基于四面體DNA納米結構的阿爾茨海默病多靶點檢測技術的突破與創(chuàng)新一、引言1.1研究背景阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD），作為一種神經(jīng)退行性疾病，常發(fā)于老年人中，其臨床表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴重影響社交、職業(yè)與生活功能，并最終導致死亡。據(jù)統(tǒng)計，在65歲以上人群中，阿爾茨海默病的患病率約為5%，而在85歲以上人群中，這一比例則上升至20%。隨著全球人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病的患者數(shù)量也在迅速增長。目前，世界上患有阿爾茨海默病的人數(shù)約有3600萬，預計到2030年將達到6570萬，2050年更是會攀升至1.15億。我國作為全球人口第一大國，已進入不可逆轉的老齡化社會，截至2008年底，60歲以上老年人口數(shù)量超過1.68億，目前患有阿爾茨海默病的患者接近1000萬人，占亞太地區(qū)的40%，占世界約1/4，已然成為全球阿爾茨海默病第一大國。阿爾茨海默病的發(fā)病機制極為復雜，目前尚未完全明確，其中影響較廣的是β類淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)假說。該假說認為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié)，可引發(fā)一系列病理過程，這些病理過程又進一步促進Aβ沉積，從而形成級聯(lián)式放大反應，最終產(chǎn)生細胞毒性，其毒性包括引發(fā)線粒體途徑的凋亡。除了Aβ的聚集，阿爾茨海默病的成因還同腦內(nèi)膽堿水平的降低、氧化應激、鈣離子水平失調(diào)、金屬離子水平的異常增高以及中樞神經(jīng)炎癥等多種因素相關。當前臨床上用于治療阿爾茨海默病的藥物主要分為兩類：一類是以提高腦內(nèi)膽堿水平為目的的乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑，如多奈哌齊（Donepezil）、他克林（Tacrine）、利伐司替明（Rivastigmine）以及加蘭他敏（Galanthamine）；另一類是以拮抗NMDA受體為目的的受體拮抗劑，如美金剛（Memantine）。然而，這些藥物雖能在一定程度上緩解阿爾茨海默病的癥狀，卻無法從根本上阻止病情的進一步發(fā)展，難以達到有效的治療效果。隨著對阿爾茨海默病病理機制研究的不斷深入，人們逐漸認識到其發(fā)生和發(fā)展并非由單一因素引起，而是涉及極其復雜的生理和病理機制，針對單一靶點的藥物往往只能調(diào)控疾病的某一個途徑，無法從根本上抑制AD的病理進程。因此，開發(fā)能夠同時作用于多個靶點的治療方法和檢測技術，對于更有效地治療和早期診斷阿爾茨海默病具有至關重要的意義。在阿爾茨海默病的檢測方面，傳統(tǒng)的檢測方法存在諸多局限性。傳統(tǒng)臨床評估方法通常要在疾病進展到癡呆階段的中晚期才能作出診斷，使得患者錯失早期干預的最佳時機；核磁共振成像和正電子發(fā)射斷層掃描等神經(jīng)影像學檢測技術，雖能顯示腦內(nèi)結構、功能和病理變化，但存在成本高、操作復雜且需要專業(yè)設備等問題，難以廣泛應用于大規(guī)模篩查；腦脊液檢測雖然診斷結果相對精確，然而其具有侵入性，患者接受度較低。近年來，隨著分子生物學和檢測技術的快速發(fā)展，血液檢測方法因其具有侵入性小、成本較低、易于操作等特點，在阿爾茨海默病的預測和診斷方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，為該疾病的早期檢測和長期監(jiān)測提供了新的可能性，成為研究的熱點方向。