微生物學(xué)

第六章微生物的營養(yǎng)和

分離培養(yǎng)技術(shù)

本章內(nèi)容

Contents

1微生物的營養(yǎng)物質(zhì)

2微生物的營養(yǎng)類型

3微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

4培養(yǎng)基

5微生物的分離純化技術(shù)

6微生物的培養(yǎng)方法

第一節(jié)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)

(—)碳源(carbonsource)

凡是可以作為微生物細胞或代謝產(chǎn)物中碳素來源的營養(yǎng)物

稱作碳源。

'有機碳凡必須利用有機碳源的微生物，就是為

.數(shù)眾多的異養(yǎng)微生物。

、無機碳凡以無機碳源作為主要碳源的微生物，則

是種類較少的自養(yǎng)微生物。

碳源功能

(1)構(gòu)成細胞物質(zhì)

⑵構(gòu)成各種代謝產(chǎn)物和細胞貯藏物質(zhì)

⑶為微生物進行生命活動提供能量

第6頁

13

〃糖類及其衍生物

有機酸類

微生物利用/醇類糖類為最常見的

的碳源物質(zhì)，脂類碳源和能源物質(zhì)

燒類

（蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物等

第7頁

14

司種類碳源物質(zhì)備注

糖葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、半乳糖、單糖優(yōu)于雙糖和多糖；己糖優(yōu)于戊糖；葡萄糖、果

乳糖、甘露糖、纖維二糖、纖維素、半纖維素、糖優(yōu)于甘露糖和半乳糖；淀粉明顯優(yōu)于纖維素和兒

甲光素、木質(zhì)素等丁質(zhì)：純多糖明顯優(yōu)丁瓊脂和木質(zhì)素等雜多糖

有機酸糖酸、乳酸、檸檬酸、延胡索酸、低級脂肪酸、效果不如糖類；有機酸較難進入細胞，旦會導(dǎo)致川

高級脂肪酸、氨基酸等降低；環(huán)境中缺乏碳源物質(zhì)時，氨基酸可作碳源

醇乙醇低濃度條件下，可被某些酵母和醋酸菌利用

脂脂肪、磷脂主要利用脂肪，特定條件下可將磷脂分解為I」?油和

脂肪酸而被利用

天然氣、石油、石油儲分、石蠟油等可利用炫的微生物細胞表面有一種由糖脂組成的特

殊吸收系統(tǒng)，可將難溶的燃充分乳化后吸收利用

CO2C02自養(yǎng)型微生物可利用

碳酸鹽NaHC03、CaC03、白堊等自養(yǎng)型微生物可利用

:其它

芳香族化合物、筑化物、蛋白質(zhì)、肽、核酸等環(huán)境中缺乏碳源時，可作為碳源被降解利用：此類

微生物常應(yīng)用于環(huán)境保護方面

15

(二)氮源(nitrogensource)

凡是構(gòu)成微生物細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)

均稱為氮源。

氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，氮

占細菌干重的12%?15%,也是微生物的主要營養(yǎng)物。

\_______________________7

氮源功能

電源物質(zhì)一般不提供能量！

⑴構(gòu)成細胞物質(zhì)例外：硝化如菌，能利用配3瓶化獲得

能量，NK既是氮源又是能源。

y

⑵構(gòu)成代謝產(chǎn)物

⑶少數(shù)細菌可以鐵鹽、硝酸鹽等氮源為能源

種類氮源物質(zhì)備注

-■■1

蛋白質(zhì)類蛋白質(zhì)及其不同程度降解大分子蛋白質(zhì)難以進入細胞，多數(shù)細菌只能利用相對分子質(zhì)

衣物（陳、肽、氨基酸等）量較小的降解產(chǎn)物，一些真菌和少數(shù)細菌能分泌胞外蛋白酶，

將大分子蛋白質(zhì)降解利用

氨及錢鹽NH3s(NHJ2SO4等易被微生物吸收利用

硝酸鹽KN03等易被微生物吸收利用

分子氮固氮微生物可利用，當(dāng)環(huán)境中存在化合態(tài)氮源時，固氮微生

物失去固氮能力

其它嗓吟、嗑咤、麻、胺、?？刹煌潭缺晃⑸镒鳛榈蠢?；大腸桿菌不能以喀噬為

胺、氟化物唯一氮源，當(dāng)其在氮限量的葡萄糖培養(yǎng)基上生長時，可通過

誘導(dǎo)作用先合成分解畸咤的酶，然后分解并利用啼咤

微生物能利用的氮源類型也明顯比動物或植物的廣。

第11頁

(三)能源(energysource)

