生物技術(shù)專升本2025年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作試卷（含答案）考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（每小題2分，共20分）1.在PCR反應(yīng)體系中，下列哪一項(xiàng)通常不是必需的？A.模板DNAB.引物C.DNA聚合酶D.mRNAE.dNTPs2.瓊脂糖凝膠電泳主要用于分離哪種分子？A.蛋白質(zhì)B.糖類C.脂類D.DNA或RNAE.多肽3.限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割DNA的特定序列，這個(gè)序列通常被稱為：A.操作子B.啟動(dòng)子C.回文序列D.編碼序列E.調(diào)控序列4.PCR技術(shù)的基本原理是：A.DNA復(fù)制B.RNA轉(zhuǎn)錄C.蛋白質(zhì)翻譯D.DNA修復(fù)E.DNA重組5.在基因克隆過(guò)程中，將外源DNA片段插入到載體DNA（如質(zhì)粒）中的步驟稱為：A.轉(zhuǎn)化B.切割C.連接D.擴(kuò)增E.提取6.DNA測(cè)序技術(shù)中，Sanger法屬于：A.化學(xué)降解法B.物理破碎法C.基于酶促合成的鏈終止法D.基于熒光標(biāo)記的片段分析法E.基于電泳遷移率的差異法7.在進(jìn)行DNA電泳時(shí)，通常使用哪種物質(zhì)作為支持介質(zhì)？A.毛細(xì)管B.硅膠C.瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠D.濾紙E.沙子8.下列哪種試劑常用于DNA變性？A.氯化鈉B.乙醇C.鹽酸D.甲醛E.氫氧化鈉9.將含有目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞（如細(xì)菌）的過(guò)程稱為：A.轉(zhuǎn)化B.轉(zhuǎn)染C.感染D.整合E.擴(kuò)增10.用于PCR擴(kuò)增的引物通常是多長(zhǎng)的寡核苷酸鏈？A.5-10個(gè)核苷酸B.15-20個(gè)核苷酸C.25-30個(gè)核苷酸D.35-50個(gè)核苷酸E.60-100個(gè)核苷酸二、填空題（每空1分，共15分）1.PCR的全稱是__________________________。2.電泳時(shí)，帶電粒子遷移的方向取決于其電荷性質(zhì)和______________。3.限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列通常是______________序列。4.DNA分子雜交是指帶有互補(bǔ)堿基序列的______________或______________在一定條件下形成雙鏈分子的過(guò)程。5.常用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是______________，它能耐高溫。6.在瓊脂糖凝膠電泳中，DNA分子的大小與其遷移速率成______________比。7.基因克隆的基本步驟包括：__________________、______________、______________和______________。8.RNA分子通常通過(guò)______________過(guò)程由DNA模板合成。三、名詞解釋（每小題3分，共15分）1.分子克隆2.載體3.PCR擴(kuò)增4.核酸雜交5.限制性內(nèi)切酶四、簡(jiǎn)答題（每小題5分，共20分）1.簡(jiǎn)述PCR反應(yīng)的基本步驟及其原理。2.簡(jiǎn)述瓊脂糖凝膠電泳的原理及其主要用途。3.簡(jiǎn)述限制性內(nèi)切酶在基因克隆中的作用。4.簡(jiǎn)述進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，無(wú)菌操作的重要性及主要措施。五、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)/論述題（每小題10分，共20分）1.假設(shè)你需要從含有雜質(zhì)的樣本中分離純化目的基因片段，請(qǐng)簡(jiǎn)述你會(huì)采用哪些主要實(shí)驗(yàn)步驟（包括所用主要試劑或技術(shù)），并說(shuō)明每一步的目的。2.解釋為什么在PCR反應(yīng)體系中需要加入引物，如果不加引物會(huì)有什么后果？請(qǐng)說(shuō)明PCR產(chǎn)物的大小是如何確定的。六、操作與判斷題（判斷下列說(shuō)法的正誤，正確的劃“√”，錯(cuò)誤的劃“×”，每小題2分，共10分）1.DNA在酸性環(huán)境中帶負(fù)電荷。（）2.任何限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列都能產(chǎn)生相同的粘性末端。（）3.PCR反應(yīng)需要加熱變性、冷卻復(fù)性、保溫延伸三個(gè)基本溫度循環(huán)。（）4.瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，電壓越高，遷移速度越快。（）5.基因測(cè)序的目的是確定DNA分子中堿基的排列順序。（）七、論述題（10分）結(jié)合你所學(xué)知識(shí)，論述基因克隆技術(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)（如疾病診斷、基因治療、生物制藥等）中的一個(gè)具體應(yīng)用實(shí)例，并簡(jiǎn)述其基本原理。試卷答案一、選擇題1.D2.D3.C4.A5.C6.C7.C8.D9.A10.B二、填空題1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)2.