四面體DNA納米結構（TDN）作為一種新型的DNA納米材料，在生物醫(yī)學領域展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。TDN由四條DNA單鏈通過嚴格堿基互補配對原則形成具有三維結構的納米材料，具有良好的生物相容性、生物安全性和生物可降解性，且制備方法簡單，產(chǎn)率較高，具有較好核酸酶耐受性。這些獨特的性質(zhì)使得TDN在生物活性分子傳遞、藥物輸送、生物傳感等方面具有獨特價值。將四面體DNA納米結構應用于阿爾茨海默病的多靶點檢測，有望克服傳統(tǒng)檢測方法的局限，實現(xiàn)對阿爾茨海默病相關多個靶點的同時檢測，提高檢測的靈敏度和準確性，為阿爾茨海默病的早期診斷和病情監(jiān)測提供更有效的手段，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在利用四面體DNA納米結構（TDN）的獨特優(yōu)勢，構建一種高效、靈敏的多靶點檢測體系，實現(xiàn)對阿爾茨海默病相關多個生物標志物的同時檢測。具體而言，通過合理設計TDN的結構和功能，使其能夠特異性地識別和結合阿爾茨海默病的關鍵生物標志物，如β類淀粉樣蛋白（Aβ）、磷酸化tau蛋白（p-tau）等，并借助先進的信號放大技術和檢測手段，實現(xiàn)對這些標志物的高靈敏檢測。本研究具有重要的理論意義和實際應用價值。在理論層面，深入研究TDN與阿爾茨海默病生物標志物之間的相互作用機制，有助于進一步揭示阿爾茨海默病的發(fā)病機理，為該領域的基礎研究提供新的思路和方法。同時，探索基于TDN的多靶點檢測策略，也將豐富和拓展DNA納米技術在生物醫(yī)學檢測領域的理論體系，推動相關學科的交叉融合與發(fā)展。從實際應用角度來看，本研究成果有望為阿爾茨海默病的早期診斷和病情監(jiān)測提供強有力的技術支持。早期準確診斷對于阿爾茨海默病的治療和干預至關重要，然而傳統(tǒng)檢測方法存在諸多局限性，難以滿足臨床需求。本研究構建的基于TDN的多靶點檢測體系，具有高靈敏度、高特異性和操作簡便等優(yōu)點，能夠實現(xiàn)對阿爾茨海默病的早期精準檢測，有助于患者在疾病早期得到及時治療，延緩病情進展，提高生活質(zhì)量。此外，該檢測體系還可用于大規(guī)模人群的篩查和疾病監(jiān)測，為公共衛(wèi)生領域提供有效的技術手段，對于降低社會醫(yī)療負擔、應對人口老齡化帶來的健康挑戰(zhàn)具有重要意義。二、阿爾茨海默病及多靶點檢測概述2.1阿爾茨海默病簡介2.1.1疾病定義與特征阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種發(fā)生于老年和老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是老年期癡呆最常見的類型。該疾病通常隱匿起病，病情呈持續(xù)進行性發(fā)展，給患者、家庭和社會帶來沉重負擔。其典型癥狀包括漸進性記憶障礙，這是阿爾茨海默病最為突出的早期表現(xiàn)之一?；颊咄鶎诎l(fā)生的事情難以記住，例如剛剛說過的話、做過的事很快就忘記，隨著病情發(fā)展，遠期記憶也會受到影響，如對過去熟悉的人、事、經(jīng)歷逐漸遺忘。認知功能障礙也是重要特征，涵蓋多個方面，患者的注意力難以集中，思考能力變遲緩，解決問題的能力明顯下降，無法完成以往能夠輕松應對的復雜任務，像處理財務問題、安排日?；顒拥?。語言障礙同樣常見，表現(xiàn)為詞匯量減少，表達時找不到合適的詞語，說話變得重復、啰嗦，嚴重時甚至無法進行正常的語言交流。此外，患者還可能出現(xiàn)人格改變，原本溫和的性格可能變得暴躁、多疑、焦慮，對周圍的人和事缺乏興趣，社會交往能力逐漸喪失。這些癥狀嚴重影響患者的社交、職業(yè)與生活功能，隨著病情惡化，患者逐漸失去生活自理能力，最終導致死亡。