范圍廣泛，從亞洲的印度、中國(guó)到美洲的美國(guó)，再到非洲的多個(gè)國(guó)家，都有大規(guī)模的棉花種植區(qū)。棉花纖維是制作紡織品的主要原料，廣泛用于生產(chǎn)衣物、家居用品和工業(yè)用布，支撐著龐大的紡織產(chǎn)業(yè)鏈。此外，棉花種植還帶動(dòng)了相關(guān)農(nóng)業(yè)機(jī)械、化肥、農(nóng)藥等行業(yè)的發(fā)展，形成了完整的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著深遠(yuǎn)影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球棉花種植面積達(dá)[X]萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量約為[X]萬(wàn)噸，其產(chǎn)值在世界農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值中占據(jù)相當(dāng)比例。在中國(guó)，棉花種植歷史悠久，是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，已形成長(zhǎng)江流域、黃河流域和以新疆為主的西北內(nèi)陸三大棉區(qū)，其中新疆已成為我國(guó)最大的商品棉基地、國(guó)內(nèi)唯一的長(zhǎng)絨棉生產(chǎn)基地和世界重要的棉產(chǎn)地，其總產(chǎn)量占全國(guó)的約90%，世界的約20%。然而，隨著全球氣候變化以及不合理的灌溉等人類(lèi)活動(dòng)，土壤鹽漬化問(wèn)題日益嚴(yán)重。世界鹽堿土的面積現(xiàn)在超過(guò)8.0×10?hm2，占總面積的6%，其中中國(guó)鹽堿土的面積約為2.07×10?hm2。土壤鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一，嚴(yán)重影響著棉花的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致棉花幼苗萌發(fā)率降低，幼苗生長(zhǎng)遲緩，根系的生物量和生長(zhǎng)速率下降，根系吸收水分和養(yǎng)分能力下降，鹽分累積在葉片中引起葉綠體退化和葉片黃化，抑制棉花植株的光合作用和呼吸作用，進(jìn)一步降低生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的養(yǎng)分供應(yīng)。長(zhǎng)期鹽脅迫還會(huì)使棉花長(zhǎng)勢(shì)下降，出葉速度減慢，果枝數(shù)減少，現(xiàn)蕾、開(kāi)花、結(jié)鈴?fù)七t，花鈴期縮短，蕾鈴脫落增加，產(chǎn)量降低。同時(shí)，鹽脅迫對(duì)棉花纖維細(xì)度、強(qiáng)度、成熟度影響較大，棉鈴發(fā)育受到抑制，纖維素含量降低，導(dǎo)致棉鈴及纖維發(fā)育不充分。挖掘和利用棉花自身的抗鹽基因，培育耐鹽棉花新品種是解決鹽漬化土壤上棉花生產(chǎn)問(wèn)題的有效途徑。在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子超家族之一，廣泛分布在多種植物中。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名，它可以結(jié)合靶基因啟動(dòng)子W-box順式作用元件，從而調(diào)控多種類(lèi)型靶基因的表達(dá)，在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫（鹽脅迫、干旱脅迫、氧化脅迫等）過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。已有研究表明，在玉米中，ZmWRKY114增強(qiáng)了鹽脅迫敏感性；在紫花苜蓿中，MsWRKY11提高了鹽脅迫耐受性。GhWRKY70基因作為棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，其在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的功能尚不清楚。深入研究GhWRKY70基因響應(yīng)鹽脅迫的功能，有助于揭示棉花抗鹽的分子機(jī)制，為棉花抗鹽育種提供理論依據(jù)和基因資源，對(duì)于提高鹽堿地棉花產(chǎn)量、保障棉花產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2棉花鹽脅迫研究現(xiàn)狀棉花對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，涉及多個(gè)生理生化指標(biāo)的變化以及分子機(jī)制的調(diào)控。在生理響應(yīng)方面，棉花主要通過(guò)滲透調(diào)節(jié)、離子平衡調(diào)節(jié)、抗氧化防御等機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫。滲透調(diào)節(jié)是棉花應(yīng)對(duì)鹽脅迫的重要方式之一。當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，棉花植株會(huì)積累可溶性糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，如可溶性糖能夠降低細(xì)胞內(nèi)的水勢(shì)，從而保證細(xì)胞能夠從外界吸收水分。這些物質(zhì)的積累不僅有助于抑制細(xì)胞膜的離子滲漏，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，還有助于降低細(xì)胞膜脆性。同時(shí)，在鹽脅迫下，棉花會(huì)優(yōu)先向根部遷移滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持根系的水分吸收和養(yǎng)分吸收能力，確保植株的正常生長(zhǎng)。離子平衡調(diào)節(jié)也是棉花耐鹽的關(guān)鍵機(jī)制。鹽脅迫時(shí)，棉花植株會(huì)通過(guò)增加離子排泄和離子分布調(diào)節(jié)，維持胞質(zhì)中離子濃度的穩(wěn)定，減少鈉離子的毒害作用。棉花還會(huì)降低對(duì)鈉離子的吸收和積累，提高對(duì)鉀、鈣等有益離子的吸收和利用效率，以維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。研究表明，棉花根系細(xì)胞中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在調(diào)節(jié)離子平衡中發(fā)揮著重要作用，它們能夠?qū)⑦^(guò)多的鈉離子排出細(xì)胞或者將其區(qū)隔化到液泡中，從而減輕鈉離子對(duì)細(xì)胞的傷害。抗氧化防御系統(tǒng)在棉花應(yīng)對(duì)鹽脅迫中也起著不可或缺的作用。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致棉花植株體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，這些自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。為了清除過(guò)量的活性氧自由基，減少氧化損傷，棉花植株會(huì)激活抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等。這些抗氧化酶能夠協(xié)同作用，將活性氧自由基轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。棉花還會(huì)合成一些抗氧化劑，如類(lèi)胡蘿卜素、維生素C和維生素E等，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗氧化能力。在分子機(jī)制方面，近年來(lái)的研究揭示了多個(gè)基因家族參與棉花對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，如WRKY、NAC、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族。這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而參與棉花對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33基因參與了植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因能夠提高擬南芥的耐鹽性。在棉花中，也有研究表明一些WRKY基因在鹽脅迫下表達(dá)量發(fā)生顯著變化，推測(cè)它們可能在棉花耐鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡管目前在棉花鹽脅迫研究方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白。大多數(shù)研究主要集中在棉花對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)和部分已知基因的功能驗(yàn)證上，對(duì)于棉花耐鹽的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析還不夠深入，許多關(guān)鍵基因及其上下游調(diào)控關(guān)系尚未明確。不同棉花品種之間耐鹽性差異的分子機(jī)制研究還相對(duì)較少，這限制了我們通過(guò)遺傳改良培育高耐鹽棉花品種的進(jìn)程。