基于免疫層析法的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條創(chuàng)新研制與應(yīng)用探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1山羊傳染性胸膜肺炎的危害山羊傳染性胸膜肺炎（ContagiousCaprinePleuropneumonia，CCPP），俗稱“爛肺病”，是由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）引起的山羊的一種高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告?zhèn)魅静≈?。該病傳播迅速，發(fā)病率和致死率較高，給山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在流行病學(xué)方面，CCPP主要通過空氣飛沫經(jīng)呼吸道傳播，在自然條件下，絲狀支原體山羊亞種只感染山羊，3歲以下的山羊最為易感。病羊和帶菌羊是主要傳染源，呈地方性流行，冬春季節(jié)發(fā)病率及死亡率較高，羊舍衛(wèi)生條件差、羊群密集擁擠、羊只營養(yǎng)不良、天氣陰冷潮濕、氣溫驟變等因素均可誘發(fā)該病的發(fā)生。CCPP對山羊養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)影響是多方面的。在發(fā)病致死率上，一旦羊群感染，在未及時(shí)有效防控的情況下，病死率可高達(dá)30%-50%，甚至更高。如福鼎市某羊場存欄山羊730只，2020年12月引入新羊后引發(fā)疫情，20多天內(nèi)154只羊發(fā)病，發(fā)病率為20.8%，死亡27只，死亡率為3.6%。在生長性能方面，患病山羊生長速度明顯下降，飼料報(bào)酬降低。即使病羊耐過，其生長發(fā)育也會受到嚴(yán)重影響，體重增長緩慢，肉質(zhì)變差，降低了養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，患病山羊的繁殖性能也會受到損害，懷孕母羊多發(fā)生流產(chǎn)，這不僅減少了羊只的數(shù)量，還影響了羊群的品質(zhì)和后續(xù)的養(yǎng)殖計(jì)劃。為了防控CCPP，養(yǎng)殖戶需要投入更多的養(yǎng)殖成本。一方面，需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提供良好的生長環(huán)境，保證圈舍通風(fēng)良好，每天及時(shí)清理舍內(nèi)的糞便和污染物，保持羊舍的清潔衛(wèi)生，每年春秋兩季各驅(qū)蟲1次，冬春時(shí)節(jié)控制好羊群的飼養(yǎng)密度，避免過度擁擠，這些措施都需要投入更多的人力、物力和財(cái)力。另一方面，還需要定期對羊舍場地、用具、飼料、飲水等進(jìn)行消毒，常用的消毒藥物包括百毒殺、3%福爾馬林溶液和生石灰等，根據(jù)不同環(huán)境條件和季節(jié)合理選擇消毒頻率，這也增加了養(yǎng)殖成本。一旦疫情發(fā)生，還需要對病羊進(jìn)行隔離治療，或直接淘汰處理，病死羊及被污染的糞便要做無害化處理，這些都會進(jìn)一步加重養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1.1.2現(xiàn)有檢測方法的局限性目前，針對山羊傳染性胸膜肺炎的檢測，國外已報(bào)道多種血清學(xué)診斷方法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、競爭ELISA試驗(yàn)等，但這些傳統(tǒng)方法存在諸多局限性，難以滿足實(shí)際檢測需求。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)雖然具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)結(jié)果明顯、試驗(yàn)條件要求低等優(yōu)點(diǎn)，但參與反應(yīng)的成分較多，包括抗原、抗體、補(bǔ)體、溶血素等，它們之間相互影響，需要逐個(gè)仔細(xì)滴定，操作步驟較為繁瑣并且要求十分嚴(yán)格，稍有疏忽便容易出現(xiàn)錯(cuò)誤而影響結(jié)果。補(bǔ)體性質(zhì)較不穩(wěn)定，影響因素復(fù)雜，易受理化因素的影響，加熱、紫外線照射、機(jī)械震蕩、酸堿和乙醇等因素均可破壞補(bǔ)體，難于標(biāo)準(zhǔn)化。如遇待測血清標(biāo)本有抗補(bǔ)體作用的抗原，會使試驗(yàn)難以進(jìn)行。競爭ELISA試驗(yàn)存在檢測范圍相對較窄的問題，由于其檢測原理是基于競爭抑制，濃度過高或過低的待測物可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，限制了可檢測的濃度范圍。準(zhǔn)確性可能受競爭不完全的影響，在競爭反應(yīng)中，如果標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合能力存在差異，或者反應(yīng)條件不理想，可能導(dǎo)致競爭不完全，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法對試劑的要求較高，需要標(biāo)記的抗原或抗體具有高純度和高活性，并且標(biāo)記過程可能會影響其結(jié)合性能，重復(fù)性可能較差，不同批次實(shí)驗(yàn)之間的重復(fù)性可能不如其他方法穩(wěn)定。樣品中的雜質(zhì)或其他類似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可能會干擾競爭反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。這些傳統(tǒng)檢測方法還普遍需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，對操作人員的技術(shù)水平要求也較高，檢測時(shí)間較長，成本較高，難以在基層養(yǎng)殖場或現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，無法滿足我國動物疾病診斷實(shí)際中快速、易于操作和適于基層使用的要求，限制了對山羊傳染性胸膜肺炎的及時(shí)監(jiān)測和防控。1.1.3免疫層析法的優(yōu)勢及應(yīng)用前景免疫層析法是一種新型的固相免疫標(biāo)記檢測技術(shù)，具有諸多顯著優(yōu)勢，在動物疫病檢測中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。免疫層析法操作簡單、快速，無需專業(yè)的儀器設(shè)備和專業(yè)的人員，樣品也無需復(fù)雜處理。一般情況下，5-10min內(nèi)即可直接通過目測得到直觀的檢測結(jié)果。這使得在基層養(yǎng)殖場或現(xiàn)場，養(yǎng)殖人員或獸醫(yī)技術(shù)人員能夠快速進(jìn)行檢測，及時(shí)了解羊群的健康狀況，為疫病的防控爭取寶貴的時(shí)間。該方法具有較高的靈敏度和特異性。以高質(zhì)量的單克隆抗體標(biāo)記膠體金，診斷下限可達(dá)10pg，并且對組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，能夠準(zhǔn)確地檢測出山羊傳染性胸膜肺炎抗體，減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，為疫病的診斷提供可靠的依據(jù)。免疫層析法的生產(chǎn)成本低，試紙組成結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)中使用的設(shè)備及耗材成本低，相對易于制造和進(jìn)行批量生產(chǎn)，降低了檢測成本，有利于在大規(guī)模養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用。其應(yīng)用范圍廣，可檢測的樣品多樣，如體液、唾液、尿液、全血、血漿、血清等，既可以檢測抗體，也可以檢測抗原，適用于山羊傳染性胸膜肺炎的不同檢測需求。免疫層析試紙條的保質(zhì)期一般為12-24個(gè)月，通常不需要冷藏，試劑比較穩(wěn)定，檢測結(jié)果能長時(shí)間保存于室溫，無鄰苯二胺等有害物質(zhì)的參與，不會影響操作人員的健康，也不會污染環(huán)境，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，便于運(yùn)輸。在動物疫病診斷領(lǐng)域，免疫層析法已經(jīng)在多種動物疫病檢測中得到應(yīng)用并取得了良好的效果。如在豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、布魯氏菌等疫病的檢測中，研制出的膠體金免疫層析檢測試紙條都具有良好的特異性、敏感性以及較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。因此，將免疫層析法應(yīng)用于山羊傳染性胸膜肺炎抗體的檢測，有望解決傳統(tǒng)檢測方法的不足，為山羊傳染性胸膜肺炎的快速診斷和防控提供有力的技術(shù)支持，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀山羊傳染性胸膜肺炎作為嚴(yán)重威脅山羊養(yǎng)殖業(yè)的疫病，其檢測技術(shù)一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。