2.1.2發(fā)病機制阿爾茨海默病的發(fā)病機制極為復雜，目前尚未完全明確，眾多學者提出了多種假說，其中β-淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)假說和Tau蛋白異常磷酸化假說影響較為廣泛。β-淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)假說認為，Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的核心環(huán)節(jié)。Aβ是淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶水解形成的，主要有Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43三種類型，其中Aβ42/43為β片層結構，疏水性強，容易沉積，具有神經(jīng)毒性。在正常情況下，90％為Aβ40，只有少量Aβ42/43。然而，由于遺傳等因素，如APP基因、早老素1基因、早老素2基因突變等，AD患者腦內(nèi)Aβ42/Aβ40比例失衡，Aβ42/43增多。增多的Aβ42/43在腦內(nèi)沉積形成老年斑的核心，進而引發(fā)一系列病理過程。它可以激活小膠質(zhì)細胞，引發(fā)炎性反應；損害線粒體，導致能量代謝障礙，氧自由基生成過多，產(chǎn)生氧化應激損害；激活細胞凋亡途徑，介導細胞凋亡；還能通過激活蛋白激酶，促進tau蛋白異常磷酸化。而這些病理改變又會進一步促進Aβ生成增多和異常沉積，形成級聯(lián)式放大反應，最終導致神經(jīng)元減少，遞質(zhì)異常，引發(fā)臨床認知和行為癥狀。盡管Aβ沉積在AD發(fā)病機制中占據(jù)重要地位，但它是否為AD發(fā)病的起始環(huán)節(jié)目前仍存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊出現(xiàn)早于神經(jīng)原纖維纏結和神經(jīng)元丟失，但也有研究表明AD病理改變最早出現(xiàn)在內(nèi)嗅區(qū)，且在沒有Aβ沉積的情況下，此處就出現(xiàn)了神經(jīng)原纖維纏結。Tau蛋白異常磷酸化假說指出，Tau蛋白是一種微管相關蛋白，在維持細胞骨架穩(wěn)定性方面發(fā)揮關鍵作用。它通過與微管結合，確保微管的正常結構和功能，進而保障神經(jīng)元軸漿運輸?shù)恼＿M行。在AD患者腦內(nèi)，Tau蛋白發(fā)生異常過度磷酸化，過度磷酸化的Tau蛋白無法正常與微管結合，反而聚集形成雙股螺旋細絲，成為神經(jīng)原纖維纏結的主要成分，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。另一方面，正常的Tau蛋白減少，使得微管潰變，軸漿運輸中止或紊亂，最終導致軸突變性，神經(jīng)元死亡。不過，目前尚不能確定Tau蛋白磷酸化是AD病理改變的始發(fā)環(huán)節(jié)，還是繼發(fā)于Aβ異常。除了上述兩種主要假說，還有其他因素和假說與AD的發(fā)病機制相關。遺傳假說表明，依據(jù)發(fā)病年齡，AD可分為早發(fā)性AD（<65歲）和晚發(fā)性AD（≥65歲）；按有無家族遺傳史可分為家族性AD和散發(fā)性AD。家族性AD多為早發(fā)性，約占AD總數(shù)的10％，呈常染色體顯性遺傳，已發(fā)現(xiàn)APP基因、早老素1基因、早老素2基因突變可導致家族性AD。載脂蛋白E（ApoE）ε4基因型是晚發(fā)家族性AD和散發(fā)AD的易患基因，ApoE蛋白參與血漿脂蛋白代謝，ApoE4可以抑制星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元對Aβ的清除，遺傳因素主要通過影響Aβ的生成或清除來促進AD發(fā)病。神經(jīng)遞質(zhì)假說認為，AD患者腦內(nèi)存在多種神經(jīng)遞質(zhì)異常，其中膽堿能系統(tǒng)障礙最為嚴重，且與患者的認知和行為障礙關系密切。腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元主要位于基底前腦的Meynert核和內(nèi)側隔核，投射到海馬和大腦皮質(zhì)。AD患者基底前腦的膽堿能神經(jīng)細胞明顯缺失，膽堿乙酰轉移酶減少，乙酰膽堿的合成和釋放顯著降低，其降低程度與認知測驗相關，目前用于治療AD的部分藥物就是針對乙酰膽堿系統(tǒng)來改善患者癥狀。此外，氧化應激、免疫炎性機制、微循環(huán)障礙等假說也被提出，但它們在AD病理生理過程中的作用尚不明了，多與Aβ異常沉積有關，可能同屬淀粉樣蛋白級聯(lián)假說的范疇。2.1.3疾病現(xiàn)狀與危害隨著全球人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病的患者數(shù)量呈現(xiàn)出迅猛的增長趨勢。據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會（ADI）發(fā)布的報告顯示，2018年全球約有5000萬人患有癡呆，其中阿爾茨海默病為最常見癥狀，占據(jù)全球癡呆癥病例的60%-70%。預計到2050年，全球癡呆患者人數(shù)將增至1.52億，這意味著每3秒鐘就將有1例癡呆患者產(chǎn)生，阿爾茨海默病患者數(shù)量也將隨之大幅上升。我國作為人口大國，老齡化問題日益突出，阿爾茨海默病的患病情況也不容樂觀。截至目前，我國患有阿爾茨海默病的患者接近1000萬人，占亞太地區(qū)的40%，占世界約1/4，已然成為全球阿爾茨海默病第一大國。阿爾茨海默病給患者的生活帶來了毀滅性的影響?；颊叩恼J知和記憶能力不斷衰退，逐漸失去獨立生活的能力，日常生活需要他人的全面照料，如穿衣、洗漱、進食等基本活動都難以自行完成。他們可能會忘記自己的親人、朋友，無法進行正常的社交互動，導致社交圈子日益狹窄，心理上產(chǎn)生孤獨、焦慮和抑郁等負面情緒?；颊哌€可能出現(xiàn)行為異常，如迷路、攻擊他人、隨地大小便等，進一步影響其生活質(zhì)量和尊嚴。從社會層面來看，阿爾茨海默病給社會醫(yī)療體系帶來了沉重的負擔?；颊咝枰L期的醫(yī)療護理和照顧，這不僅消耗了大量的醫(yī)療資源，包括醫(yī)院的床位、醫(yī)護人員的精力等，還增加了家庭的經(jīng)濟支出。據(jù)估計，2018年全球社會癡呆相關成本為1萬億美元，到2030年，這一數(shù)字預計將增至2萬億美元。隨著患者數(shù)量的不斷增加，相關的醫(yī)療費用、護理費用以及社會福利支出等還將持續(xù)攀升，給社會經(jīng)濟發(fā)展帶來巨大的壓力。同時，由于患者需要家人或專業(yè)護理人員的照顧，這也導致了大量勞動力的占用，影響了家庭的正常生活和社會的生產(chǎn)力。因此，阿爾茨海默病已成為全球公共衛(wèi)生領域面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一，迫切需要開發(fā)有效的檢測和治療方法來應對這一疾病。2.2阿爾茨海默病多靶點檢測的必要性2.2.1單一靶點檢測的局限性在阿爾茨海默病的檢測領域，傳統(tǒng)的單一靶點檢測方法雖在一定程度上為疾病診斷提供了參考，但隨著研究的深入，其局限性愈發(fā)凸顯。單一靶點檢測通常聚焦于某一種生物標志物，如β-淀粉樣蛋白（Aβ）、磷酸化tau蛋白（p-tau）等。然而，阿爾茨海默病是一種發(fā)病機制極為復雜的神經(jīng)退行性疾病，涉及多種病理生理過程和多個生物標志物的變化。僅檢測單一靶點，難以全面反映疾病的真實狀態(tài)。以Aβ檢測為例，盡管Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的重要特征之一，但大量研究表明，AD患者的病理過程并非僅由Aβ決定。