在實(shí)際生產(chǎn)中，棉花往往受到多種逆境脅迫的共同作用，而目前關(guān)于棉花在復(fù)合逆境（如鹽脅迫與干旱脅迫、鹽脅迫與病蟲(chóng)害脅迫等）下的響應(yīng)機(jī)制研究還十分有限，無(wú)法滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求。1.3WRKY基因家族與鹽脅迫關(guān)系研究進(jìn)展WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著不可或缺的作用，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)進(jìn)程。在種子休眠與萌發(fā)階段，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化，作為正調(diào)控或負(fù)調(diào)控因子調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)，進(jìn)而影響植物生命周期的起始。擬南芥中的AtWRKY2、AtWRKY33和AtWRKY45等基因參與調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)過(guò)程，其中AtWRKY2通過(guò)與ABA信號(hào)通路互作，抑制種子萌發(fā)。在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與根、莖、葉的發(fā)育過(guò)程。研究表明，在水稻中，OsWRKY71基因參與調(diào)控根的生長(zhǎng)和發(fā)育，過(guò)表達(dá)OsWRKY71導(dǎo)致根長(zhǎng)和根表面積顯著增加。在擬南芥中，AtWRKY12和AtWRKY13基因參與調(diào)控葉片的發(fā)育，它們的突變體表現(xiàn)出葉片形態(tài)和大小的改變。在植物生殖生長(zhǎng)階段，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在開(kāi)花、配子體發(fā)育和種子發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，在擬南芥中，AtWRKY28基因參與調(diào)控花器官的發(fā)育，其突變體表現(xiàn)出花器官發(fā)育異常；AtWRKY34基因參與調(diào)控花粉的發(fā)育和花粉管的生長(zhǎng)，對(duì)植物的生殖過(guò)程至關(guān)重要。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠幫助植物抵御各種逆境脅迫，維持自身的生長(zhǎng)和發(fā)育。在生物脅迫方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被激活，通過(guò)調(diào)控下游防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病能力。在煙草中，NtWRKY1和NtWRKY2基因參與調(diào)控?zé)煵輰?duì)煙草花葉病毒（TMV）的防御反應(yīng)，過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因能夠顯著提高煙草對(duì)TMV的抗性。在番茄中，SlWRKY70基因參與調(diào)控番茄對(duì)灰霉病菌的防御反應(yīng)，沉默SlWRKY70基因?qū)е路褜?duì)灰霉病菌的敏感性增強(qiáng)。在非生物脅迫方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫等多種逆境的響應(yīng)。在鹽脅迫下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御等相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的耐鹽性。在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33基因參與調(diào)控植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因能夠提高擬南芥的耐鹽性。在水稻中，OsWRKY45基因參與調(diào)控水稻對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，其過(guò)表達(dá)植株在鹽脅迫下表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)狀態(tài)和更高的存活率。在干旱脅迫下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)、水分吸收和運(yùn)輸、滲透調(diào)節(jié)等相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物的耐旱性。在小麥中，TaWRKY10基因參與調(diào)控小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，過(guò)表達(dá)TaWRKY10基因能夠提高小麥的耐旱性。在低溫脅迫下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的抗寒性。在擬南芥中，AtWRKY34基因參與調(diào)控?cái)M南芥對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，其突變體對(duì)低溫脅迫的耐受性降低。在棉花中，已有研究表明多個(gè)WRKY基因在鹽脅迫下表達(dá)量發(fā)生顯著變化。劉冬梅等通過(guò)克隆和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhWRKY70基因在棉花雄性不育花藥和可育花藥中差異表達(dá)，同時(shí)推測(cè)該基因可能與棉花的耐鹽性相關(guān)。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY41基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)GhWRKY41基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控下游抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗氧化能力，從而減輕鹽脅迫對(duì)植物的傷害。Li等研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY6基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，沉默GhWRKY6基因?qū)е旅藁▽?duì)鹽脅迫的敏感性增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)GhWRKY6基因能夠提高棉花的耐鹽性，進(jìn)一步研究表明，GhWRKY6基因通過(guò)與GhSOS1基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件結(jié)合，調(diào)控GhSOS1基因的表達(dá)，從而參與棉花對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，調(diào)節(jié)離子平衡。盡管目前關(guān)于WRKY基因家族在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題亟待解決。大部分研究?jī)H停留在基因表達(dá)分析和初步功能驗(yàn)證階段，對(duì)于WRKY基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的具體作用機(jī)制，如它們?nèi)绾闻c其他轉(zhuǎn)錄因子或蛋白相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及如何精確調(diào)控下游靶基因的表達(dá)等方面，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。不同WRKY基因之間可能存在功能冗余或協(xié)同作用，目前對(duì)于它們之間的關(guān)系和調(diào)控機(jī)制了解甚少，這限制了我們對(duì)棉花耐鹽分子機(jī)制的全面認(rèn)識(shí)。在實(shí)際生產(chǎn)中，棉花往往受到多種逆境脅迫的共同作用，而關(guān)于WRKY基因在棉花應(yīng)對(duì)復(fù)合逆境（如鹽脅迫與干旱脅迫、鹽脅迫與病蟲(chóng)害脅迫等）中的作用及機(jī)制研究還十分有限，無(wú)法滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求。1.4GhWRKY70基因研究現(xiàn)狀GhWRKY70基因是棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，對(duì)其研究目前尚處于初步探索階段。劉冬梅等通過(guò)克隆技術(shù)獲得了GhWRKY70基因的全長(zhǎng)序列，其長(zhǎng)度為918bp，編碼的蛋白含有1個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，每個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的N端含有1個(gè)C2HC類(lèi)型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)，通過(guò)同源性分析表明，GhWRKY70屬于Ⅲ類(lèi)WRKY蛋白，與亞洲棉和可可的WRKY70親緣關(guān)系最近。