能為微生物生命活動提供能量來源的物質(zhì)或輻射能，稱為能源。

/輻射能光能營養(yǎng)型微生物的能源

微生物利,

用的能源,

化能異養(yǎng)型微生物的能源物質(zhì)同碳源

I化學(xué)物質(zhì)

化能自養(yǎng)型微生物的能源是還原態(tài)無機物,

U!)無機鹽(mineralsalts)

無機鹽(mineralsalts)或礦質(zhì)元素主要可為微生物提供除碳、氮

源以外的各種重要元素。

?大量元素10-4?10-3mol/L

?微量元素10-8?10-6mol/L

第14頁

元素人為提供形式生理功能

KHzP04磷酸二氫鉀

核酸、磷酸和輔酹的成分

P△HP。,磷酸氫二鉀

含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸等）和含硫

MgS04硫酸鎂

S維生素（生物素、硫胺素等）的成分

大KH2P04磷酸二氫鉀某些酶（果糖激酶、磷酸內(nèi)第酸轉(zhuǎn)磷酸酶等）

量KK2HPO4磷酸氫二鉀的輔因子；維持電位差和滲透壓

元

素

NaNaCl氯化鈉維持滲透壓；某些細菌和藍細菌所需

Ca（N03）2硝酸鈣某些胞外酶的穩(wěn)定劑、蛋白酶等的輔因子；細

CaCaCh氯化鈣菌形成芽泡和某些真菌形成抱子所需

MgMgSCU硫酸鎂固氮酶等的輔因子；葉綠素等的成分

細胞色素的成分；合成葉綠素、白喉毒素和氧

FeS04硫酸亞鐵

Fe高鐵血紅素所需

第15頁

元素人為提供形式生理功能

超氧化物歧化酶、氨肽酶和L-阿拉伯

MnMnSOa硫酸鎰

糖異構(gòu)酶等的輔因子

CuCuSO,硫酸銅氧化酶、酪氨酸酶的輔因子

微

量維生素M復(fù)合物的成分；肽酶的輔因

CoCoS?！蛩徙@

元子

素

堿性磷酸酶以及多種脫氫酶、肽酶和

ZnZnSOo硫酸鋅

脫竣酶的輔因子

固氮酶和同化型及異化型硝酸鹽還原

Mo（NH4〉MO7（）2拜酸鍍

酶的成分

第16頁

30

(五)生長因子(growthfactor)

微生物生長所必需且需求量很少，但微生物自身無法合成或合

成量無法滿足其機體生長需求的有機化合物。

生長因子的種類:

⑴維生素

(2)氨基酸

(3)堿基

⑷其他生長因子

第18頁

32」

（六）水

微生物細胞中水占70%?90%,

水是地球上整個生命系統(tǒng)存在和發(fā)展的

必要條件！

第19頁

水在生物體內(nèi)的作用

(1)水是細胞的重要組成成分。

⑵水直接參與代謝反應(yīng)，許多反應(yīng)都涉及脫水和水合。

(3)水是活細胞中各種生化反應(yīng)的介質(zhì)。

⑷營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物都必須溶于水中才能被運輸。

(5)水比熱容高、汽化熱高、沸點高，又是熱的良導(dǎo)體，可調(diào)節(jié)細胞的溫度。

(6)水是維持細胞膨壓的必要條件。

.第20頁

第二節(jié)微生物的營養(yǎng)類型

微生物的四大營養(yǎng)類型

1.光能無機營養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）

2.光能有機營養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）

3.化能無機營養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）

4.化能有機營養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）

1.光能無機營養(yǎng)型(光能自養(yǎng)型)

?代表微生物:藍細菌(Cyanobacteria)

|第22頁

￥

2.光能有機營養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）

?代表微生物：紫非硫細菌（Purplenon-sulfurbacteria)

3.化能無機營養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）

?代表微生物：硫細菌、鐵細菌

硫細菌

40

4.化能有機營養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）

?代表微生物：

腐生菌，包括全部真菌，大多數(shù)細菌（如

放線菌）、寄生菌，包括動植物的病原菌

及其內(nèi)外共生菌……

洋蔥伯克氏菌

(Burkholderia

cepacian)