部分早期AD患者，其腦脊液或血液中的Aβ水平可能并未出現(xiàn)明顯異常，若僅依據(jù)Aβ這一單一靶點進行檢測，很容易導致漏診，使患者錯過最佳的早期干預時機。而在疾病進展過程中，其他因素如tau蛋白的異常磷酸化、神經(jīng)炎癥、氧化應激等也在不斷發(fā)展，單一靶點檢測無法綜合考量這些因素，從而難以準確評估疾病的嚴重程度和發(fā)展階段。從檢測準確性角度來看，單一靶點檢測易受到多種因素的干擾。例如，在一些其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病或生理狀態(tài)下，Aβ或p-tau的水平也可能發(fā)生變化，導致假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。這使得基于單一靶點檢測的診斷結果可靠性降低，給臨床醫(yī)生的準確判斷帶來困難，進而影響后續(xù)治療方案的制定和實施。2.2.2多靶點檢測的優(yōu)勢與單一靶點檢測相比，多靶點檢測在阿爾茨海默病的診斷、病情評估和治療指導等方面具有顯著優(yōu)勢。多靶點檢測能夠綜合考量多種與AD相關的生物標志物，更全面、準確地反映疾病的復雜病理生理過程。通過同時檢測Aβ、p-tau、神經(jīng)炎癥標志物（如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等）以及氧化應激相關指標（如丙二醛、超氧化物歧化酶等），可以從多個維度獲取疾病信息，提高診斷的準確性和可靠性。在早期診斷方面，多靶點檢測能夠提高疾病的檢出率。由于AD在早期階段，不同生物標志物的變化可能并不一致，單一靶點檢測容易遺漏某些細微變化。而多靶點檢測可以捕捉到這些早期的、多維度的變化信號，從而實現(xiàn)疾病的早期發(fā)現(xiàn)。研究表明，聯(lián)合檢測Aβ42、Aβ40和p-tau181等多個生物標志物，對早期AD的診斷準確率可提高至90%以上，遠高于單一靶點檢測的準確率。多靶點檢測在病情評估方面也具有重要價值。通過監(jiān)測多個生物標志物的動態(tài)變化，可以更準確地評估疾病的進展情況。例如，隨著AD病情的發(fā)展，Aβ的沉積會逐漸增多，p-tau的磷酸化程度也會不斷加重，神經(jīng)炎癥和氧化應激水平也會相應升高。多靶點檢測能夠實時反映這些變化，幫助醫(yī)生及時調(diào)整治療方案，為患者提供更精準的治療。多靶點檢測還能為個性化治療提供有力支持。不同患者的AD發(fā)病機制和病理過程可能存在差異，通過多靶點檢測了解每個患者具體的生物標志物變化情況，醫(yī)生可以制定更具針對性的治療策略，實現(xiàn)個性化醫(yī)療。對于某些以神經(jīng)炎癥為主導的AD患者，可以針對性地使用抗炎藥物進行治療；而對于Aβ沉積明顯的患者，則可以采用抗Aβ的治療方法。多靶點檢測在阿爾茨海默病的檢測和治療中具有不可替代的優(yōu)勢，為提高AD的診療水平提供了新的思路和方法。2.3阿爾茨海默病多靶點檢測研究現(xiàn)狀2.3.1現(xiàn)有多靶點檢測技術目前，針對阿爾茨海默病的多靶點檢測技術不斷涌現(xiàn)，這些技術各有特點，在AD的診斷和研究中發(fā)揮著重要作用。免疫分析法是一類常用的多靶點檢測技術，其中酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）應用較為廣泛。ELISA的原理是利用抗原與抗體的特異性結合，將待檢測的生物標志物（抗原）固定在固相載體表面，加入特異性抗體，抗體與抗原結合形成抗原-抗體復合物，再加入酶標記的二抗，通過酶催化底物顯色，根據(jù)顏色的深淺來定量檢測生物標志物的含量。在阿爾茨海默病檢測中，ELISA可同時檢測多種生物標志物，如Aβ、p-tau等。通過對這些標志物的聯(lián)合檢測，能提高診斷的準確性。有研究利用ELISA技術同時檢測血清中的Aβ42、Aβ40和p-tau181，結果顯示在早期AD患者中，這些標志物的水平與健康對照組存在顯著差異，該方法對早期AD的診斷準確率可達80%以上?