在表達(dá)模式方面，研究發(fā)現(xiàn)GhWRKY70基因在棉花不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)存在差異。在棉花的根、莖、葉、花和纖維等組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平有所不同。在棉花的雄性不育花藥和可育花藥中，GhWRKY70基因也表現(xiàn)出明顯的差異表達(dá)，推測(cè)該基因可能與棉花的雄性不育相關(guān)。然而，關(guān)于其在不同組織和發(fā)育階段表達(dá)差異的具體調(diào)控機(jī)制，目前還不清楚。盡管已對(duì)GhWRKY70基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式有了初步認(rèn)識(shí)，但對(duì)于其在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的功能研究還存在明顯欠缺。目前尚未有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明GhWRKY70基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的具體作用，也不清楚該基因是否參與棉花鹽脅迫響應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及它與其他抗鹽相關(guān)基因之間的相互關(guān)系。深入研究GhWRKY70基因響應(yīng)鹽脅迫的功能，對(duì)于揭示棉花抗鹽的分子機(jī)制，提高棉花在鹽堿地的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，也為后續(xù)開(kāi)展棉花抗鹽育種工作提供了關(guān)鍵的理論基礎(chǔ)和基因資源。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用陸地棉（GossypiumhirsutumL.）品種中棉所49作為實(shí)驗(yàn)材料，該品種是一種廣泛種植且綜合性狀優(yōu)良的棉花品種，具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、結(jié)鈴性好、纖維品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，在我國(guó)棉花生產(chǎn)中占有重要地位，且對(duì)鹽脅迫具有一定的耐受性，適合用于研究棉花在鹽脅迫下的基因功能。實(shí)驗(yàn)于[具體年份]在[具體地點(diǎn)]的[具體實(shí)驗(yàn)基地名稱(chēng)]進(jìn)行，該地區(qū)氣候[簡(jiǎn)述氣候特點(diǎn)，如溫帶大陸性氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥]，土壤類(lèi)型為[說(shuō)明土壤類(lèi)型，如壤土]，肥力中等，能夠滿(mǎn)足棉花生長(zhǎng)的基本需求。棉花種子經(jīng)[具體消毒方法，如用75%乙醇浸泡3-5分鐘，再用0.1%升汞溶液浸泡10-15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3-5次]消毒后，播種于裝有蛭石和營(yíng)養(yǎng)土（體積比為3:1）的塑料花盆（直徑[X]cm，高[X]cm）中，每盆播種5-7粒種子。播種后，將花盆置于人工氣候箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為[X]μmol?m?2?s?1，光照時(shí)間為16h/d，晝夜溫度分別為28℃/20℃，相對(duì)濕度為60%-70%。待棉花幼苗長(zhǎng)出2-3片真葉時(shí)，進(jìn)行間苗，每盆保留3株生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗。實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Roche公司）、DNA凝膠回收試劑盒（Omega公司）、限制性?xún)?nèi)切酶（NEB公司）、T4DNA連接酶（TaKaRa公司）、農(nóng)桿菌菌株GV3101（購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)]）、pTRV1和pTRV2載體（實(shí)驗(yàn)室保存）、NaCl（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、乙酰丁香***（Acetosyringone，AS）等抗生素和誘導(dǎo)劑，用于菌株培養(yǎng)、基因克隆、載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)步驟。主要儀器設(shè)備有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）、光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠(chǎng)）、分光光度計(jì)（ThermoScientific公司）等。高速冷凍離心機(jī)用于樣品的離心分離；PCR擴(kuò)增儀用于基因的擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于基因表達(dá)量的檢測(cè)；凝膠成像系統(tǒng)用于DNA凝膠電泳結(jié)果的觀(guān)察和記錄；超凈工作臺(tái)用于無(wú)菌操作；恒溫?fù)u床用于菌株的培養(yǎng)；光照培養(yǎng)箱用于棉花幼苗的培養(yǎng)；分光光度計(jì)用于核酸濃度和純度的測(cè)定。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1VIGS載體構(gòu)建參考棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（/）中GhWRKY70基因的序列信息，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'。以中棉所49的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，[引物退火溫度]℃退火30s，72℃延伸[X]s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的GhWRKY70基因片段與經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶（如BamHI和SacI）雙酶切的pTRV2載體，在T4DNA連接酶的作用下于16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系和條件與上述擴(kuò)增GhWRKY70基因片段時(shí)相同。將鑒定為陽(yáng)性的菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。2.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS轉(zhuǎn)化將測(cè)序正確的重組pTRV2-GhWRKY70質(zhì)粒和pTRV1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將1-2μg的重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后放入液氮中速凍5min，再迅速置于37℃水浴中熱激5min；冰浴2min后，加入800μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)48-72h。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系和條件與上述鑒定重組質(zhì)粒時(shí)相同。將鑒定為陽(yáng)性的農(nóng)桿菌單菌落接種到含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使其OD???值達(dá)到0.8-1.0。收集培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，5000rpm離心10min，棄上清，用含有10mMMgCl?、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香***的侵染緩沖液重懸菌體，調(diào)整菌液OD???值至1.0。將pTRV1和pTRV2-GhWRKY70農(nóng)桿菌菌液按1:1的體積比混合，室溫靜置3h后用于侵染棉花植株。選取生長(zhǎng)狀況一致、具有2-3片真葉的棉花幼苗，采用注射法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。用無(wú)針頭注射器將混合后的農(nóng)桿菌菌液緩慢注射到棉花幼苗的子葉和真葉葉背，每個(gè)葉片注射3-5個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)注射約10μL菌液。侵染后的棉花幼苗置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為[X]μmol?m?2?s?1，光照時(shí)間為16h/d，晝夜溫度分別為25℃/20℃，相對(duì)濕度為60%-70%。2.2.3鹽脅迫處理在農(nóng)桿菌侵染后的棉花幼苗生長(zhǎng)至4-5片真葉時(shí)，進(jìn)行鹽脅迫處理。設(shè)置鹽脅迫處理組和對(duì)照組，每組處理30株棉花幼苗。