ICS07.080

CCSC04

DB51

四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB51/T3216—2024

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量規(guī)范

2024-12-03發(fā)布2024-12-29實(shí)施

四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB51/T3216—2024

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4縮略語.............................................................................1

5質(zhì)量規(guī)范...........................................................................2

6檢測(cè)方法...........................................................................4

7檢驗(yàn)規(guī)則...........................................................................6

8廢棄物處理.........................................................................6

參考文獻(xiàn)..............................................................................7

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由四川省經(jīng)濟(jì)和信息化廳提出、歸口、解釋并組織實(shí)施。

本文件起草單位：成都世聯(lián)康健生物科技有限公司、四川省干細(xì)胞技術(shù)與細(xì)胞治療協(xié)會(huì)、四川大學(xué)

華西口腔醫(yī)院、電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院、四川省細(xì)胞庫有限公司、四川省天府細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)中心有

限公司、中山大學(xué)光華口腔醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院、西北工業(yè)大學(xué)、空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔

醫(yī)院、西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院、四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、中國(guó)測(cè)試技術(shù)研

究院、成都康景生物科技有限公司、南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、四川省藥

品檢驗(yàn)研究院、中南大學(xué)湘雅口腔醫(yī)院、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)

學(xué)院附屬口腔醫(yī)院。

本文件主要起草人：田衛(wèi)東、陳國(guó)慶、廖立、湯穎峰、張靜怡、代施施、楊超、施松濤、金巖、范

志明、江宏兵、肖金剛、李杰、李中瀚、郭淑娟、周李華、寇大蓮、胡成虎、毛學(xué)理、陳甜、霍芳軍、

隋秉東、劉志、李蓓、徐永勝、胡磊、李炎、杜新雅、李昆、李銳、黃艷麗、幸倚帆、洪鵬宇、任家銀、

馬晶、郭維華、楊波、李茂嬌、謝利、于湄、張思遠(yuǎn)、何敏、陳金龍。

II

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人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞的原輔料要求、細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性、細(xì)胞制備過程控制、細(xì)胞

質(zhì)量檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和廢棄物處理要求。

本文件適用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞的制備、檢測(cè)和質(zhì)量控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T40365-2021細(xì)胞無菌檢測(cè)通則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞humandental-derivedmesenchymalstemcells

從人不同發(fā)育階段牙齒組織或其附屬組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，包括牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、

牙囊干細(xì)胞、脫落乳牙干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞等，貼壁生長(zhǎng)后呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，可自我更新，

并具有成骨分化、成脂分化及成神經(jīng)分化能力的干細(xì)胞。

3.2

原材料rawandprocessedmaterial

可用于分離人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞的原材料，包括牙髓組織、牙囊組織、牙周膜組織、乳牙牙髓組

織、根尖組織等。

3.3

輔助材料accessorymaterial

用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等過程中的采集器械、容器、清

洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子等。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

EBV：人類皰疹病毒（Epstein-BarrVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCMV：人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HTLV：人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）

1

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STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）

TP：梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）

SOP：標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（StandardOperatingProcedure）

5質(zhì)量規(guī)范

5.1原材料和輔助材料質(zhì)量規(guī)范

5.1.1原材料要求

5.1.1.1用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料來源應(yīng)符合倫理規(guī)范和法律法規(guī)。

5.1.1.2用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料供者應(yīng)簽署書面的合法有效的知情同意書；如原材

料供者屬未成年人，知情同意書應(yīng)由供者及其法定監(jiān)護(hù)人共同簽署；知情同意書應(yīng)包括但不限于：人牙

來源間充質(zhì)干細(xì)胞在合適的條件下潛在的研究及治療應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用、剩余材料的處置

以及其他相關(guān)問題所適用的內(nèi)容；應(yīng)有明確的供者（如供者系未成年人，應(yīng)包括其法定監(jiān)護(hù)人）的個(gè)人

隱私保護(hù)機(jī)制。

5.1.1.3用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料具有相關(guān)臨床資料，包括但不限于供者一般信息、

既往病史及家族史等。既往病史和家族史應(yīng)對(duì)遺傳性疾病相關(guān)信息進(jìn)行詳細(xì)采集。

5.1.2輔助材料要求

5.1.2.1用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離的采集器械、容器、清洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子等

輔料應(yīng)符合相關(guān)的質(zhì)量要求，應(yīng)包括但不限于供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證、產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告和批次檢驗(yàn)報(bào)告、

質(zhì)量抽檢報(bào)告等。

5.1.2.2用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，應(yīng)采用無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基。

5.1.2.3用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中如含有人源血液成分，應(yīng)明確其來源、批號(hào)及質(zhì)

量檢定合格報(bào)告，原則上采用國(guó)家批準(zhǔn)的相關(guān)產(chǎn)品，如使用未經(jīng)批準(zhǔn)的人源血液相關(guān)制劑，則應(yīng)提供相