國外對山羊傳染性胸膜肺炎的研究開展較早，在血清學(xué)診斷方法上，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法雖有應(yīng)用，但因其自身局限性，在實(shí)際檢測中受到諸多限制。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)由于參與反應(yīng)成分多、補(bǔ)體不穩(wěn)定、操作繁瑣且難以標(biāo)準(zhǔn)化等問題，在臨床應(yīng)用中逐漸減少。競爭ELISA試驗(yàn)存在檢測范圍窄、準(zhǔn)確性受競爭不完全影響、對試劑要求高、重復(fù)性較差以及易受干擾等缺點(diǎn)，也無法滿足快速、準(zhǔn)確檢測的需求。國內(nèi)在山羊傳染性胸膜肺炎檢測技術(shù)方面也進(jìn)行了大量研究。早期主要依賴國外引進(jìn)的傳統(tǒng)檢測方法，但隨著對疫病防控需求的不斷提高，國內(nèi)開始積極探索新的檢測技術(shù)。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)如PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等在山羊傳染性胸膜肺炎檢測中得到應(yīng)用，這些技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，但對儀器設(shè)備和操作人員要求較高，檢測成本也相對較高，限制了其在基層的廣泛應(yīng)用。免疫層析法作為一種新型的檢測技術(shù)，在山羊傳染性胸膜肺炎檢測領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。國外在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面處于領(lǐng)先地位，不斷優(yōu)化技術(shù)參數(shù)，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。如在膠體金標(biāo)記物的制備、免疫反應(yīng)條件的優(yōu)化等方面進(jìn)行了深入研究，開發(fā)出了多種性能優(yōu)良的免疫層析檢測產(chǎn)品。國內(nèi)對免疫層析法檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體的研究也取得了一定進(jìn)展。有研究運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，以山羊支原體山羊肺炎亞種全菌為抗原，免疫健康家兔獲得多克隆抗體，通過一系列實(shí)驗(yàn)制備出檢測抗體的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條對已知陽性和陰性血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測時(shí)間約10min，陽性血清在檢測線和質(zhì)控線出現(xiàn)兩條明顯的紅色條帶，陰性血清僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)結(jié)果相符。對試紙條進(jìn)行的敏感性、重復(fù)性、特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血清效價(jià)為1：1024的Mccp陽性血清稀釋80倍仍可檢測出來，不同批次試紙條重復(fù)檢測結(jié)果無明顯差異，且試紙條不與綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種等血清有交叉反應(yīng)，表明該試紙條具有較高的敏感性、重復(fù)性和特異性，為山羊傳染性胸膜肺炎的快速診斷奠定了基礎(chǔ)。然而，目前免疫層析法在山羊傳染性胸膜肺炎檢測中的應(yīng)用仍存在一些問題。部分試紙條的靈敏度和特異性還有提升空間，不同廠家生產(chǎn)的試紙條質(zhì)量參差不齊，在實(shí)際應(yīng)用中可能出現(xiàn)檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的情況。對免疫層析法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化研究還不夠完善，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和檢測操作規(guī)程，影響了該技術(shù)的推廣和應(yīng)用?？傮w而言，免疫層析法在山羊傳染性胸膜肺炎抗體檢測方面展現(xiàn)出了巨大的潛力和優(yōu)勢，但仍需要進(jìn)一步深入研究和優(yōu)化，以解決現(xiàn)有問題，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，滿足山羊養(yǎng)殖業(yè)對疫病快速診斷和防控的需求。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在運(yùn)用免疫層析技術(shù)，研制出高靈敏度、特異性和重復(fù)性的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條，為山羊傳染性胸膜肺炎的快速診斷提供有效工具，具體研究內(nèi)容如下：抗原與抗體的制備及純化：選擇具有代表性的山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）抗原，運(yùn)用基因工程技術(shù)對其進(jìn)行克隆和重組，獲取純化的重組抗原。采用Mccp全菌作為抗原，按照常規(guī)方法免疫健康家兔，通過間接血凝試驗(yàn)檢測抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1：1024以上時(shí)，收集兔血清。隨后，運(yùn)用硫酸銨鹽析和ProteinG抗體純化柱等方法，獲取兔抗Mccp多克隆抗體，并利用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）法檢測其純度，確?？贵w的質(zhì)量和活性。膠體金標(biāo)記物的制備與優(yōu)化：使用檸檬酸三鈉還原法制備特定粒徑（如25nm）的膠體金顆粒，將純化后的Mccp抗原或抗體標(biāo)記到膠體金上。通過實(shí)驗(yàn)精確測定最佳標(biāo)記量和最適pH值，例如，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定最佳標(biāo)記量為50μg/ml，最適pH值為7.0。采用低溫超速離心法對標(biāo)記好的金標(biāo)抗原進(jìn)行純化，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，提高標(biāo)記物的純度和穩(wěn)定性。試紙條的組裝與性能評價(jià)：將克隆重組的Mccp抗原與金標(biāo)記抗體標(biāo)記在硝酸纖維素膜（NC）等固相載體上，組裝成山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條。對試紙條進(jìn)行性能評價(jià)，包括敏感性、重復(fù)性、特異性等方面的實(shí)驗(yàn)。如檢測血清效價(jià)為1：1024的Mccp陽性血清，稀釋80倍后仍能被檢測出來，以驗(yàn)證其敏感性；對不同批次試紙條進(jìn)行重復(fù)檢測，結(jié)果無明顯差異，證明其重復(fù)性良好；檢測試紙條不與綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種等血清發(fā)生交叉反應(yīng)，確認(rèn)其特異性。臨床樣本檢測與應(yīng)用驗(yàn)證：收集臨床山羊血清樣本，運(yùn)用研制的試紙條進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)檢測方法（如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、競爭ELISA試驗(yàn)等）進(jìn)行對比分析，評估試紙條在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。對一定數(shù)量的臨床樣本進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)分析試紙條與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果的符合率，進(jìn)一步驗(yàn)證試紙條的臨床應(yīng)用價(jià)值，為山羊傳染性胸膜肺炎的快速診斷和防控提供技術(shù)支持。二、免疫層析法原理及相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1免疫層析法基本原理免疫層析法是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)相結(jié)合的免疫分析方法，其核心原理基于抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過巧妙的設(shè)計(jì)和操作，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的快速、便捷檢測。