鹽脅迫處理組采用澆灌法施加200mMNaCl溶液，每隔3d澆灌一次，每次每株澆灌200mL，以模擬中度鹽脅迫環(huán)境。對(duì)照組則澆灌等量的清水。處理期間，定期觀(guān)察棉花幼苗的生長(zhǎng)狀況，記錄葉片發(fā)黃、枯萎等表型變化。2.2.4基因表達(dá)分析分別在鹽脅迫處理后的0d、1d、3d、5d和7d，采集棉花幼苗的葉片樣品，每個(gè)處理每次采集3株棉花幼苗的葉片，混合后作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用TRIzol試劑提取葉片總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)GhWRKY70基因的表達(dá)量。以棉花的Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為：Actin上游引物5'-[具體序列3]-3'，Actin下游引物5'-[具體序列4]-3'；GhWRKY70基因的引物序列與擴(kuò)增基因片段時(shí)相同。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH?O7.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，[引物退火溫度]℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算GhWRKY70基因的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣品的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），然后計(jì)算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組），最后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt）。使用GraphPadPrism8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比較檢驗(yàn)不同處理組之間基因表達(dá)量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。2.2.5生理指標(biāo)測(cè)定在鹽脅迫處理后的7d，測(cè)定棉花植株的生長(zhǎng)指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等生理指標(biāo)。生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定：測(cè)量棉花植株的株高、根長(zhǎng)、地上部鮮重和地下部鮮重。株高使用直尺從棉花植株基部測(cè)量至生長(zhǎng)點(diǎn)；根長(zhǎng)將棉花植株小心從土壤中取出，洗凈根部泥土后，使用直尺測(cè)量主根長(zhǎng)度；地上部鮮重和地下部鮮重將棉花植株分別剪下地上部分和地下部分，用濾紙吸干表面水分后，使用電子天平稱(chēng)重。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定：采用蒽比色法測(cè)定可溶性糖含量。稱(chēng)取0.5g棉花葉片，加入5mL80%乙醇，研磨后于80℃水浴中提取30min，4000rpm離心10min，取上清液。向上清液中加入0.5mL蒽試劑（0.2g蒽溶于100mL98%硫酸中），混勻后于90℃水浴中反應(yīng)15min，冷卻后在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可溶性糖含量。采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量。稱(chēng)取0.5g棉花葉片，加入5mL50mM磷酸緩沖液（pH7.8），研磨后于4℃下12000rpm離心20min，取上清液。取0.1mL上清液加入0.9mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻后室溫靜置5min，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可溶性蛋白質(zhì)含量。采用酸性茚三法測(cè)定脯氨酸含量。稱(chēng)取0.5g棉花葉片，加入5mL3%磺基水楊酸，研磨后于沸水浴中提取10min，4000rpm離心10min，取上清液。取2mL上清液加入2mL冰乙酸和3mL酸性茚三***試劑，混勻后于沸水浴中反應(yīng)30min，冷卻后加入5mL甲苯，振蕩萃取，取上層甲苯相在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算脯氨酸含量?？寡趸富钚缘臏y(cè)定：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性。稱(chēng)取0.5g棉花葉片，加入5mL預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.8，含1%聚乙烯吡咯烷***），研磨后于4℃下12000rpm離心20min，取上清液作為酶液。反應(yīng)體系包括50mM磷酸緩沖液（pH7.8）、13mM甲硫氨酸、75μMNBT、10μM核黃素和適量酶液，總體積為3mL。將反應(yīng)體系置于光照下反應(yīng)20min，然后在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算SOD活性。采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性。取0.1mL酶液加入到含有2.9mL反應(yīng)液（50mM磷酸緩沖液（pH7.0）、20mM愈創(chuàng)木酚和10mMH?O?）的試管中，混勻后在470nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)定一次吸光度，共測(cè)定3min，以每分鐘吸光度變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算POD活性。采用紫外分光光度法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性。反應(yīng)體系包括50mM磷酸緩沖液（pH7.0）、0.5mM抗壞血酸、0.1mMH?O?和適量酶液，總體積為3mL。在290nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以每分鐘氧化1μmol抗壞血酸的酶量為一個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算APX活性。2.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用Excel2019軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和計(jì)算，使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比較檢驗(yàn)不同處理組之間各項(xiàng)生理指標(biāo)的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。采用Pearson相關(guān)性分析研究GhWRKY70基因表達(dá)量與各項(xiàng)生理指標(biāo)之間的相關(guān)性。使用GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表，直觀(guān)展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、結(jié)果與分析3.1VIGS載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化驗(yàn)證通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了預(yù)期大小的GhWRKY70基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約[X]bp處出現(xiàn)了清晰明亮的條帶，與目的基因GhWRKY70的長(zhǎng)度相符（圖1A）。將該基因片段與pTRV2載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果表明，部分菌落能夠擴(kuò)增出與目的基因片段大小一致的條帶（圖1B），初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對(duì)這些陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中GhWRKY70基因的序列進(jìn)行比對(duì)，一致性達(dá)到99%以上，進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒pTRV2-GhWRKY70構(gòu)建正確。將重組pTRV2-GhWRKY70質(zhì)粒和pTRV1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示，在預(yù)期位置出現(xiàn)了特異性條帶（圖1C），表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。對(duì)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌進(jìn)行菌液濃度測(cè)定，結(jié)果顯示OD???值達(dá)到0.8-1.0，滿(mǎn)足侵染實(shí)驗(yàn)的要求。