第25頁

劃分依據(jù)營養(yǎng)類型特點

能源光能營養(yǎng)型以光為能源

化能營養(yǎng)型以有機物氧化釋放的化學(xué)能為能源

氫供體無機營養(yǎng)型以還原性無機物為氫供體

有機營養(yǎng)型以有機物為氫供體

碳源自養(yǎng)型以C02為唯一或主要碳源

異養(yǎng)型以有機物為碳源

營養(yǎng)類型能源氫供體碳源舉例

光能無機自養(yǎng)光能無機物藍細菌、紫硫細菌、藻類

C02

型

光能有機異養(yǎng)光能有機物CO2和簡單有機紅螺菌屬細菌［紫色無硫

型物細菌）

化能無機自養(yǎng)

無機物氧無機物C02硝化名田菌、硫化細菌、鐵

型化細菌、氫細菌

化能有機異養(yǎng)有機物氧有機物有機物大多數(shù)細菌和所有真核微

型化生物

第27頁

43J

不同營養(yǎng)類型之間的界限并非絕對!

?異養(yǎng)型微生物并非絕對不能利用CO?；

?自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機物進行生長;

?有些微生物在不同生長條件下生長時，其營養(yǎng)類型也

會發(fā)生改變。微生物譽某類型的可變性無

最有利于提高其對環(huán)優(yōu)條件

變化的適應(yīng)能力！

V第三節(jié)微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

細胞膜運送詈養(yǎng)物質(zhì)的4種方式

?單純步散

?促進步散

?主動桔運

?基團轉(zhuǎn)佳

1.單純擴散

定義

單純擴散(simplediffusion)又稱簡單擴散、被動運送，指疏水性雙分

子層細胞膜(包括孔蛋白在內(nèi))在無載體蛋白的參與下，單純依靠物理擴

散方式讓許多小分子、非電離分子，尤其是親水性分子被動通過的一種物

質(zhì)運送方式，不消耗能量。

第30頁

48

特點

膜史①擴散是非特異性的，不需載體蛋白協(xié)助;

?

②不消耗能量，動力來自參與擴散的物

?質(zhì)在膜內(nèi)外的濃度差，從高到低；

③擴散過程中.物質(zhì)不與膜上各類分子發(fā)

生反應(yīng)，自身分子結(jié)構(gòu)也不發(fā)生變化。

49」

2.促進擴散

定義

促進擴散(facilitateddiffusion)指借助細胞膜上特異性載體的協(xié)

助而進行物質(zhì)運輸?shù)囊活悢U散性運輸方式，不消耗能量。

第32頁

52

特點

①需要細胞膜上的底物特異教體蛋白的協(xié)助;

②載體蛋白對被運送的物質(zhì)具有高度專一性;

③不消耗能■,動力來自參與擴散的物質(zhì)

在膜內(nèi)外的濃度差，從高向低。

■■第33頁

53

M

3.主動運輸

定義

主動運輸(activetransport)指通過細胞膜上特異性載體蛋白構(gòu)象的變化,

使膜外低濃度的物質(zhì)進入膜內(nèi)的一種運送方式，此過程需要消耗能量(包括

ATP、質(zhì)子動勢等)o

5理

特點

①需要細胞膜上的底物特異載體蛋白的協(xié)助;

②消耗能量，逆濃度梯度運送物質(zhì)；

③溶質(zhì)在運送前后不發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的變化。

|第35頁j

59J

溶質(zhì)結(jié)合蛋白

周質(zhì)空間

轉(zhuǎn)運蛋白

胞質(zhì)基質(zhì)

核節(jié)結(jié)合域

ATPADP

ATPADP

4,基團轉(zhuǎn)位

定義

基團轉(zhuǎn)位(grouptranslocation)指既需特異性載體蛋白的參與，

又需耗能的一種物質(zhì)運送方式，其特點是溶質(zhì)在運送前后還會發(fā)生分子

結(jié)構(gòu)的變化。

①需要細胞膜上的底物特異載體蛋白的協(xié)助;

②消耗能量，逆濃度梯度運送物質(zhì)；

③溶質(zhì)在運送前后發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的變化。

基團移位的運送機制

在E.coli中研究得較為清楚，主要靠碑峻轉(zhuǎn)移醇系統(tǒng)，即埔

酸烯醇式丙酮斑己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進行。

磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotrasferasesystem)