2.1.1膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金（colloidalgold），又稱金溶膠（goldsolution），是指分散相粒子直徑在1-150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。它由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液，膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。較小的膠體金顆粒基本是圓球形的，較大顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形，在電子顯微鏡下可清晰觀察其顆粒形態(tài)。膠體金具有獨(dú)特的特性。從膠體性質(zhì)來看，其顆粒大小多在1-100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，形成膠體金溶液。膠體金對電解質(zhì)極為敏感，電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，進(jìn)而從液體中沉淀下來。而某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)卻能保護(hù)膠體金，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。在呈色性方面，微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色存在一定差別。最小的膠體金（2-5nm）呈橙黃色，中等大小的膠體金（10-20nm）為酒紅色，較大顆粒的膠體金（30-80nm）則呈現(xiàn)紫紅色，利用這一特點(diǎn)，可通過肉眼觀察膠體金的顏色粗略估計(jì)金顆粒的大小。膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)光吸收峰的波長（λmax）在510-550nm范圍內(nèi)，且隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長波長，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長。膠體金的制備多采用還原法，氯金酸（HAuC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm-150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法，具體操作如下：首先將HAuC14配制成0.01%水溶液，取100ml加熱至沸；然后在攪動下準(zhǔn)確加入一定量的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）水溶液；繼續(xù)加熱煮沸15min，此過程中可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，繼而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，全過程約2-3min；最后冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法制備的金顆粒大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制一般認(rèn)為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽性電荷通過靜電感應(yīng)相附。環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會對蛋白質(zhì)的吸附產(chǎn)生影響。在免疫測定中，膠體金常與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，形成的膠體金結(jié)合物稱為免疫金復(fù)合物，簡稱免疫金。免疫金復(fù)合物在免疫檢測中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其標(biāo)記后的抗體保留了免疫活性，同時(shí)具備了膠體金的顯色特性，為免疫檢測提供了可視化的依據(jù)。2.1.2免疫層析技術(shù)免疫層析技術(shù)的試紙條通常由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊等部分組成。其中，層析膜上預(yù)設(shè)有檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），檢測線包被有特異性抗原或抗體，質(zhì)控線包被有二抗。當(dāng)將待測樣品滴加到試紙條的樣品墊上時(shí)，由于毛細(xì)管作用，樣品中的液體在毛細(xì)作用下沿層析膜向前移動。在樣品移動過程中，若樣品中存在目標(biāo)物質(zhì)（抗原或抗體），其會與結(jié)合墊上預(yù)先吸附的膠體金標(biāo)記的抗體或抗原發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，形成抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物或抗體-膠體金標(biāo)記抗原復(fù)合物。隨著液體的繼續(xù)流動，該復(fù)合物遷移至檢測線（T線）處，檢測線上包被的特異性抗原或抗體能夠捕獲復(fù)合物，使得膠體金顆粒在T線處聚集。由于膠體金具有呈色特性，聚集的膠體金顆粒會使T線顯紅色或紫紅色。若樣品中不含目標(biāo)物質(zhì)，則無復(fù)合物形成，T線不顯色。無論樣品中是否含有目標(biāo)物質(zhì)，膠體金標(biāo)記抗體或抗原均會被質(zhì)控線（C線）上的二抗捕獲，從而確保C線顯色，以此驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的有效性。通過觀察檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況，即可對樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性檢測。若T線和C線均顯色，表明樣品中存在目標(biāo)物質(zhì)，檢測結(jié)果為陽性；若僅C線顯色，T線不顯色，表明樣品中不含目標(biāo)物質(zhì)，檢測結(jié)果為陰性；若C線不顯色，則表明實(shí)驗(yàn)失敗，需重新進(jìn)行檢測。這種基于免疫層析技術(shù)的檢測方法操作簡便，無需復(fù)雜設(shè)備，檢測時(shí)間通常在5-15分鐘內(nèi)即可完成。結(jié)果直觀，通過顏色變化直接判讀，無需專業(yè)分析，且具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測低至納克級的目標(biāo)物質(zhì)，減少假陽性結(jié)果，同時(shí)具備良好的便攜性，適用于現(xiàn)場快速檢測，在食品安全、醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測、生物研究等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。2.2山羊傳染性胸膜肺炎相關(guān)知識2.2.1病原體特性山羊傳染性胸膜肺炎的病原體是山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp），屬于支原體科支原體屬。支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性、能通過濾菌器、可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。Mccp呈現(xiàn)多形態(tài)性，常見的有球狀、桿狀、絲狀等，其大小不一，直徑通常在150-300nm之間。Mccp對營養(yǎng)要求苛刻，生長時(shí)需要膽固醇、核酸前體、脂肪酸、氨基酸、維生素和輔酶等多種物質(zhì)。在培養(yǎng)時(shí)，常用的培養(yǎng)基為PPLO（pleuropneumonia-likeorganisms）培養(yǎng)基，在添加10%-20%馬血清、酵母浸出液、葡萄糖、青霉素等成分后，Mccp才能較好地生長。Mccp在固體培養(yǎng)基上生長緩慢，一般需3-10天才能形成細(xì)小、半透明、微黃褐色的菌落，菌落中心突起，呈典型的“煎蛋”狀。在液體培養(yǎng)基中，Mccp生長后可使培養(yǎng)基輕微渾濁。Mccp的致病機(jī)制主要是通過其表面的黏附蛋白與山羊呼吸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)而黏附在細(xì)胞表面。黏附后，Mccp可釋放多種毒性物質(zhì)，如過氧化氫、超氧陰離子、磷脂酶、核酸酶等，這些物質(zhì)能夠損傷呼吸道上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)，Mccp還能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致肺部出現(xiàn)漿液性和纖維素性炎癥，嚴(yán)重影響山羊的呼吸功能。Mccp主要通過空氣飛沫經(jīng)呼吸道傳播，在羊群密集、通風(fēng)不良的環(huán)境中，傳播速度極快。