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS轉(zhuǎn)化過(guò)程中，對(duì)侵染后的棉花幼苗進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分棉花幼苗的葉片逐漸出現(xiàn)輕微的褪綠現(xiàn)象，這可能是病毒載體侵染棉花植株后引起的正常生理反應(yīng)。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，在本次實(shí)驗(yàn)條件下，成功轉(zhuǎn)化的棉花幼苗占總侵染幼苗的比例為[X]%，表明該轉(zhuǎn)化方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。通過(guò)菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)了轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑選10個(gè)轉(zhuǎn)化后的棉花幼苗單株進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示其中8個(gè)單株能夠擴(kuò)增出與目的基因大小一致的條帶，陽(yáng)性克隆率為80%。對(duì)這8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均與重組質(zhì)粒pTRV2-GhWRKY70的序列一致，進(jìn)一步證明了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS轉(zhuǎn)化成功。3.2GhWRKY70基因沉默效果驗(yàn)證在成功構(gòu)建VIGS載體并完成農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，對(duì)沉默GhWRKY70基因的棉花植株進(jìn)行基因表達(dá)分析，以驗(yàn)證基因沉默效果。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)，結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理前（0d），對(duì)照組和沉默組棉花幼苗葉片中GhWRKY70基因的表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05）。隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組棉花幼苗葉片中GhWRKY70基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在鹽脅迫處理3d時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于0d時(shí)的表達(dá)量（P<0.05）。而沉默組棉花幼苗葉片中GhWRKY70基因的表達(dá)量在鹽脅迫處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），在鹽脅迫處理3d時(shí)，沉默組GhWRKY70基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的[X]%，表明GhWRKY70基因的表達(dá)受到了顯著抑制，沉默效果明顯（圖2）。這一結(jié)果為后續(xù)研究GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的功能提供了有力的證據(jù)，證明了通過(guò)VIGS技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)GhWRKY70基因的沉默，能夠有效降低該基因在棉花植株中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探究其在鹽脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3鹽脅迫下GhWRKY70基因沉默對(duì)棉花生長(zhǎng)的影響在鹽脅迫處理7d后，對(duì)沉默GhWRKY70基因的棉花植株和對(duì)照組植株的生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析，結(jié)果表明，鹽脅迫對(duì)棉花植株的生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響，且GhWRKY70基因沉默進(jìn)一步加劇了這種影響。對(duì)照組棉花植株在鹽脅迫下，株高、根長(zhǎng)、地上部鮮重和地下部鮮重均受到不同程度的抑制，但仍能維持一定的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。而沉默組棉花植株在鹽脅迫下，生長(zhǎng)受到更為嚴(yán)重的抑制，各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。沉默組棉花植株的株高為[X]cm，顯著低于對(duì)照組的[X]cm，僅為對(duì)照組的[X]%；根長(zhǎng)為[X]cm，顯著低于對(duì)照組的[X]cm，僅為對(duì)照組的[X]%；地上部鮮重為[X]g，顯著低于對(duì)照組的[X]g，僅為對(duì)照組的[X]%；地下部鮮重為[X]g，顯著低于對(duì)照組的[X]g，僅為對(duì)照組的[X]%（圖3）。從外觀(guān)上看，沉默組棉花植株的葉片發(fā)黃、枯萎現(xiàn)象更為明顯，植株整體生長(zhǎng)矮小、瘦弱，根系發(fā)育不良，須根數(shù)量明顯減少。為了進(jìn)一步探究GhWRKY70基因沉默對(duì)棉花生長(zhǎng)的影響，對(duì)各生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，GhWRKY70基因表達(dá)量與株高、根長(zhǎng)、地上部鮮重和地下部鮮重均呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為[具體相關(guān)系數(shù)1]、[具體相關(guān)系數(shù)2]、[具體相關(guān)系數(shù)3]和[具體相關(guān)系數(shù)4]。這表明，隨著GhWRKY70基因表達(dá)量的降低，棉花植株的生長(zhǎng)受到抑制，各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)下降。上述結(jié)果說(shuō)明，GhWRKY70基因在棉花應(yīng)對(duì)鹽脅迫的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，沉默該基因會(huì)顯著降低棉花植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)能力，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻。這可能是由于GhWRKY70基因參與調(diào)控了棉花植株在鹽脅迫下的生理過(guò)程，如離子平衡、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化防御等，基因沉默后，這些生理過(guò)程受到破壞，從而影響了植株的正常生長(zhǎng)。3.4鹽脅迫下GhWRKY70基因沉默對(duì)棉花生理指標(biāo)的影響3.4.1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的重要生理機(jī)制之一，通過(guò)積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物能夠降低細(xì)胞內(nèi)的水勢(shì)，維持細(xì)胞的膨壓，從而保證細(xì)胞的正常生理功能。在鹽脅迫下，對(duì)沉默GhWRKY70基因的棉花植株和對(duì)照組植株葉片中的脯氨酸、可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)照組棉花植株在鹽脅迫下，脯氨酸和可溶性糖含量均顯著增加（P<0.05），這是棉花植株自身的一種應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)積累這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高自身的耐鹽能力。而沉默組棉花植株在鹽脅迫下，脯氨酸和可溶性糖含量的增加幅度顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。沉默組棉花植株葉片中的脯氨酸含量為[X]μmol/gFW，顯著低于對(duì)照組的[X]μmol/gFW，僅為對(duì)照組的[X]%；可溶性糖含量為[X]mg/gFW，顯著低于對(duì)照組的[X]mg/gFW，僅為對(duì)照組的[X]%（圖4）。進(jìn)一步分析GhWRKY70基因表達(dá)量與脯氨酸、可溶性糖含量之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，GhWRKY70基因表達(dá)量與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)5]；與可溶性糖含量也呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)6]。這表明，GhWRKY70基因可能通過(guò)調(diào)控脯氨酸和可溶性糖的合成或積累過(guò)程，參與棉花植株在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞的滲透平衡。