此系統(tǒng)由24種蛋白組成，運送某一具體糖，至少有4種蛋白參

與，其特點是每輸入一個葡萄糖分子，就要消耗一個ATP的能量。

具體運送分兩步進行：

(1)熱穩(wěn)載體蛋白的激活

細胞內(nèi)高能化合物一一磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)

的磷酸基團通過酶I的作用激活HPr:

酶I

PEP+HPrPyr（丙酮酸）+P~HPr

HPr(heat-stablecaiTierprotein,HPr)是一種低相對分子質(zhì)量

的可溶性蛋白，結(jié)合在細胞膜上，起著高能磷酸載體的作用。

酶I是一種可溶性細胞質(zhì)蛋白。

HPr和酶I在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中，均無底物特異性。

第42頁

68

(2)糖經(jīng)磷酸化而運入細胞膜內(nèi)

膜外環(huán)境中的糖先與細胞膜外表面上的底物特異膜蛋白——酶

11c結(jié)合，接著糖分子被由!HiPr-酶Ila-酶11b逐級傳遞來的磷

酸基團激活，最后通過酶11c再把這一磷酸糖釋放到細胞質(zhì)中。

PEP

EHPr

丙酮酸

葡萄糖

大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)機制6-磷酸-葡萄糖。

細胞質(zhì)膜

第44頁

73

比較項目單純擴散促進擴散主動運輸基團轉(zhuǎn)位

特異性載體蛋白1無有有有

運輸速度慢快快快

溶質(zhì)運輸方向由低到高由低到高由高到低由高到低

運輸分子特異性無特異性有特異性有特異性有特異性

能量消耗不需要不需要需要而要

,

運輸前后溶質(zhì)分子不變不變不變改變

載體飽和效應(yīng)無有有有

與溶質(zhì)類似物競爭無有有有

性無有有有

氨基酸、乳糖等

運輸抑制劑H20>H2>CO2、S024>P043、糖葡萄糖、果糖、

運輸對象舉例。2、甘汨、乙醇、（真核生物）糖類、Na+、Ca2+甘露糖、喋吟、

少數(shù)氨基酸、鹽等無機離子核昔、脂肪酸

類第45頁1

第四節(jié)培養(yǎng)基

培恭基(medium,復(fù)數(shù)media或culturemedium)

培養(yǎng)基是指由人工配制的、適合不同微生物生長繁殖或產(chǎn)生代

謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。

根據(jù)微生物營養(yǎng)類型選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)

選用和設(shè)計培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)

基的原則和方法

調(diào)整培養(yǎng)基中各類營養(yǎng)物質(zhì)的濃度與配比

C調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H、氧化還原電位和滲透壓等理化因素

設(shè)計一種培養(yǎng)基的步驟:

生態(tài)模擬

試驗的規(guī)模一般都遵循

由定性到定量、

參閱文獻

由小而大

逐步擴大的原則。

精心設(shè)計

試驗比較

第48頁

99

培養(yǎng)基的類型

根據(jù)培養(yǎng)微生根據(jù)物理狀態(tài)

根據(jù)成分劃分根據(jù)用途劃分

物類型劃分劃分

?細菌培養(yǎng)基?天然培養(yǎng)基?固體培養(yǎng)基?基礎(chǔ)培養(yǎng)基

?加富培養(yǎng)基

?放線菌培養(yǎng)?合成培養(yǎng)基?半固體培養(yǎng)

?選擇培養(yǎng)基

基?半合成培養(yǎng)基

?鑒別培養(yǎng)基

?酵母菌培養(yǎng)基?液體培養(yǎng)基

基

?霉菌培養(yǎng)基

第49頁

J

(1)根據(jù)培養(yǎng)微生物類型劃分

r細菌培養(yǎng)基牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基

放線菌培養(yǎng)基高氏一號合成培養(yǎng)基

<

酵母菌培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基/馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

I霉菌培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基/馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

第50頁

101

⑵根據(jù)培養(yǎng)基的成分劃分

天然培養(yǎng)基(undefinedmedium)

\合成培養(yǎng)基(syntheticmedium)

I半合成培養(yǎng)基(semi-syntheticmedium)

第51頁

102

⑶根據(jù)培養(yǎng)基物理狀態(tài)劃分

液體培養(yǎng)基(liquidmedium)

半臼體培養(yǎng)基(semi-solidmedium)

I固體培養(yǎng)基(solidmedium)

第52頁

106J

J

(4)根據(jù)培養(yǎng)基用途劃分

r基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimummedium)

力口富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)