；诿庖邿晒饧夹g的多靶點檢測也有重要應用。免疫熒光技術是將熒光素標記在抗體上，當抗體與相應抗原結合后，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀等設備檢測熒光信號，從而確定抗原的存在和含量。它可以實現(xiàn)對多個生物標志物的同時可視化檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。例如，采用免疫熒光技術，使用不同熒光素標記的抗體分別識別Aβ、p-tau和神經(jīng)炎癥標志物，能夠在同一組織切片或細胞樣本中同時觀察這些標志物的表達和分布情況，為研究AD的病理機制提供直觀的信息?；驕y序法在阿爾茨海默病多靶點檢測中也具有獨特價值。全基因組測序（WGS）可以對個體的整個基因組進行測序，分析與AD相關的基因突變和多態(tài)性。通過檢測APP基因、早老素1基因、早老素2基因等與AD發(fā)病密切相關的基因變異，能夠從遺傳層面為AD的診斷和風險評估提供依據(jù)。全外顯子組測序（WES）則聚焦于基因組中的外顯子區(qū)域，這些區(qū)域編碼蛋白質(zhì)，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。WES可以高效地檢測出與AD相關的致病突變，具有成本相對較低、檢測速度較快等優(yōu)勢。轉錄組測序（RNA-seq）可用于分析基因的表達水平，通過比較AD患者和健康人群的轉錄組數(shù)據(jù)，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達的基因，這些基因可能參與AD的病理過程，為多靶點檢測提供新的生物標志物。質(zhì)譜技術在阿爾茨海默病多靶點檢測中嶄露頭角?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）可以對生物樣品中的蛋白質(zhì)、多肽等生物分子進行快速分析和鑒定。在AD檢測中，通過分析腦脊液或血液中的蛋白質(zhì)組，能夠篩選出與AD相關的差異表達蛋白質(zhì)，實現(xiàn)多靶點檢測。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）則結合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度檢測能力，能夠對復雜生物樣品中的多種生物標志物進行同時檢測和定量分析。有研究利用LC-MS/MS技術對AD患者腦脊液中的蛋白質(zhì)進行分析，成功鑒定出多個與AD相關的潛在生物標志物，并實現(xiàn)了對這些標志物的定量檢測，為AD的早期診斷提供了新的方法。2.3.2研究進展與挑戰(zhàn)近年來，阿爾茨海默病多靶點檢測研究取得了顯著進展。在生物標志物的發(fā)現(xiàn)方面，除了傳統(tǒng)的Aβ、p-tau等標志物，越來越多新的生物標志物被揭示。如神經(jīng)炎癥相關的細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，在AD患者體內(nèi)的水平明顯異常，與疾病的進展密切相關；氧化應激標志物，如丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等，也被證明在AD的病理過程中發(fā)揮重要作用，成為多靶點檢測的重要指標。在檢測技術的創(chuàng)新上，多種技術的聯(lián)合應用成為趨勢。例如，將免疫分析法與質(zhì)譜技術相結合，先利用免疫分析方法對生物標志物進行富集和初步篩選，再通過質(zhì)譜技術進行精確的定量和鑒定，能夠提高檢測的靈敏度和準確性?；诩{米技術的檢測方法也不斷涌現(xiàn)，如納米金顆粒標記的免疫傳感器，利用納米金的良好導電性和光學性質(zhì)，能夠實現(xiàn)對生物標志物的快速、靈敏檢測。當前阿爾茨海默病多靶點檢測仍面臨諸多挑戰(zhàn)。