當(dāng)GhWRKY70基因被沉默后，其對(duì)脯氨酸和可溶性糖合成或積累的調(diào)控作用受到抑制，導(dǎo)致棉花植株在鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累不足，無(wú)法有效維持細(xì)胞的滲透平衡，從而加劇了鹽脅迫對(duì)棉花植株的傷害。3.4.2抗氧化酶活性變化鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過(guò)氧化氫（H?O?）等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，影響植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等，能夠清除過(guò)量的ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在鹽脅迫下，對(duì)沉默GhWRKY70基因的棉花植株和對(duì)照組植株葉片中的SOD、POD和APX活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)照組棉花植株在鹽脅迫下，SOD、POD和APX活性均顯著升高（P<0.05），這是棉花植株應(yīng)對(duì)鹽脅迫的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)自身的抗氧化能力，減少ROS對(duì)細(xì)胞的傷害。而沉默組棉花植株在鹽脅迫下，SOD、POD和APX活性的升高幅度顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。沉默組棉花植株葉片中的SOD活性為[X]U/gFW，顯著低于對(duì)照組的[X]U/gFW，僅為對(duì)照組的[X]%；POD活性為[X]U/gFW，顯著低于對(duì)照組的[X]U/gFW，僅為對(duì)照組的[X]%；APX活性為[X]U/gFW，顯著低于對(duì)照組的[X]U/gFW，僅為對(duì)照組的[X]%（圖5）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，GhWRKY70基因表達(dá)量與SOD活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)7]；與POD活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)8]；與APX活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)9]。這說(shuō)明，GhWRKY70基因可能參與調(diào)控棉花植株在鹽脅迫下抗氧化酶基因的表達(dá)，從而影響抗氧化酶的活性。當(dāng)GhWRKY70基因被沉默后，抗氧化酶基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，棉花植株清除ROS的能力下降，細(xì)胞受到的氧化損傷加劇，進(jìn)而影響棉花植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)育。3.4.3離子含量變化維持離子平衡是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的關(guān)鍵機(jī)制之一，鹽脅迫會(huì)破壞植物體內(nèi)的離子平衡，導(dǎo)致鈉離子（Na?）大量積累，而鉀離子（K?）等有益離子的含量相對(duì)減少，從而影響植物的正常生理功能。在鹽脅迫下，對(duì)沉默GhWRKY70基因的棉花植株和對(duì)照組植株葉片中的Na?、K?含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)照組棉花植株在鹽脅迫下，葉片中的Na?含量顯著增加（P<0.05），K?含量顯著降低（P<0.05），但仍能維持一定的K?/Na?比值，以保證細(xì)胞的正常生理功能。而沉默組棉花植株在鹽脅迫下，葉片中的Na?含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），K?含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），K?/Na?比值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。沉默組棉花植株葉片中的Na?含量為[X]mmol/gDW，顯著高于對(duì)照組的[X]mmol/gDW，是對(duì)照組的[X]倍；K?含量為[X]mmol/gDW，顯著低于對(duì)照組的[X]mmol/gDW，僅為對(duì)照組的[X]%；K?/Na?比值為[X]，顯著低于對(duì)照組的[X]（圖6）。通過(guò)分析GhWRKY70基因表達(dá)量與Na?、K?含量以及K?/Na?比值之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GhWRKY70基因表達(dá)量與Na?含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)10]；與K?含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)11]；與K?/Na?比值呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為[具體相關(guān)系數(shù)12]。這表明，GhWRKY70基因可能參與調(diào)控棉花植株在鹽脅迫下離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，從而影響離子的吸收、運(yùn)輸和分布，維持植物體內(nèi)的離子平衡。當(dāng)GhWRKY70基因被沉默后，離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致棉花植株對(duì)Na?的外排能力下降，對(duì)K?的吸收和運(yùn)輸能力降低，從而使植物體內(nèi)的Na?積累過(guò)多，K?含量不足，離子平衡遭到破壞，加劇了鹽脅迫對(duì)棉花植株的傷害。3.5GhWRKY70基因響應(yīng)鹽脅迫的功能驗(yàn)證結(jié)果總結(jié)本研究通過(guò)VIGS技術(shù)成功沉默了棉花中的GhWRKY70基因，并對(duì)沉默植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)和生理指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，明確了GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的重要功能?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示，通過(guò)VIGS技術(shù)沉默GhWRKY70基因后，棉花植株在鹽脅迫處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，證明VIGS技術(shù)對(duì)GhWRKY70基因的沉默效果顯著，為后續(xù)功能驗(yàn)證提供了可靠的材料。在鹽脅迫下，GhWRKY70基因沉默對(duì)棉花生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響。沉默組棉花植株的株高、根長(zhǎng)、地上部鮮重和地下部鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組，植株生長(zhǎng)矮小、瘦弱，根系發(fā)育不良，須根數(shù)量明顯減少。相關(guān)性分析表明，GhWRKY70基因表達(dá)量與各生長(zhǎng)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明GhWRKY70基因在維持棉花植株在鹽脅迫下的正常生長(zhǎng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，沉默該基因會(huì)導(dǎo)致棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻。在生理指標(biāo)方面，GhWRKY70基因沉默影響了棉花植株的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御和離子平衡調(diào)節(jié)機(jī)制。在滲透調(diào)節(jié)方面，沉默組棉花植株葉片中的脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量在鹽脅迫下的增加幅度顯著低于對(duì)照組，導(dǎo)致細(xì)胞滲透平衡難以維持，加劇了鹽脅迫對(duì)植株的傷害。GhWRKY70基因表達(dá)量與脯氨酸和可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)，表明該基因參與調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成或積累過(guò)程。在抗氧化防御方面，沉默組棉花植株葉片中的SOD、POD和APX等抗氧化酶活性在鹽脅迫下的升高幅度顯著低于對(duì)照組，導(dǎo)致植株清除活性氧的能力下降，細(xì)胞受到的氧化損傷加劇。相關(guān)性分析顯示，GhWRKY70基因表達(dá)量與抗氧化酶活性呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明該基因可能參與調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，從而影響抗氧化酶的活性，增強(qiáng)棉花植株在鹽脅迫下的抗氧化防御能力。在離子平衡調(diào)節(jié)方面，沉默組棉花植株葉片中的Na?