當(dāng)健康山羊吸入含有病原體的飛沫后，病原體可在呼吸道內(nèi)定植、繁殖，從而引發(fā)感染。此外，病羊和帶菌羊是主要傳染源，它們可通過咳嗽、打噴嚏等方式將病原體排出體外，污染周圍環(huán)境，感染其他健康羊。耐過病羊肺組織內(nèi)的病原可存活較長時(shí)間，這類羊也是較為危險(xiǎn)的傳染源。2.2.2流行病學(xué)特點(diǎn)山羊傳染性胸膜肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛分布，尤其在亞洲、非洲、歐洲等山羊養(yǎng)殖密集的地區(qū)較為常見。在我國，多個(gè)省份都有山羊傳染性胸膜肺炎的報(bào)道，如河北、新疆、陜西、甘肅等地，給當(dāng)?shù)氐纳窖蝠B(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著山羊養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，山羊傳染性胸膜肺炎的流行呈現(xiàn)出一些新的趨勢。一方面，疫情的發(fā)生頻率有所增加，部分地區(qū)呈地方性流行，給養(yǎng)殖戶帶來了持續(xù)的困擾。另一方面，疫情的傳播范圍也有擴(kuò)大的趨勢，由于羊只的調(diào)運(yùn)頻繁，一旦某個(gè)地區(qū)出現(xiàn)疫情，很容易通過羊只的運(yùn)輸傳播到其他地區(qū)，增加了防控的難度。影響山羊傳染性胸膜肺炎流行的因素眾多。氣候因素方面，在晝夜溫差大、寒冷多風(fēng)的早春和冬季，以及高溫潮濕、多雨的夏季，山羊的抵抗力下降，容易感冒，這些因素往往會誘發(fā)該病。營養(yǎng)因素也不容忽視，舍飼圈養(yǎng)山羊若精料給予不足、粗飼料品種單一，或者放牧山羊草場瘠薄、長途跋涉，會導(dǎo)致羊體消瘦、營養(yǎng)缺乏、體質(zhì)減弱，從而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。飼養(yǎng)管理方式同樣關(guān)鍵，長途運(yùn)輸、環(huán)境改變、羊群密集、擁擠、衛(wèi)生條件差、通風(fēng)不良、羊舍內(nèi)空氣污濁等因素，都可能導(dǎo)致該病的發(fā)生。寄生蟲感染也是一個(gè)重要因素，當(dāng)山羊體內(nèi)、外寄生蟲（如絳蟲、吸蟲、線蟲，蜱、跳蚤、虻等）嚴(yán)重感染時(shí)，會造成體質(zhì)消瘦，抵抗力降低，有利于本病的傳播。此外，羊場管理人員防疫意識不強(qiáng)，缺乏專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)，沒有合理的免疫程序，也是導(dǎo)致年年發(fā)病的重要根源。2.2.3臨床癥狀與病理變化山羊感染山羊傳染性胸膜肺炎后，潛伏期長短不一，短者3-7天，長者可達(dá)10-30天，平均18-20天。根據(jù)病程和臨床癥狀，可分為最急性、急性和慢性三型。最急性型病程極短，一般不超過3天，有的僅12-24小時(shí)，多見于發(fā)病初期，尤其是羔羊，特別是引種或外地長途運(yùn)輸引進(jìn)的羊。病羊通常突然發(fā)病，癥狀急劇，可能見不到明顯的臨床癥狀就鳴叫幾聲后突然倒地死亡。有的病羊在晚上還正常吃食，第二天早上就發(fā)現(xiàn)死亡在圈舍。部分病羊會出現(xiàn)肺炎癥狀，咳嗽，并流漿液帶血鼻液，聽診肺泡呼吸音減弱、消失或呈捻發(fā)音。病羊臥地不起，四肢強(qiáng)直，呼吸極度困難，黏膜高度充血，發(fā)紺；目光呆滯，呻吟哀鳴，不久便會窒息而亡。急性型最為常見，病初病羊精神不振，采食量下降，體溫升高到40℃以上，經(jīng)過2-3天后癥狀逐漸明顯。病羊離群呆立，放牧?xí)r掉隊(duì)，食欲、反芻減少，呼吸加快。出現(xiàn)短促的濕性咳嗽和流漿液性鼻液，個(gè)別羊眼睛流淚，在鼻、唇及口角帶有食糜的黏性分泌物，哺乳羔羊四肢無力，癱軟，共濟(jì)失調(diào)，四肢呈游泳狀態(tài)。隨著病程發(fā)展，全身癥狀加劇，食欲廢絕，反芻停止，咳嗽氣喘，從鼻孔流出黏性、膿性鼻液，在鼻孔和上唇有干凅的帶有草料的鼻痂。病羊被毛粗亂無光，消瘦，磨牙，呻吟，流涎。后期黏膜高度充血、發(fā)紺，病羊臥地不起，呼吸困難，頭頸歪向一側(cè)，四肢不停作劃水狀，口鼻流出帶泡沫的液體，最后因窒息死亡。懷孕羊可導(dǎo)致流產(chǎn)，個(gè)別羊發(fā)生胃腸炎，出現(xiàn)瘤胃鼓氣和腹瀉，死前體溫降到常溫以下，病程一般7天左右。慢性型多由急性型轉(zhuǎn)變而來，主要表現(xiàn)在成年羊。全身癥狀輕微，病程發(fā)展緩慢，病羊消瘦，被毛粗亂，發(fā)育不良，咳嗽、流鼻、腹瀉等，病程可達(dá)數(shù)月。在此期間，如果改善飼養(yǎng)條件，病羊?qū)ΠY治療可以康復(fù)，若飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較差，很容易病情加重或繼發(fā)其他疾病而死亡。山羊傳染性胸膜肺炎的病理變化主要集中在胸膜、肺臟和支氣管。急性死亡的羊胸腔有大量紅黃色液體，多見一側(cè)肺發(fā)生明顯的浸潤和肝樣病變。病肺嚴(yán)重肺炎癥狀，瘀血呈暗紅色，切面呈特殊的大理石樣，氣管、支氣管內(nèi)有大量帶血泡沫。肩前淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、縱膈淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)出血腫大，切面呈褐色。病程超過2天的死羊胸腔積液混有纖維素，胸膜常有程度不同的發(fā)炎，發(fā)炎部分變厚，表面粗糙不平，上有黃色纖維蛋白附著，肋膜和肺膜粘連，嚴(yán)重的胸膜、肺膜、心包、橫膈膜發(fā)生粘連。剖檢的多數(shù)羊膽囊腫大，膽汁充盈、滲出污染周圍組織器官。慢性病例的病變多局限于胸部，胸腔積液較少，肺部病變部位結(jié)締組織增生，形成包囊化的壞死灶。這些臨床癥狀和病理變化為山羊傳染性胸膜肺炎的診斷提供了重要依據(jù)。三、試紙條研制材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1實(shí)驗(yàn)動物與樣本實(shí)驗(yàn)選用體重2.0-2.5kg的健康家兔10只，購自[具體動物養(yǎng)殖場名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。家兔飼養(yǎng)于[實(shí)驗(yàn)室動物房具體位置]的動物房內(nèi)，動物房溫度控制在20-24℃，相對濕度保持在40%-70%，采用12h光照、12h黑暗的光照周期。給予家兔標(biāo)準(zhǔn)兔飼料和充足的清潔飲水，自由采食和飲水，飼養(yǎng)一周后，經(jīng)健康檢查無異常后用于實(shí)驗(yàn)。陽性血清樣本采自確診為山羊傳染性胸膜肺炎的病羊，在無菌條件下，從頸靜脈采集血液5-10ml，置于無菌離心管中，3000r/min離心10min，分離血清，將血清分裝于無菌凍存管中，每管0.5ml，標(biāo)記后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。陰性血清樣本采自未感染山羊傳染性胸膜肺炎且未接種相關(guān)疫苗的健康山羊，采集方法同陽性血清樣本，同樣進(jìn)行分離、分裝和保存。實(shí)驗(yàn)共收集陽性血清樣本50份，陰性血清樣本50份。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括檸檬酸三鈉（分析純）、硫酸銨（分析純）、ProteinG抗體純化柱（[具體品牌及規(guī)格]）、氯金酸（HAuC14，分析純）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚藍(lán)、甘油、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫-20、硝酸纖維素膜（NC膜，[具體品牌及規(guī)格]）、玻璃纖維素膜、吸水紙、樣品墊等。這些試劑均購自[試劑供應(yīng)商名稱]，除特殊說明外，所有試劑均為分析純，使用前無需進(jìn)一步純化。主要儀器設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)15000r/min，溫度控制范圍-20-40℃），用于血清樣本的分離、抗體的純化以及膠體金標(biāo)記物的制備等；水平電泳儀（[品牌及型號]，電壓范圍0-500V）和垂直電泳儀（[品牌及型號]，電壓范圍0-800V），用于十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）檢測抗體純度；酶標(biāo)儀（[品牌及型號]，檢測波長范圍340-750nm），用于抗體效價(jià)的檢測；電子天平（[品牌及型號]，精度為0.0001g），用于試劑的精確稱量；恒溫培養(yǎng)箱（[品牌及型號]，溫度控制范圍20-60℃），用于細(xì)菌的培養(yǎng)；pH計(jì)（[品牌及型號]，精度為0.01），用于調(diào)節(jié)溶液的pH值；渦旋振蕩器（[品牌及型號]），用于溶液的混合；點(diǎn)膜儀（[品牌及型號]），用于將抗原和抗體點(diǎn)樣到NC膜上；切條機(jī)（[品牌及型號]），用于將組裝好的試紙條切割成合適的寬度。