應(yīng)的檢驗(yàn)檢測(cè)合格報(bào)告。

5.1.2.4用于人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，在樣本來源于無菌條件的前提下，原則上不添加

抗生素。如樣本來源無法嚴(yán)格滿足無菌條件，可在原代擴(kuò)增階段使用的培養(yǎng)基中添加抗生素，并在質(zhì)量

檢測(cè)中增加相應(yīng)的抗生素殘留檢測(cè)。在成品制劑中檢測(cè)抗生素殘留，檢測(cè)方法可選用藥典收錄的培養(yǎng)法

或酶聯(lián)免疫法，殘留量應(yīng)低于試劑盒檢出限。

5.1.3供者要求

供者應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP，并記錄保存結(jié)果。

5.2人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)

5.2.1細(xì)胞形態(tài)

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)以梭形或紡錘形為主，細(xì)胞形

態(tài)隨細(xì)胞密度可略有改變。

5.2.2細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD105、CD73、CD90，陽性率≥90%；表達(dá)CD146，陽性率≥30%；低表

達(dá)CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR，陽性率≤2%。

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5.2.3細(xì)胞存活率

未經(jīng)凍存的細(xì)胞存活率≥90%，凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞存活率≥80%。

5.2.4免疫調(diào)節(jié)功能

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者TNF-α）誘導(dǎo)后可表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）；

與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，能抑制T淋巴細(xì)胞增殖及IFN-γ、TNF-α分泌。

5.2.5多向分化能力

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有成骨、成脂、成神經(jīng)分化能力。

5.2.6成瘤性

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性。

5.2.7染色體核型

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)量為46XX或46XY，染色體結(jié)構(gòu)無缺失、重復(fù)、斷裂、倒位、異位。

5.2.8短串聯(lián)重復(fù)序列

單一供者來源的細(xì)胞各代次及批次細(xì)胞短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè)結(jié)果應(yīng)保持一致。

5.2.9異常淋巴細(xì)胞增殖

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞與人總淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，不會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞因子的異常釋放。

5.2.10微生物

真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應(yīng)為陰性。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測(cè)

值應(yīng)≤0.5EU/mL。

5.3質(zhì)量控制

5.3.1原材料采集

原材料采集應(yīng)制定完整的采集操作規(guī)范。原材料相關(guān)的牙體組織、牙胚組織應(yīng)由具有口腔執(zhí)業(yè)醫(yī)師

資格并接受相關(guān)培訓(xùn)合格的醫(yī)師，在具有口腔醫(yī)療資質(zhì)的機(jī)構(gòu)采集完成；供牙應(yīng)無牙體、牙髓及牙周病

變，并制定相應(yīng)原材料的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)。樣品采集后，應(yīng)置于無菌采集容器中密閉保存，并賦予唯一

識(shí)別碼。保存溫度為2℃～10℃。

5.3.2原材料運(yùn)輸

原材料運(yùn)輸應(yīng)制定完整的操作規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；樣本運(yùn)輸全程

應(yīng)有詳細(xì)的記錄，內(nèi)容包括但不限于運(yùn)輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時(shí)間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記

錄入檔保留至少20年；運(yùn)輸溫度為2℃～10℃，運(yùn)輸時(shí)間不得超過12小時(shí)。

5.3.3原材料接收

原材料接收應(yīng)制定完整的接收操作規(guī)范，原材料樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；應(yīng)制定原

材料接收信息記錄表及明確的原材料樣品接收標(biāo)準(zhǔn)，遵從安全與準(zhǔn)確的原則對(duì)樣本接收制定規(guī)范及應(yīng)急

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預(yù)案，并填寫相關(guān)記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年；原材料樣本接收后應(yīng)及時(shí)處理，對(duì)不能及時(shí)處理

的樣本，應(yīng)保存在2℃～10℃條件下，最長(zhǎng)時(shí)間不得超過12小時(shí)。

5.3.4細(xì)胞分離與培養(yǎng)

5.3.4.1細(xì)胞分離與培養(yǎng)應(yīng)制定完整的操作規(guī)范；細(xì)胞分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)避免不同供體之間的交叉

污染；同一供體牙體或牙胚組織分離多種細(xì)胞的，應(yīng)有完整的操作規(guī)范，避免同一供體不同類型細(xì)胞之

間的混淆或交叉污染。

5.3.4.2細(xì)胞分離后擴(kuò)增培養(yǎng)過程中應(yīng)明確細(xì)胞的名稱、培養(yǎng)代次、操作時(shí)間、培養(yǎng)條件等詳細(xì)的操

作記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年。

5.3.4.3細(xì)胞凍存應(yīng)制定完整的操作規(guī)范，凍存的細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞名稱、培養(yǎng)代次、細(xì)胞量、凍存體

積、操作時(shí)間等信息；凍存細(xì)胞應(yīng)具有唯一識(shí)別碼，且可與供體、采集、分離、擴(kuò)增培養(yǎng)等信息相對(duì)應(yīng)；