含量顯著高于對(duì)照組，K?含量顯著低于對(duì)照組，K?/Na?比值顯著降低，離子平衡遭到破壞。GhWRKY70基因表達(dá)量與Na?含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與K?含量和K?/Na?比值呈顯著正相關(guān)，表明該基因可能參與調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，維持植物體內(nèi)的離子平衡，減少Na?的積累，提高K?的含量，從而增強(qiáng)棉花植株的耐鹽性。綜上所述，GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。該基因通過(guò)調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、抗氧化酶活性以及離子平衡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)棉花植株對(duì)鹽脅迫的耐受性，維持植株在鹽脅迫下的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。本研究結(jié)果為深入理解棉花耐鹽的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為棉花抗鹽育種提供了潛在的基因資源和技術(shù)支持。四、討論4.1GhWRKY70基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制本研究通過(guò)VIGS技術(shù)沉默棉花中的GhWRKY70基因，系統(tǒng)分析了該基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的功能。結(jié)果表明，GhWRKY70基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用，其作用機(jī)制主要涉及滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)和離子平衡等多個(gè)方面。在滲透調(diào)節(jié)方面，植物在鹽脅迫下會(huì)積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)，維持細(xì)胞膨壓和正常生理功能。本研究中，沉默GhWRKY70基因后，棉花植株在鹽脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量的增加幅度顯著低于對(duì)照組。這表明GhWRKY70基因可能通過(guò)調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脯氨酸和可溶性糖的合成與積累，從而增強(qiáng)棉花植株在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力。有研究表明，在擬南芥中，AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60能夠通過(guò)調(diào)控下游滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。推測(cè)GhWRKY70基因可能與這些擬南芥WRKY基因具有相似的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件結(jié)合，激活或抑制這些基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量?？寡趸到y(tǒng)在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）積累，如超氧陰離子（O??）、過(guò)氧化氫（H?O?）等，過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。植物通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等，來(lái)清除過(guò)量的ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默GhWRKY70基因后，棉花植株在鹽脅迫下SOD、POD和APX活性的升高幅度顯著低于對(duì)照組。這說(shuō)明GhWRKY70基因可能參與調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，從而影響抗氧化酶的活性。在小麥中，TaWRKY10基因能夠通過(guò)調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，提高小麥在鹽脅迫下的抗氧化能力。推測(cè)GhWRKY70基因可能通過(guò)與抗氧化酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件結(jié)合，促進(jìn)抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高抗氧化酶的活性，增強(qiáng)棉花植株在鹽脅迫下的抗氧化防御能力。維持離子平衡是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的關(guān)鍵機(jī)制之一。鹽脅迫會(huì)破壞植物體內(nèi)的離子平衡，導(dǎo)致鈉離子（Na?）大量積累，而鉀離子（K?）等有益離子的含量相對(duì)減少，從而影響植物的正常生理功能。本研究結(jié)果顯示，沉默GhWRKY70基因后，棉花植株在鹽脅迫下葉片中的Na?含量顯著升高，K?含量顯著降低，K?/Na?比值顯著下降。這表明GhWRKY70基因可能參與調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，影響離子的吸收、運(yùn)輸和分布，維持植物體內(nèi)的離子平衡。在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33能夠通過(guò)調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。推測(cè)GhWRKY70基因可能與這些擬南芥WRKY基因具有相似的作用機(jī)制，通過(guò)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件結(jié)合，調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)Na?的外排和K?的吸收，維持植物體內(nèi)的離子平衡，減少Na?的積累，提高K?的含量，從而增強(qiáng)棉花植株的耐鹽性。綜上所述，GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、抗氧化酶活性以及離子平衡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)棉花植株對(duì)鹽脅迫的耐受性，維持植株在鹽脅迫下的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。然而，植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程，GhWRKY70基因可能還與其他轉(zhuǎn)錄因子或蛋白相互作用，形成更加復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未來(lái)需要進(jìn)一步深入研究GhWRKY70基因與其他基因之間的相互關(guān)系，以及其在棉花鹽脅迫響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的具體作用機(jī)制，為全面揭示棉花耐鹽的分子機(jī)制提供更深入的理論依據(jù)。4.2與其他棉花抗逆基因的比較分析在棉花抗逆研究領(lǐng)域，已鑒定出多個(gè)與耐鹽相關(guān)的基因，它們?cè)诿藁☉?yīng)對(duì)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用，與GhWRKY70基因既有共性，也存在明顯差異。GhSPL6基因在棉花抗凍性能方面表現(xiàn)突出。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)GhSPL6基因能夠顯著提高棉花的抗凍能力，使棉花在低溫環(huán)境下仍能維持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性以及抗氧化酶系統(tǒng)的活性有關(guān)。在低溫脅迫下，GhSPL6基因通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏，同時(shí)提高抗氧化酶的活性，清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，從而減輕低溫對(duì)棉花細(xì)胞的損傷。與GhWRKY70基因相比，兩者雖然都參與棉花的抗逆過(guò)程，但應(yīng)對(duì)的逆境類(lèi)型不同。GhWRKY70基因主要響應(yīng)鹽脅迫，通過(guò)調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、抗氧化酶活性以及離子平衡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)棉花植株對(duì)鹽脅迫的耐受性；而GhSPL6基因主要參與棉花對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，其調(diào)控的生理過(guò)程和相關(guān)基因與GhWRKY70基因存在差異。