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1抗原的制備與純化將山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）接種于MEM—KM2培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，在4℃條件下，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，收集菌體沉淀。用PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后均以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，去除上清液。將洗滌后的菌體沉淀重懸于適量的PBS緩沖液中，采用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎，功率設(shè)置為300W，工作時(shí)間為3s，間隔時(shí)間為5s，總破碎時(shí)間為10min。破碎后的菌體懸液于4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，收集上清液，即為Mccp全菌抗原粗提液。采用硫酸銨鹽析法對Mccp全菌抗原粗提液進(jìn)行初步純化。向粗提液中緩慢加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，使其飽和度達(dá)到50%，在4℃條件下靜置過夜。次日，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，收集沉淀。將沉淀用適量的PBS緩沖液溶解，裝入透析袋中，在4℃條件下，用PBS緩沖液透析24h，期間更換透析液3-4次，去除硫酸銨等小分子雜質(zhì)。進(jìn)一步使用ProteinG抗體純化柱對初步純化后的抗原進(jìn)行純化。將透析后的抗原溶液上樣到ProteinG抗體純化柱中，流速控制在0.5ml/min。用PBS緩沖液沖洗柱子，直至流出液的吸光度（A280nm）小于0.05。然后用0.1mol/L的甘氨酸-HCl緩沖液（pH2.5）洗脫結(jié)合在柱子上的抗原，收集洗脫液。立即向洗脫液中加入1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH9.0），調(diào)節(jié)pH值至中性。采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）法檢測純化后抗原的純度。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將純化后的抗原與上樣緩沖液按1：1的比例混合，煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。取適量變性后的樣品加入到加樣孔中，同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。在恒壓120V的條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，室溫下染色2h。然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，條帶分明。通過觀察凝膠上條帶的數(shù)量和清晰度，評估抗原的純度。3.2.2膠體金的制備與標(biāo)記采用檸檬酸三鈉還原法制備25nm的膠體金顆粒。首先，將氯金酸（HAuC14）配制成0.01%的水溶液，取100ml該溶液置于250ml的圓底燒瓶中，加熱至沸騰。在劇烈攪拌下，準(zhǔn)確加入1%的檸檬酸三鈉水溶液1.5ml，繼續(xù)加熱煮沸15min，期間溶液顏色會由淡黃色逐漸變?yōu)榛疑?，最后穩(wěn)定為紅色。停止加熱，冷卻至室溫，得到25nm的膠體金溶液。使用紫外-可見分光光度計(jì)對制備的膠體金溶液進(jìn)行檢測，在510-550nm范圍內(nèi)掃描，確定其最大吸收峰波長，以驗(yàn)證膠體金顆粒的大小和質(zhì)量。同時(shí)，通過透射電子顯微鏡觀察膠體金顆粒的形態(tài)和大小分布，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。將純化后的Mccp抗原標(biāo)記到膠體金上。取1ml膠體金溶液，用0.1mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。分別加入不同量（如20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml）的純化Mccp抗原，混勻后在室溫下靜置15min。然后加入10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液，使其終濃度為1%，繼續(xù)靜置10min，以封閉未結(jié)合的位點(diǎn)。將標(biāo)記后的溶液在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，棄去上清液，沉淀用適量的含有0.05%吐溫-20和1%BSA的PBS緩沖液重懸，即為金標(biāo)抗原。通過方陣滴定法確定最佳標(biāo)記量。將不同標(biāo)記量的金標(biāo)抗原分別與已知濃度的Mccp陽性血清和陰性血清進(jìn)行反應(yīng)，觀察檢測線和質(zhì)控線的顯色情況。以顯色最清晰、背景最淺的標(biāo)記量作為最佳標(biāo)記量。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)確定最適pH值，分別在不同pH值（如6.5、7.0、7.5、8.0）條件下進(jìn)行標(biāo)記，同樣通過與陽性血清和陰性血清的反應(yīng)，確定最適pH值。3.2.3試紙條的組裝與包被將硝酸纖維素膜（NC膜）固定在點(diǎn)膜儀上，用純化的Mccp分泌多糖抗原包被檢測線（T線），最適劃線濃度為2.0mg/ml，劃線量為1μl/cm。用Mccp多克隆抗體包被質(zhì)控線（C線），最適劃線濃度為1.6mg/ml，劃線量為1μl/cm。將包被好的NC膜在37℃恒溫干燥箱中干燥2h。將玻璃纖維素膜用含有0.05%吐溫-20和1%BSA的PBS緩沖液浸泡1h，然后在37℃恒溫干燥箱中干燥3h，制成結(jié)合墊。將干燥后的結(jié)合墊裁剪成合適的寬度，均勻噴上金標(biāo)抗原，每平方厘米噴量為1μl，在37℃恒溫干燥箱中干燥1h。將樣品墊用含有0.05%吐溫-20和1%BSA的PBS緩沖液浸泡1h，然后在37℃恒溫干燥箱中干燥3h。將吸水紙和干燥后的樣品墊、結(jié)合墊、NC膜依次粘貼在PVC底板上，各部分之間重疊2mm，用切條機(jī)將組裝好的試紙條切割成寬度為3mm的小條，裝入鋁箔袋中，每袋加入1包干燥劑，密封保存。四、試紙條性能評價(jià)4.1敏感性實(shí)驗(yàn)4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取血清效價(jià)為1:1024的Mccp陽性血清，用PBS緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，分別稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024等不同稀釋度。將制備好的不同稀釋度的陽性血清樣本分別滴加在研制的試紙條的樣品墊上，每一個(gè)稀釋度重復(fù)檢測5次。同時(shí)設(shè)置陰性對照，用PBS緩沖液代替陽性血清進(jìn)行檢測。在規(guī)定的時(shí)間（10min）內(nèi)觀察試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況。4.1.2結(jié)果分析在不同稀釋度的陽性血清檢測中，當(dāng)稀釋度為1:2-1:64時(shí)，試紙條的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）均清晰顯色，表明檢測結(jié)果為陽性。隨著稀釋度的進(jìn)一步增大，當(dāng)稀釋度達(dá)到1:128時(shí)，T線的顯色強(qiáng)度開始減弱，但仍能清晰觀察到；當(dāng)稀釋度為1:256時(shí)，T線顯色變得較為微弱，但在仔細(xì)觀察下仍可辨別；而當(dāng)稀釋度達(dá)到1:512和1:1024時(shí)，T線基本不顯色，僅C線顯色，檢測結(jié)果判定為陰性。陰性對照（PBS緩沖液）檢測時(shí)，僅C線顯色，T線不顯色，符合預(yù)期結(jié)果。通過對不同稀釋度下試紙條檢測結(jié)果的分析，確定該試紙條的最低檢測限為血清效價(jià)1:1024的Mccp陽性血清稀釋256倍。這表明該試紙條具有較高的敏感性，能夠檢測出低濃度的Mccp抗體，在實(shí)際檢測中，對于感染初期抗體水平較低的樣本也有較大的檢測出可能性，為山羊傳染性胸膜肺炎的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)選取3個(gè)不同批次制備的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條，每個(gè)批次各取10條。分別用這30條試紙條對同一Mccp陽性血清樣本和同一Mccp陰性血清樣本進(jìn)行重復(fù)檢測。將陽性血清樣本和陰性血清樣本分別滴加在試紙條的樣品墊上，每一個(gè)樣本在每一條試紙上的加樣量均為10μl。在加樣后的10min內(nèi)，觀察并記錄試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況。4.2.2結(jié)果分析在對陽性血清樣本的檢測中，3個(gè)批次的試紙條檢測結(jié)果表現(xiàn)出高度的一致性。