電場(chǎng)強(qiáng)度3.回文4.DNA，RNA5.Taq酶6.反比7.提取目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選和鑒定8.轉(zhuǎn)錄三、名詞解釋1.分子克?。褐笇⑻囟ǖ腄NA片段（目的基因）分離出來(lái)，并使其插入到載體DNA（如質(zhì)粒）中，然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞（如細(xì)菌）中擴(kuò)增，從而獲得大量目的基因拷貝的技術(shù)。2.載體：指能夠攜帶外源DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制和傳遞的分子，常用的載體包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。3.PCR擴(kuò)增：指在體外通過(guò)一對(duì)特異性引物，在DNA聚合酶、dNTPs和高溫等條件下，選擇性、酶促地復(fù)制特定DNA片段的技術(shù)。4.核酸雜交：指帶有互補(bǔ)堿基序列的DNA或RNA分子在一定條件下（通常需加熱變性后再冷卻）形成雙鏈分子的過(guò)程。5.限制性內(nèi)切酶：指能識(shí)別并切割DNA分子中特定識(shí)別序列（回文序列）的核酸酶，廣泛應(yīng)用于基因克隆、DNA測(cè)序等領(lǐng)域。四、簡(jiǎn)答題1.PCR反應(yīng)的基本步驟及其原理：*變性（Denaturation）：將反應(yīng)體系加熱至95℃左右，使雙鏈DNA解離成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA。原理：高溫破壞DNA氫鍵。*退火（Annealing）：將溫度降至50-65℃（具體溫度依引物Tm值而定），使引物與模板DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合。原理：低溫有利于引物與模板鏈形成氫鍵。*延伸（Extension）：將溫度升至72℃左右，DNA聚合酶以dNTP為原料，以模板DNA為模板，從引物起始位點(diǎn)向3'端延伸，合成新的DNA鏈。原理：Taq酶在較高溫度下具有活性，合成DNA。這三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，重復(fù)多次（通常30-40次），使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。2.瓊脂糖凝膠電泳的原理及其主要用途：*原理：瓊脂糖凝膠是一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多糖，帶有負(fù)電荷。在電場(chǎng)作用下，帶負(fù)電荷的DNA分子向正極遷移。由于凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的阻礙，分子量較大的DNA遷移速度較慢，分子量較小的DNA遷移速度較快。原理基于分子大小和電荷以及凝膠篩分效應(yīng)。*主要用途：主要用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；檢測(cè)DNA或RNA的存在；估算DNA片段的大?。贿M(jìn)行DNA片段的混合物分析等。3.限制性內(nèi)切酶在基因克隆中的作用：*限制性內(nèi)切酶在基因克隆中主要用于切割外源DNA和載體DNA。它們?cè)谔囟ǖ淖R(shí)別序列（通常為回文序列）處切割DNA，產(chǎn)生粘性末端或平末端。*通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割，可以獲得含有目的基因片段和載體DNA的線性分子。*切割產(chǎn)生的粘性末端（如果識(shí)別序列相同或互補(bǔ)）可以與載體上相應(yīng)的粘性末端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接，這是構(gòu)建重組質(zhì)粒的關(guān)鍵步驟。4.進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，無(wú)菌操作的重要性及主要措施：*重要性：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，特別是涉及細(xì)胞或微生物的實(shí)驗(yàn)（如轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)），以及后續(xù)的PCR等擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，都需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作。這是為了防止外源微生物（細(xì)菌、真菌等）的污染。*污染的后果：外源微生物的污染會(huì)與實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆肿痈?jìng)爭(zhēng)資源、產(chǎn)生干擾物質(zhì)、影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如PCR假陽(yáng)性、基因克隆失敗等），甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。*主要措施：*保持工作區(qū)域清潔、干燥。*使用無(wú)菌的器皿、試劑和耗材。*在超凈工作臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行操作。