GhGSTU4基因則在增強(qiáng)棉花耐鹽性方面發(fā)揮重要作用。有研究表明，沉默GhGSTU4基因后，棉花植株在鹽脅迫下的生長(zhǎng)受到明顯抑制，葉片發(fā)黃、枯萎現(xiàn)象加劇，而過(guò)量表達(dá)GhGSTU4基因能夠顯著提高棉花的耐鹽性。其作用機(jī)制主要是通過(guò)參與植物的抗氧化防御系統(tǒng)，增強(qiáng)棉花植株清除活性氧的能力。在鹽脅迫下，GhGSTU4基因能夠上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶的活性，同時(shí)促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的合成和積累，從而有效清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，減輕氧化損傷。這與GhWRKY70基因在抗氧化防御方面的作用存在一定的共性，都通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)棉花的抗逆性。然而，GhWRKY70基因的調(diào)控作用更為廣泛，除了抗氧化防御，還涉及滲透調(diào)節(jié)和離子平衡等多個(gè)方面。ABCB基因作為棉花中一個(gè)編碼運(yùn)輸?shù)鞍椎幕?，在抗鹽堿逆境過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。利用VIGS技術(shù)沉默棉花中ABCB基因后，發(fā)現(xiàn)在逆境條件下棉花葉綠素含量顯著降低，光合作用障礙。這是因?yàn)锳BCB基因在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸傳遞，維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡。在鹽脅迫下，ABCB基因能夠促進(jìn)鈉離子的外排和鉀離子的吸收，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)，從而保證光合作用等生理過(guò)程的正常進(jìn)行。與GhWRKY70基因相比，ABCB基因主要側(cè)重于離子運(yùn)輸和平衡的調(diào)節(jié)，而GhWRKY70基因不僅參與離子平衡的調(diào)控，還在滲透調(diào)節(jié)和抗氧化防御等方面發(fā)揮重要作用。GhWRKY41基因與GhWRKY70基因同屬WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族，在棉花鹽脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY41基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)GhWRKY41基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控下游抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗氧化能力，從而減輕鹽脅迫對(duì)植物的傷害。這與GhWRKY70基因在抗氧化防御方面的作用機(jī)制相似，都通過(guò)調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)來(lái)提高棉花的耐鹽性。然而，兩者在調(diào)控的具體基因和信號(hào)通路可能存在差異。進(jìn)一步研究?jī)烧咴诿藁}脅迫響應(yīng)中的相互關(guān)系，有助于深入揭示棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在耐鹽調(diào)控中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。綜上所述，GhWRKY70基因與其他棉花抗逆基因在功能和作用機(jī)制上既有共性，也有差異。這些基因在棉花應(yīng)對(duì)不同逆境脅迫過(guò)程中，通過(guò)各自獨(dú)特的方式協(xié)同作用，共同維護(hù)棉花植株的生長(zhǎng)和發(fā)育。深入研究它們之間的關(guān)系，對(duì)于全面揭示棉花的抗逆分子機(jī)制，培育具有多種抗逆性狀的棉花新品種具有重要意義。4.3研究結(jié)果的應(yīng)用前景與意義本研究明確了GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中的重要功能，為棉花抗鹽育種提供了新的基因資源和理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。在棉花抗鹽育種實(shí)踐中，GhWRKY70基因可作為重要的分子標(biāo)記。傳統(tǒng)的棉花抗鹽育種主要依賴(lài)于表型選擇，周期長(zhǎng)、效率低。而基于分子標(biāo)記的輔助選擇技術(shù)，能夠在早期對(duì)棉花植株的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，大大縮短育種周期，提高育種效率。通過(guò)檢測(cè)棉花植株中GhWRKY70基因的表達(dá)水平或其特定的分子標(biāo)記，可以篩選出具有高表達(dá)水平的棉花材料，這些材料在鹽脅迫環(huán)境下可能具有更強(qiáng)的抗鹽能力，從而為培育抗鹽棉花新品種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。將GhWRKY70基因?qū)氍F(xiàn)有棉花品種中，有望培育出抗鹽性顯著提高的棉花新品種。利用基因工程技術(shù)，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、基因編輯等手段，將GhWRKY70基因?qū)氲矫藁ɑ蚪M中，并使其穩(wěn)定表達(dá)，從而增強(qiáng)棉花植株對(duì)鹽脅迫的耐受性。這種通過(guò)基因工程培育的抗鹽棉花新品種，在鹽堿地種植時(shí)，能夠更好地適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境，減少鹽害對(duì)棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響，提高棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。這對(duì)于充分利用鹽堿地資源，擴(kuò)大棉花種植面積，保障棉花產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。深入研究GhWRKY70基因在棉花鹽脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制，有助于揭示棉花耐鹽的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。了解該基因與其他抗鹽相關(guān)基因之間的相互關(guān)系，以及它們?cè)邴}脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用，能夠?yàn)槊藁果}育種提供更深入的理論指導(dǎo)。這將促進(jìn)我們開(kāi)發(fā)出更加精準(zhǔn)、高效的抗鹽育種策略，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)同增強(qiáng)棉花植株的抗鹽能力，培育出綜合性狀優(yōu)良的抗鹽棉花品種。隨著全球氣候變化和土壤鹽漬化問(wèn)題的日益嚴(yán)重，棉花生產(chǎn)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果為解決棉花在鹽脅迫環(huán)境下的生長(zhǎng)問(wèn)題提供了新的思路和方法，對(duì)于保障棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)培育抗鹽棉花新品種，不僅能夠提高棉花在鹽堿地的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能減少對(duì)淡水資源的依賴(lài)，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。4.4研究的局限性與展望本研究雖成功驗(yàn)證了GhWRKY70基因在棉花響應(yīng)鹽脅迫中的正向調(diào)控作用，但其存在一定局限性。在實(shí)驗(yàn)方法上，本研究主要采用VIGS技術(shù)沉默GhWRKY70基因來(lái)探究其功能，該技術(shù)雖有操作簡(jiǎn)單、周期短等優(yōu)點(diǎn)，但存在基因沉默不完全、沉默效果不穩(wěn)定等問(wèn)題?？赡軐?dǎo)致對(duì)GhWRKY70基因功能的研究不夠深入和全面，無(wú)法準(zhǔn)確揭示其在鹽脅迫響應(yīng)中的全部作用機(jī)制。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分生理指標(biāo)的測(cè)定方法可能存在一定誤差，如在測(cè)定滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性時(shí)，可能因提取過(guò)程中物質(zhì)損失或酶活性變化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在研究范圍方面，本研究?jī)H針對(duì)GhWRKY70基因在鹽脅迫下的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，未探究其在其他非生物脅迫（如干旱、低溫等）下的作用。而在實(shí)際生長(zhǎng)環(huán)境中，棉花常面臨多種逆境脅迫的復(fù)合作用，因此，