水產微生態(tài)制劑解淀粉芽胞桿菌生產技術規(guī)程2019-02-15實施2019-02-15實施天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標準依據GB/T1.1—2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》的要求起草。本標準由天津市農業(yè)科學院提出并歸口。本標準起草單位：天津市農業(yè)生物技術研究中心。本標準主要起草人：謝鳳行、張峰峰、周可、趙瓊、趙玉潔、孫海波、高寶山。1本標準規(guī)定了解淀粉芽胞桿菌生產中所涉及的生產環(huán)境和設備、生產技術流程、質量檢測和儲運。2規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質量標準GB3838地表水環(huán)境質量標準GB20287農用微生物菌劑GB/T26428飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測3術語和定義屬于芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，桿狀，有鞭毛，革蘭氏陽性菌，芽胞橢圓形，中生或近中生。3.2原菌種在培養(yǎng)皿上活化，挑取單菌落接種至三角瓶中，振三角瓶中的菌種接種至種子罐中，在種子罐中放4.1生產環(huán)境4.1.1廠區(qū)空氣質量符合大氣環(huán)境質量標準GB3095中Ⅱ類要求。4.1.2發(fā)酵用水符合地表水環(huán)境質量標準GB3838中Ⅲ類水質要求，冷卻水及其他用水符合該標準中4.1.3生產車間配備消毒滅菌設施，菌種儲藏室和無菌操作間與生產車間分開。24.2生產設備5生產技術流程5.1生產流程5.2菌種質量5.2.1用于發(fā)酵的菌種應有菌種鑒定報告或菌株來源相關信息。5.2.2在發(fā)酵前應先檢測菌種的純度和性能，如不純或退化，應先進行提純復5.2.3菌種在上罐生產之前需檢測種子罐中菌體的純度和濃度，不能有雜菌污染，濃度達到每毫升億5.3培養(yǎng)基5.3.1原菌種和一級菌種的培養(yǎng)基應保證菌種生長的延滯期短，生長旺盛，碳、氮源營養(yǎng)豐富。5.3.2二級菌種培養(yǎng)基原則上為發(fā)酵培養(yǎng)基或接近發(fā)酵培養(yǎng)基。5.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基在保證菌體生長旺盛，利于芽胞形成的前提下，盡量利用來源充足、價格低廉的原5.4滅菌5.4.1液體發(fā)酵，發(fā)酵罐的裝液量50%～70%,液體培養(yǎng)基、發(fā)酵設備、管道、補料罐等采用高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa,滅菌20min～30min。5.4.2固體物料含水率50%～60%,121℃~130℃,滅菌1.0h～2.0h。5.4.3滅菌后無菌操作取滅菌后的培養(yǎng)基，制片，染色，鏡檢，無微生物說明滅菌徹底，若有，需重復5.3的工作。5.5接種搖瓶種子到發(fā)酵罐種子接種量為1%～5%,種子罐到發(fā)酵罐接種量為5%～7%。接種保證無菌操作，調5.6.1芽胞桿菌的發(fā)酵溫度為25℃~37℃。5.6.2液體發(fā)酵在發(fā)酵過程中通入無菌空氣，通氣量為10m3/ht～20m3/het,攪拌轉數80r/min~5.6.3芽胞率達到80%以上終止發(fā)酵。5.6.5發(fā)酵過程加入天然油脂類或有機硅類消泡劑，可采用蠕動泵添加，也可在配置培養(yǎng)基時加入。5.7發(fā)酵后處理36質量檢測6.1檢測指標廠。6.2感官檢測6.2.1取液體菌劑約250mL(固體菌劑約250g)于無色玻璃杯中，采用目測、鼻嗅的方法進行檢驗。6.2.2液體菌劑為淡黃色或棕黃色，存放過程中可能出現沉淀，具清淡的腥味；固體菌劑棕色或淺棕6.3.1樣品稀釋有效活菌測定直接用2～3個梯度稀釋液(10?、102、10)在含淀粉的培養(yǎng)基(參見附錄B)上涂平6.3.3培養(yǎng)將涂好的平板在室溫中放置15min,使接種物完全被瓊脂吸收，倒置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。選取菌落數在30～300個之間的平板計數，典型的解淀粉芽胞桿菌菌落表面粗糙，不透明，邊緣不規(guī)則，呈淺米黃色，消耗培養(yǎng)基中的淀粉在菌落周圍產生透明圈。芽胞數除以菌數即為芽胞率。6.4雜菌率的測定(好氧或兼性厭氧雜菌)從用來測定有效活菌數且已經過10倍系列稀釋的樣品中，選取10?、10?、10~3個稀釋度進行雜菌7儲運7.1應貯存在通風、干燥、清潔的倉庫，倉庫內無有害氣體、易燃易爆物品及有腐蝕性的化學物遠離熱源。7.2長途運輸時，防止日曬、雨淋，避免長期受壓和機械損傷。產品不應和易燃、易爆、易腐蝕的物品同車(或其他運輸工具)裝運。4(規(guī)范性附錄)純度和性能檢查滅菌一級菌種接種發(fā)酵無菌空氣發(fā)酵物檢測不合格合格按規(guī)定處理發(fā)酵后處理質量檢測不合格合格按規(guī)定處理出廠圖A.1解淀粉芽胞桿菌生產技術流程圖5(資料