選額培養(yǎng)基(selectivemedium)

、鑒別培養(yǎng)基(differentialmedium)

第五節(jié)微生物的分離純化技術(shù)

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物

的方法，稱為微生物的分離純化技術(shù)。

采用適宜的增殖培養(yǎng)方式及分離純化方法，對于挑選出性能良好、

符合生產(chǎn)需求的純種微生物是非常關(guān)鍵的一步。

第54頁

為了容易分離到目標(biāo)微生物，我們需采用選擇培養(yǎng)或富集培養(yǎng)的方

式增加目標(biāo)微生物占比，以增加成功分離的幾率。

選擇培養(yǎng)富集培養(yǎng)

?根據(jù)待分離微生物?從微生物混合群開

的營養(yǎng)、生理、生始，制定特定的環(huán)

長條件等特點，采境條件，使特定微

用特定的選擇培養(yǎng)生物的數(shù)量比例不

條件，獲取目標(biāo)微斷增高而引向純培

生物的培養(yǎng)方法養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法

第55頁j

125

固體培養(yǎng)基分離純化

?稀釋平板分離法

傾注法

涂布法原理

?平板劃線分離法使混合的細菌呈單個分散生長，

形成單個菌落，以獲得純菌

。連續(xù)劃線法\________________7

分區(qū)劃線法

?生化反應(yīng)分離法

稀釋平板分離法

10-51()-61()-7

10g土樣90ml無菌水9ml無菌水樣品梯度稀釋

第57頁

127

稀釋平板分離法

1051缶610-7

2傾注法1mL稀釋液+適量5O'C左右瓊脂培養(yǎng)基

混勻，培養(yǎng)

涂布法倒平板?冷卻凝固+0.1mL稀釋液

分離出的單菌落接種于培養(yǎng)基斜面涂布均勻，培養(yǎng)

第58頁

平板劃線分離法

r

原理

將微生物樣品在培養(yǎng)基表面進行多次“由點

到線”稀釋而達到分離的目的。

\_________________)

混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞在平板培養(yǎng)基表面通

過劃線稀釋而得到獨立分布的單個細胞，培養(yǎng)后可形成單菌落。

平板連續(xù)劃線分離法

適用于含菌量較少的樣品

第60頁

平板分區(qū)劃線分離法

操作要點

■每個分區(qū)劃線前都要灼燒接種環(huán)

■下一個分區(qū)的菌種來源于上一個

劃線分區(qū)的末端

分區(qū)劃線法

適用于含菌量較多的樣品

第61頁

第六節(jié)微生物的培養(yǎng)方法

一定條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱為培養(yǎng)物。實驗室條件下，從混

合的培養(yǎng)物中分離得到由一個細胞或同種細胞群繁殖得到的后代，稱為純培養(yǎng)

(pureculture),純培養(yǎng)是利用和研究微生物的第一步。

第62頁

投料方式不同氧需求不同在實驗室和工業(yè)生產(chǎn)中，微生

■物采取何種培養(yǎng)方法主要取決于微

生物特性、原料特點、產(chǎn)物特點、

□分批培養(yǎng)_好氧培養(yǎng)

設(shè)備狀況、技術(shù)可行性、成本核算

□連續(xù)培養(yǎng)□厭氧培養(yǎng)

等。

實際中，各種培養(yǎng)方式常結(jié)合

進行以達到最佳效果。

第63頁1

分批培養(yǎng)

微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，除無菌空氣通入和廢氣排出外，培養(yǎng)過程

中與外界無物料交換，最后一次性收獲培養(yǎng)物，稱為分批培養(yǎng)(batchculture)o

優(yōu)點缺點

①發(fā)酹過程中只需控制溫度、pH和進行通每次發(fā)醉結(jié)束后都要對發(fā)醉罐進行滅菌，

氣，操作簡單，不易引起污染。重新加注新培養(yǎng)基、接種等操作，非生產(chǎn)

時間較長、設(shè)備利用率較低

②每次發(fā)酵均要重新接種，發(fā)酵時間短，

不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題

連續(xù)培養(yǎng)

培養(yǎng)屜連續(xù)加入

連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)是相對

于分批培養(yǎng)而言的，培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)容器

中連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)液，不斷補充營養(yǎng)物質(zhì),

并去除代謝產(chǎn)物，進而優(yōu)化生長代謝環(huán)境的

開放型培養(yǎng)方式

第65頁

項目恒化法