每個(gè)批次的10條試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）均清晰顯色，檢測結(jié)果均判定為陽性，陽性符合率達(dá)到100%。這表明不同批次的試紙條在檢測陽性樣本時(shí)，均能準(zhǔn)確地檢測出Mccp抗體，不存在假陰性的情況。對于陰性血清樣本的檢測，3個(gè)批次的試紙條同樣表現(xiàn)出良好的一致性。每個(gè)批次的10條試紙條均僅質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色，檢測結(jié)果均判定為陰性，陰性符合率也達(dá)到100%，說明不同批次的試紙條在檢測陰性樣本時(shí)，不會出現(xiàn)假陽性的情況。通過對不同批次試紙條檢測同一陽性和陰性血清樣本結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，可以得出該試紙條具有良好的重復(fù)性。在實(shí)際應(yīng)用中，不同批次生產(chǎn)的試紙條能夠穩(wěn)定地檢測出Mccp抗體，保證了檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，為山羊傳染性胸膜肺炎的診斷提供了穩(wěn)定的檢測工具。4.3特異性實(shí)驗(yàn)4.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)收集綿羊肺炎支原體陽性血清、絲狀支原體山羊亞種陽性血清、山羊布魯氏菌陽性血清、山羊結(jié)核桿菌陽性血清、山羊口蹄疫陽性血清各10份。同時(shí)準(zhǔn)備10份健康山羊的陰性血清作為對照。將這些血清樣本分別滴加在研制的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條的樣品墊上，每份血清重復(fù)檢測3次，加樣量均為10μl。在加樣后的10min內(nèi)，仔細(xì)觀察并記錄試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況。若T線和C線均顯色，則判定為陽性結(jié)果；若僅C線顯色，T線不顯色，則判定為陰性結(jié)果；若C線不顯色，則表明實(shí)驗(yàn)失敗，需重新進(jìn)行檢測。通過觀察不同血清樣本在試紙上的顯色反應(yīng)，判斷試紙條是否與其他相關(guān)病原體血清發(fā)生交叉反應(yīng)，以此評估試紙條對山羊傳染性胸膜肺炎抗體檢測的特異性。4.3.2結(jié)果分析在對綿羊肺炎支原體陽性血清的檢測中，10份血清樣本重復(fù)檢測的30次結(jié)果均顯示僅質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色，判定為陰性結(jié)果。這表明該試紙條與綿羊肺炎支原體陽性血清之間不存在交叉反應(yīng)，不會將綿羊肺炎支原體感染誤判為山羊傳染性胸膜肺炎感染。對于絲狀支原體山羊亞種陽性血清，同樣10份血清樣本的30次檢測結(jié)果中，只有C線顯色，T線無顯色反應(yīng)，檢測結(jié)果為陰性。說明試紙條對絲狀支原體山羊亞種具有良好的特異性，不會因該病原體的存在而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。在檢測山羊布魯氏菌陽性血清時(shí)，30次檢測中均未出現(xiàn)T線顯色的情況，僅有C線正常顯色，判定為陰性。這顯示試紙條與山羊布魯氏菌陽性血清無交叉反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確區(qū)分山羊布魯氏菌感染和山羊傳染性胸膜肺炎感染。檢測山羊結(jié)核桿菌陽性血清時(shí)，所有檢測結(jié)果均為僅C線顯色，T線不顯色，結(jié)果判定為陰性。表明該試紙條不會與山羊結(jié)核桿菌陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，在檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體時(shí)不受山羊結(jié)核桿菌的干擾。對山羊口蹄疫陽性血清的檢測，30次檢測結(jié)果同樣為僅C線顯色，T線不顯色，判定為陰性。說明試紙條與山羊口蹄疫陽性血清無交叉反應(yīng)，不會因山羊口蹄疫的存在而影響對山羊傳染性胸膜肺炎抗體的檢測。健康山羊的陰性血清作為對照，30次檢測結(jié)果均僅C線顯色，T線不顯色，符合陰性結(jié)果的預(yù)期。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該試紙條在檢測過程中，對綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、山羊布魯氏菌、山羊結(jié)核桿菌、山羊口蹄疫等相關(guān)病原體的陽性血清均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，僅對山羊傳染性胸膜肺炎陽性血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。這充分表明本研究所研制的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測出山羊傳染性胸膜肺炎抗體，有效地避免了因其他相關(guān)病原體的存在而導(dǎo)致的誤判，為山羊傳染性胸膜肺炎的診斷提供了可靠的技術(shù)支持。4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)4.4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將制備好的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條分別放置在不同的溫度和濕度條件下保存，模擬實(shí)際儲存和運(yùn)輸過程中可能遇到的環(huán)境。設(shè)置三個(gè)溫度組，分別為4℃、25℃和37℃，每個(gè)溫度組又設(shè)置兩個(gè)濕度條件，相對濕度分別為30%-40%和70%-80%。每個(gè)條件下放置20條試紙條。在保存過程中，定期（分別在第1周、第2周、第4周、第8周、第12周、第16周、第20周、第24周）取出試紙條進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，使用已知效價(jià)（血清效價(jià)為1:1024）的Mccp陽性血清和陰性血清各5份。將陽性血清和陰性血清分別滴加在試紙條的樣品墊上，加樣量為10μl。在加樣后的10min內(nèi)，觀察并記錄試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況。同時(shí)，與新鮮制備的試紙條檢測結(jié)果進(jìn)行對比，評估試紙條在不同保存條件下的穩(wěn)定性。4.4.2結(jié)果分析在4℃、相對濕度30%-40%的條件下保存24周后，試紙條檢測陽性血清時(shí)，檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）顯色清晰，與新鮮制備的試紙條檢測結(jié)果一致，陽性符合率為100%；檢測陰性血清時(shí)，僅C線顯色，T線不顯色，陰性符合率也為100%。這表明在該條件下，試紙條的性能穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地檢測出Mccp抗體，沒有出現(xiàn)因保存時(shí)間延長而導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果。在4℃、相對濕度70%-80%的條件下保存至第16周時(shí)，試紙條檢測陽性血清和陰性血清的結(jié)果仍與新鮮試紙條一致。但在第20周檢測時(shí)，有1條試紙條檢測陽性血清時(shí)T線顯色較淺，出現(xiàn)1例假弱陽性結(jié)果；第24周檢測時(shí)，有2條試紙條出現(xiàn)類似情況，陽性符合率下降至90%，陰性符合率仍為100%。說明較高的濕度對試紙條的穩(wěn)定性有一定影響，在長期保存過程中可能會導(dǎo)致檢測靈敏度下降。在25℃、相對濕度30%-40%的條件下，保存至第12周時(shí)，試紙條檢測結(jié)果與新鮮試紙條一致。第16周檢測時(shí)，出現(xiàn)1例假陰性結(jié)果，陽性符合率為98%，陰性符合率為98%；第20周時(shí)，又出現(xiàn)1例假陰性和1例假陽性結(jié)果，陽性符合率為96%，陰性符合率為96%；第24周時(shí)，陽性符合率為94%，陰性符合率為94%。表明在該溫度和相對較低濕度條件下，隨著保存時(shí)間的延長，試紙條的穩(wěn)定性逐漸下降，出現(xiàn)錯(cuò)誤檢測結(jié)果的概率增加。在25℃、相對濕度70%-80%的條件下，保存至第8周時(shí)，檢測結(jié)果正常。第12周檢測時(shí)，出現(xiàn)2例假陰性和1例假陽性結(jié)果，陽性符合率為94%，陰性符合率為94%；第16周時(shí)，假陰性和假陽性結(jié)果分別增加到3例和2例，陽性符合率為90%，陰性符合率為90%；第20周時(shí)，陽性符合率為86%，陰性符合率為86%；第24周時(shí)，陽性符合率為82%，陰性符合率為82%。這顯示在較高溫度和濕度條件下，試紙條的穩(wěn)定性受到嚴(yán)重影響，保存時(shí)間較短，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性下降明顯。