細(xì)胞凍存液應(yīng)采用國(guó)家已批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料，凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器氣相凍存；細(xì)

胞凍存庫由專人負(fù)責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定，并定期巡檢并記錄。

5.3.4.4細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)制定完整的操作規(guī)范，復(fù)蘇的細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞名稱、代次、批次、培養(yǎng)條件、操

作人員、復(fù)蘇時(shí)間等信息。

5.3.5細(xì)胞運(yùn)輸

5.3.5.1細(xì)胞運(yùn)輸應(yīng)制定完整的操作規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；根據(jù)干細(xì)

胞的使用要求，選擇合適的承載細(xì)胞的容器、運(yùn)輸方式、運(yùn)輸條件、運(yùn)輸設(shè)備和運(yùn)輸路線，保證細(xì)胞的

穩(wěn)定性和生物活性。

5.3.5.2運(yùn)輸條件的控制應(yīng)包括但不限于溫度控制、運(yùn)輸時(shí)間、無污染、運(yùn)輸設(shè)備性能和外包裝等。

5.3.5.3細(xì)胞的運(yùn)輸應(yīng)全程記錄，包括但不限于細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時(shí)間、人員、地址及

干細(xì)胞信息等，記錄入檔保存至少20年。

5.3.5.4凍存細(xì)胞應(yīng)采用-150℃至-196℃的低溫條件下運(yùn)輸，復(fù)蘇的細(xì)胞或新鮮細(xì)胞制劑應(yīng)在2℃～

10℃條件下運(yùn)輸。

6檢測(cè)方法

6.1細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

采用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)。

6.2細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白。

6.3細(xì)胞活率檢測(cè)

采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法或活/死細(xì)胞染色(CalceinAM,PI法)進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)定。

6.4免疫調(diào)節(jié)功能檢測(cè)

6.4.1免疫調(diào)節(jié)因子檢測(cè)

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者TNF-α）誘導(dǎo)后，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培

養(yǎng)基中吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）的水平；

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6.4.2T淋巴細(xì)胞抑制作用檢測(cè)

人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)對(duì)于T淋巴細(xì)胞增殖的作用，采用酶

聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)基中IFN-γ、TNF-α分泌水平。

6.5多向分化能力檢測(cè)

6.5.1成骨分化

體外利用成骨分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)條件培養(yǎng)14至28天后，采用茜素紅S染色法鑒定細(xì)胞成骨分化能力。

6.5.2成脂分化

體外利用成脂分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)條件培養(yǎng)14至28天后，采用油紅O染色法鑒定細(xì)胞成脂分化能力。

6.5.3成神經(jīng)分化

體外利用成神經(jīng)分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)條件培養(yǎng)5至10天后，采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)志蛋

白的表達(dá)，鑒定細(xì)胞成神經(jīng)分化能力。

6.6成瘤性檢測(cè)

采用免疫缺陷動(dòng)物（裸鼠或SCID鼠），通過局部皮下接種人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)價(jià)人牙來源間

充質(zhì)干細(xì)胞成瘤性。體內(nèi)成瘤試驗(yàn)嚴(yán)格遵照動(dòng)物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種人牙來源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)

量≥106個(gè)細(xì)胞，觀察期≥12周。

6.7染色體核型檢測(cè)

染色體核型采用G帶分析法進(jìn)行測(cè)定。

6.8短串聯(lián)重復(fù)序列檢測(cè)

采用基于PCR的STR指紋圖譜檢測(cè)法進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列檢測(cè)。

6.9淋巴細(xì)胞異常增殖檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于活化的人總淋巴細(xì)胞的增殖和對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群

增殖能力的影響；采用ELISA技術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（TNF-α）分泌的影響。

6.10微生物檢測(cè)

6.10.1細(xì)菌及真菌檢測(cè)

對(duì)樣本采集、運(yùn)輸、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基、

培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測(cè)。對(duì)于具有足夠樣本量和觀察時(shí)間的樣本，參照《中華人民共

和國(guó)藥典》無菌檢測(cè)法（通則1101）執(zhí)行，對(duì)于效期短、批量小，采用現(xiàn)行無菌檢查法（通則1101）

無法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查的細(xì)胞類制品，可采用快速微生物檢查法，推薦方法為呼吸信號(hào)法。

6.10.2支原體檢測(cè)

參照《中華人民共和國(guó)藥典》支原體檢測(cè)法執(zhí)行，對(duì)樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等

生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測(cè)。

6.10.3病毒檢測(cè)

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采用核酸檢測(cè)法，對(duì)樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保

存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）中HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV進(jìn)行檢測(cè)。

6.10.4螺旋體檢測(cè)

采用核酸檢測(cè)法，對(duì)樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保

存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）對(duì)TP進(jìn)行檢測(cè)。

6.10.5內(nèi)毒素檢測(cè)

參照中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程