*操作前和操作中注意手部衛(wèi)生，如洗手、佩戴手套。*使用無(wú)菌的接種環(huán)、移液器吸頭等。*對(duì)培養(yǎng)基、溶液等進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。*操作時(shí)避免說(shuō)話、咳嗽等產(chǎn)生氣溶膠的行為。五、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)/論述題1.從含有雜質(zhì)的樣本中分離純化目的基因片段的步驟及目的：*步驟1：DNA提取。從樣本（如組織、細(xì)胞）中提取總DNA。目的：獲取包含目的基因在內(nèi)的所有DNA片段。*步驟2：核酸酶消化（可選）。使用RNA酶去除RNA污染，使用蛋白酶K等消化蛋白質(zhì)雜質(zhì)。目的：去除RNA和蛋白質(zhì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。*步驟3：蛋白酶K消化（可選）。使用蛋白酶K在特定條件下消化蛋白質(zhì)。目的：進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)污染。*步驟4：酚-氯仿抽提或試劑盒純化。利用蛋白質(zhì)在酚-氯仿中變性沉淀，而DNA溶于水的特性，分離DNA?；蚴褂蒙逃玫腄NA提取試劑盒，通過(guò)silica柱吸附等方法純化DNA。目的：去除酚、氯仿、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，獲得較純的DNA溶液。*步驟5：乙醇沉淀或NaCl沉淀。向純化后的DNA溶液中加入乙醇（通常含NaCl），使DNA析出。目的：進(jìn)一步純化DNA，去除殘留的鹽和乙醇不溶物。*步驟6：溶解。將沉淀的DNA用無(wú)核酸酶水溶解。目的：獲得可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如PCR、酶切等）的純化DNA片段。2.PCR引物的作用及不加引物的后果；PCR產(chǎn)物大小的確定：*引物的作用：PCR反應(yīng)需要一對(duì)特異性引物。引物是短的（通常15-20nt）單鏈DNA或RNA片段，其序列與目的DNA片段的兩端互補(bǔ)。在PCR高溫變性后，引物通過(guò)與模板DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，為DNA聚合酶提供起始合成的位點(diǎn)。DNA聚合酶從此起始位點(diǎn)開(kāi)始，沿著模板鏈延伸，合成新的DNA鏈。因此，引物決定了PCR擴(kuò)增的起始點(diǎn)和目的片段的特異性。*不加引物的后果：如果PCR反應(yīng)體系中缺少引物，DNA聚合酶雖然可以在模板存在的情況下合成新的DNA鏈，但它是隨機(jī)起始合成的，無(wú)法特異性地?cái)U(kuò)增特定的目標(biāo)片段。結(jié)果將是產(chǎn)生大量大小不一、難以分離和分析的隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物，或者幾乎沒(méi)有特異性產(chǎn)物，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。*PCR產(chǎn)物大小的確定：PCR產(chǎn)物的大?。碊NA片段的長(zhǎng)度）等于兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的距離，也就是模板DNA片段的長(zhǎng)度?？梢酝ㄟ^(guò)將PCR產(chǎn)物與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（Ladder）一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較PCR產(chǎn)物在凝膠中遷移的距離與標(biāo)準(zhǔn)品條帶遷移距離的關(guān)系，從而確定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。六、操作與判斷題1.√2.×(不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別不同的序列，即使序列是回文序列，也可能不同；即使識(shí)別序列相同，也可能產(chǎn)生不同的粘性或平末端。)3.√4.√(在凝膠孔中，電壓越高，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，粒子所受電場(chǎng)力越大，遷移速度越快，前提是溫度等其他條件適宜，且不導(dǎo)致焦耳熱過(guò)載。)5.√七、論述題基因克隆技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用實(shí)例：重組蛋白藥物的生產(chǎn)。*應(yīng)用實(shí)例：利用基因克隆技術(shù)生產(chǎn)胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素、單克隆抗體等重要的生物藥物。*基本原理：1.獲取目標(biāo)基因：從人類基因組或基因文庫(kù)中獲取編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)（如胰島素）的基因序列。2.構(gòu)建表達(dá)載體：將目標(biāo)基因插入到克隆載體（如表達(dá)質(zhì)粒）中，并在載體上加入合適的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等調(diào)控元件，確?；蚰茉谒拗骷?xì)胞（如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物