在37℃、相對濕度30%-40%的條件下，保存至第4周時(shí)，檢測結(jié)果基本正常。第8周檢測時(shí)，出現(xiàn)3例假陰性和2例假陽性結(jié)果，陽性符合率為88%，陰性符合率為88%；第12周時(shí)，陽性符合率為82%，陰性符合率為82%；第16周時(shí)，陽性符合率為76%，陰性符合率為76%；第20周時(shí)，陽性符合率為70%，陰性符合率為70%；第24周時(shí)，陽性符合率為64%，陰性符合率為64%。說明在高溫和相對較低濕度條件下，試紙條的穩(wěn)定性較差，保存時(shí)間短，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性快速下降。在37℃、相對濕度70%-80%的條件下，保存至第2周時(shí)，檢測結(jié)果尚可。第4周檢測時(shí)，出現(xiàn)5例假陰性和4例假陽性結(jié)果，陽性符合率為80%，陰性符合率為80%；第8周時(shí)，陽性符合率為68%，陰性符合率為68%；第12周時(shí)，陽性符合率為56%，陰性符合率為56%；第16周時(shí)，陽性符合率為44%，陰性符合率為44%；第20周時(shí)，陽性符合率為32%，陰性符合率為32%；第24周時(shí)，陽性符合率為20%，陰性符合率為20%。表明在高溫高濕條件下，試紙條的穩(wěn)定性極差，保存時(shí)間極短，檢測結(jié)果幾乎不可靠。綜合以上結(jié)果，溫度和濕度對試紙條的穩(wěn)定性均有顯著影響，高溫高濕條件對試紙條穩(wěn)定性的破壞最為嚴(yán)重。該試紙條在4℃、相對濕度30%-40%的條件下保存時(shí)，穩(wěn)定性最佳，有效期可達(dá)24周以上。在實(shí)際應(yīng)用中，為保證試紙條的檢測性能，建議將其保存在4℃左右、相對濕度較低的環(huán)境中，并在有效期內(nèi)使用。五、實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)證5.1臨床樣本檢測5.1.1樣本采集與處理為了全面評估研制的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條在實(shí)際應(yīng)用中的性能，本研究在[具體地區(qū)]的多個(gè)山羊養(yǎng)殖場進(jìn)行了臨床樣本采集。選擇具有不同養(yǎng)殖規(guī)模、飼養(yǎng)管理水平和疫病流行情況的養(yǎng)殖場，以確保樣本的多樣性和代表性。在采集樣本前，與養(yǎng)殖場負(fù)責(zé)人進(jìn)行充分溝通，了解羊群的基本信息，包括羊只數(shù)量、品種、年齡、免疫情況以及近期的健康狀況等。采集人員嚴(yán)格遵守生物安全操作規(guī)程，穿戴防護(hù)服、口罩、手套等防護(hù)用品，防止交叉感染。采用頸靜脈采血的方式采集山羊血液樣本。具體操作如下：由助手站立保定好羊只，使其保持安靜。采血部位用手術(shù)剪剪毛，先用碘酒棉球消毒，再用酒精棉球脫碘。采血者用一只手按壓靜脈下端，使靜脈血液充盈膨脹，另一只手持一次性采血注射器，先抽拉針筒活塞，針管預(yù)留1-2mL空氣，以45°角進(jìn)針斜插入靜脈，有血液流出后，緩慢抽拉針筒活塞，盡量避免產(chǎn)生氣泡，抽取5mL的血液。采集好的血液抽拉針筒活塞，使血液離頂端有2-3mL的空氣，蓋好原針頭保護(hù)套。采血后注射器需傾斜放置，夏天常溫下靜置30-40分鐘，冬天需放在溫水中靜置30-40分鐘，等待血清析出。血清析出后，將針頭脫出，一手斜拿離心管，一手將注射器針頭端沿離心管管壁緩慢推注血清3mL。蓋好離心管蓋子，用記號筆在離心管瓶蓋上做好編號，注明羊只的相關(guān)信息，如養(yǎng)殖場名稱、羊只編號、采血日期等。將裝有血清的離心管用保鮮袋裝好，保鮮袋內(nèi)隨血清瓶存放有小紙條，書寫編號對應(yīng)的羊只欄舍耳號，放置在-20℃冰箱冷凍層保存。在檢測前，將冷凍的血清樣本取出，置于4℃冰箱中緩慢解凍，避免反復(fù)凍融，以免影響檢測結(jié)果。解凍后的血清樣本需充分混勻后再進(jìn)行檢測。本次研究共采集了來自不同養(yǎng)殖場的山羊血清樣本300份，為后續(xù)的檢測分析提供了充足的數(shù)據(jù)支持。5.1.2檢測結(jié)果與分析運(yùn)用研制的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條對采集的300份臨床山羊血清樣本進(jìn)行檢測。將適量的血清樣本滴加在試紙條的樣品墊上，按照試紙條的使用說明，在規(guī)定的時(shí)間（10min）內(nèi)觀察檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顯色情況。若T線和C線均顯色，則判定為陽性結(jié)果，表明樣本中含有山羊傳染性胸膜肺炎抗體，羊只可能感染了山羊傳染性胸膜肺炎；若僅C線顯色，T線不顯色，則判定為陰性結(jié)果，說明樣本中未檢測到山羊傳染性胸膜肺炎抗體，羊只未感染或處于感染初期抗體水平較低尚未能檢測出來；若C線不顯色，則表明實(shí)驗(yàn)失敗，需重新進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，300份樣本中，檢測出陽性樣本68份，陽性率為22.7%。對不同養(yǎng)殖場的樣本陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同養(yǎng)殖場之間陽性率存在一定差異。其中，養(yǎng)殖場A的陽性率為30.0%（30/100），該養(yǎng)殖場養(yǎng)殖規(guī)模較大，羊只數(shù)量較多，飼養(yǎng)密度相對較高，且近期有羊只出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱等呼吸道癥狀；養(yǎng)殖場B的陽性率為15.0%（15/100），該養(yǎng)殖場注重飼養(yǎng)管理，定期對羊舍進(jìn)行消毒，羊只免疫程序較為規(guī)范；養(yǎng)殖場C的陽性率為28.6%（23/80），該養(yǎng)殖場位于山區(qū)，環(huán)境較為潮濕，通風(fēng)條件相對較差。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試紙條檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，將試紙條檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)進(jìn)行對比分析。選取部分試紙條檢測結(jié)果為陽性和陰性的樣本，分別采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)檢測。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，參與反應(yīng)的成分包括抗原、抗體、補(bǔ)體、溶血素等，通過觀察溶血現(xiàn)象來判定結(jié)果。競爭ELISA試驗(yàn)使用商業(yè)化的試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中抗體的含量。對比結(jié)果表明，在與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的對比中，試紙條檢測結(jié)果與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的符合率為85.3%（58/68）。其中，試紙條檢測為陽性且補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)也為陽性的樣本有58份，試紙條檢測為陽性但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為陰性的樣本有10份；試紙條檢測為陰性且補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)也為陰性的樣本有200份，試紙條檢測為陰性但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為陽性的樣本有22份。在與競爭ELISA試驗(yàn)的對比中，試紙條檢測結(jié)果與競爭ELISA試驗(yàn)結(jié)果的符合率為88.2%（60/68）。試紙條檢測為陽性且競爭ELISA試驗(yàn)也為陽性的樣本有60份，試紙條檢測為陽性但競爭ELISA試驗(yàn)為陰性的樣本有8份；試紙條檢測為陰性且競爭ELISA試驗(yàn)也為陰性的樣本有205份，試紙條檢測為陰性但競爭ELISA試驗(yàn)為陽性的樣本有17份。通過對臨床樣本檢測結(jié)果的分析以及與傳統(tǒng)檢測方法的對比，可以看出本研究所研制的山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性。雖然與傳統(tǒng)檢測方法存在一定的差異，但總體符合率較高。部分檢測結(jié)果不一致的原因可能是由于不同檢測方法的原理和敏感性不同，以及樣本本身的復(fù)雜性等因素導(dǎo)致。例如，傳統(tǒng)檢測方法對樣本的處理和操作要求較為嚴(yán)格，而試紙條檢測相對簡便快捷，在實(shí)際檢測過程中可能會受到一些外界因素的影響。此外，樣本中可能存在一些干擾物質(zhì)，影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，試紙條檢測具有操作簡單、快速、無需專業(yè)儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，能夠在基層養(yǎng)殖場或現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，及時(shí)為養(yǎng)殖戶提供初步的檢測結(jié)果，為山羊傳染性胸膜肺炎的防控提供了有力的技術(shù)支持。在實(shí)際應(yīng)用中，可以結(jié)合試紙條檢測和傳統(tǒng)檢測方法，對山羊傳染性胸膜肺炎進(jìn)行更加準(zhǔn)確的診斷和監(jiān)測。5.2與其他檢測方法的比較5.2.1對比方法選擇為了全面評估本研究研制的免疫層析法檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條的性能，選擇了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)這兩種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法與之進(jìn)行對比。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)作為一種經(jīng)典的血清學(xué)檢測方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其原理是利用抗原抗體復(fù)合物與補(bǔ)體結(jié)合，通過觀察溶血現(xiàn)象來判斷結(jié)果。競爭ELISA試驗(yàn)則是基于抗原抗體的競爭結(jié)合原理，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值來確定樣本中抗體的含量。這兩種方法在山羊傳染性胸膜肺炎的檢測中應(yīng)用較為廣泛，具有一定的代表性，能夠?yàn)樵u估試紙條的性能提供有力的參考。5.2.2結(jié)果對比與評價(jià)選取100份臨床山羊血清樣本，分別用本研究研制的試紙條、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，試紙條檢測出陽性樣本25份，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測出陽性樣本28份，競爭ELISA試驗(yàn)檢測出陽性樣本26份。在陰性樣本的檢測中，試紙條判定為陰性的樣本有75份，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)判定為陰性的樣本有72份，競爭ELISA試驗(yàn)判定為陰性的樣本有74份。通過對三種檢測方法結(jié)果的對比分析，發(fā)現(xiàn)試紙條與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的符合率為88.0%（88/100），與競爭ELISA試驗(yàn)的符合率為91.0%（91/100）。這表明本試紙條在檢測結(jié)果上與傳統(tǒng)檢測方法具有較高的一致性，但仍存在一定的差異。在準(zhǔn)確性方面，雖然試紙條的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法有較高符合率，但在一些樣本的檢測中，仍出現(xiàn)了不同的判定結(jié)果。例如，在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中檢測為陽性而試紙條檢測為陰性的3份樣本，可能是由于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的靈敏度較高，能夠檢測到較低濃度的抗體，而試紙條在這些樣本中的檢測靈敏度相對較低。在競爭ELISA試驗(yàn)中檢測為陽性而試紙條檢測為陰性的1份樣本，可能是由于競爭ELISA試驗(yàn)的檢測原理和試紙條不同，對樣本中抗體的識別存在差異。在便捷性方面，本試紙條具有明顯的優(yōu)勢。試紙條操作簡單，無需專業(yè)的儀器設(shè)備，僅需將樣本滴加在試紙條上，10min內(nèi)即可通過肉眼觀察結(jié)果。而補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作步驟繁瑣，需要對抗原、抗體、補(bǔ)體、溶血素等多種成分進(jìn)行仔細(xì)滴定，且補(bǔ)體性質(zhì)不穩(wěn)定，易受多種因素影響，對操作人員的技術(shù)要求較高。競爭ELISA試驗(yàn)雖然準(zhǔn)確性較高，但需要使用酶標(biāo)儀等專業(yè)儀器設(shè)備，檢測過程較為復(fù)雜，檢測時(shí)間較長，通常需要2-3小時(shí)。在成本方面，試紙條的生產(chǎn)成本相對較低，試紙條組成結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)中使用的設(shè)備及耗材成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)需要使用多種試劑和儀器設(shè)備，試劑成本較高，且對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和設(shè)備要求較為嚴(yán)格，增加了檢測成本。綜上所述，本研究研制的免疫層析法檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條在準(zhǔn)確性上與傳統(tǒng)檢測方法具有較高的一致性，雖然存在一定差異，但在可接受范圍內(nèi)。在便捷性和成本方面，試紙條具有明顯的優(yōu)勢，能夠滿足基層養(yǎng)殖場和現(xiàn)場快速檢測的需求。然而，為了進(jìn)一步提高試紙條的檢測性能，還需要對其進(jìn)行不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，以減少與傳統(tǒng)檢測方法的差異，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。六、討論與展望6.1研究結(jié)果討論6.1.1試紙條性能優(yōu)勢本研究成功研制出的免疫層析法檢測山羊傳染性胸膜肺炎抗體試紙條，在性能方面展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢。在敏感性實(shí)驗(yàn)中，該試紙條能夠檢測出血清效價(jià)為1:1024的Mccp陽性血清稀釋256倍后的樣本，這一結(jié)果表明其具有較高的靈敏度。相比傳統(tǒng)檢測方法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和競爭ELISA試驗(yàn)，本試紙條在檢測低濃度抗體時(shí)表現(xiàn)出色，能夠更及時(shí)地發(fā)現(xiàn)感染初期抗體水平較低的羊只，為疫病的早期診斷提供了有力支持。在實(shí)際養(yǎng)殖場景中，早期診斷對于及時(shí)采取防控措施、防止疫情擴(kuò)散至關(guān)重要，本試紙條的高靈敏度特性大大提升了早期診斷的可能性。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同批次的試紙條對同一陽性和陰性血清樣本的檢測結(jié)果高度一致，陽性符合率和陰性符合率均達(dá)到100%。這充分證明了該試紙條具有良好的重復(fù)性，不同批次生產(chǎn)的試紙條能夠穩(wěn)定地檢測出Mccp抗體，保證了檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。在大規(guī)模檢測應(yīng)用中，重復(fù)性好的試紙條能夠提供穩(wěn)定的檢測結(jié)果，減少因批次差異導(dǎo)致的檢測誤差，為疫病監(jiān)測和防控提供了穩(wěn)定的技術(shù)保障。特異性實(shí)驗(yàn)表明，試紙條對綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、山羊布魯氏菌、山羊結(jié)核桿菌、山羊口蹄疫等相關(guān)病原體的陽性血清均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，僅對山羊傳染性胸膜肺炎陽性血清呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。這體現(xiàn)了試紙條具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測出山羊傳染性胸膜肺炎抗體，有效地避免了因其他相關(guān)病原體的存在而導(dǎo)致的誤判。在復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境中，羊只可能同時(shí)感染多種病原體，本試紙條的高特異性能夠準(zhǔn)確區(qū)分山羊傳染性胸膜肺炎感染，為精準(zhǔn)診斷和防控提供了可靠依據(jù)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在4℃、相對濕度30%-40%的條件下，試紙條保存24周后仍能保持良好的性能，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。這說明該試紙條在適宜的保存條件下具有較好的穩(wěn)定性，有效期長。在實(shí)際應(yīng)用中，較長的有效期可以減少試紙條的浪費(fèi)，降低檢測成本，同時(shí)也便于試紙條的儲存和運(yùn)輸，有利于在基層養(yǎng)殖場推廣應(yīng)用。6.1.2存在的問題與不足盡