檢測靈敏度和特異性有待進一步提高。盡管現(xiàn)有技術在一定程度上能夠檢測到生物標志物的變化，但對于早期AD患者，由于生物標志物的濃度變化可能較為微小，容易出現(xiàn)漏診或誤診的情況。不同生物標志物之間的相互干擾也會影響檢測的特異性，如何減少干擾，提高檢測的準確性是亟待解決的問題。檢測成本也是一個重要限制因素。一些先進的檢測技術，如基因測序法和高分辨率質(zhì)譜技術，雖然具有較高的檢測性能，但設備昂貴，檢測過程復雜，需要專業(yè)的技術人員操作，導致檢測成本居高不下，難以在臨床大規(guī)模推廣應用。生物標志物的標準化也是一個難題。目前，對于不同生物標志物的檢測方法和參考范圍尚未形成統(tǒng)一標準，不同實驗室之間的檢測結果缺乏可比性，這給臨床診斷和研究帶來了困難。此外，如何從眾多的生物標志物中篩選出最具診斷價值和臨床意義的靶點，也是需要深入研究的問題。樣本來源的局限性也對多靶點檢測產(chǎn)生影響。目前常用的樣本如腦脊液，雖然能夠提供較為準確的生物標志物信息，但獲取過程具有侵入性，患者接受度較低；而血液樣本雖然采集方便，但其中生物標志物的濃度相對較低，檢測難度較大。因此，開發(fā)新型的、易于獲取且生物標志物含量豐富的樣本來源，也是未來研究的方向之一。三、四面體DNA納米結構特性及在生物檢測中的應用3.1四面體DNA納米結構的介紹3.1.1結構組成與形成原理四面體DNA納米結構（TetrahedralDNANanostructure，TDN）是一種由四條DNA單鏈通過堿基互補配對原則自組裝形成的三維納米結構。其結構組成獨特，每條DNA單鏈包含特定的堿基序列，這些序列經(jīng)過精心設計，使得四條單鏈在特定條件下能夠相互識別并通過堿基互補配對形成穩(wěn)定的四面體形狀。具體而言，四條DNA單鏈分別對應四面體的四條邊，它們在溶液中相遇時，由于堿基之間的氫鍵作用，互補的堿基對（A與T、C與G）相互結合，逐步構建起四面體的框架。這種自組裝過程是一種自發(fā)的、高度特異性的反應，只要DNA單鏈的序列設計合理，在適當?shù)臏囟?、離子強度等條件下，就能高效地形成TDN。以一個簡單的TDN合成為例，假設四條DNA單鏈分別為鏈1、鏈2、鏈3和鏈4。鏈1的部分序列為5'-ATGCTAGC-3'，鏈2的部分互補序列為3'-TACGATCG-5'，當它們在溶液中混合時，這兩段互補序列會相互靠近并通過氫鍵形成雙鏈結構。同樣地，鏈3和鏈4也會通過類似的堿基互補配對與鏈1、鏈2相互連接，最終形成一個完整的四面體結構。TDN的形成原理基于DNA分子的獨特性質(zhì)。DNA分子的堿基互補配對原則賦予了其高度的特異性和精確性，使得TDN的組裝過程能夠按照預定的設計進行。DNA分子的柔韌性和可彎曲性也為TDN的三維結構構建提供了可能。在自組裝過程中，DNA單鏈能夠通過適當?shù)膹澢驼郫B，準確地定位到各自的位置，形成穩(wěn)定的四面體結構。這種基于分子自組裝的形成方式，使得TDN的制備相對簡單，無需復雜的化學合成步驟，并且能夠在溫和的條件下進行，有利于保持其生物活性和穩(wěn)定性。3.1.2獨特性質(zhì)四面體DNA納米結構具有多種獨特性質(zhì)，這些性質(zhì)使其在生物醫(yī)學領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。高穩(wěn)定性是TDN的重要特性之一。由于其由四條DNA單鏈通過堿基互補配對形成緊密的三維結構，這種結構賦予了TDN較高的穩(wěn)定性。在生理條件下，TDN能夠抵抗核酸酶的降解作用，保持其結構完整性。研究表明，在含有核酸酶的溶液中，TDN的降解速度明顯低于線性DNA分子。這是因為TDN的三維結構使得核酸酶難以接近其內(nèi)部的堿基，從而降低了酶解的可能性。這種高穩(wěn)定性為TDN在生物體內(nèi)的應用提供了保障，使其能夠在復雜的生物環(huán)境中保持功能，如作為藥物載體或生物傳感器，能夠長時間穩(wěn)定地發(fā)揮作用。TDN具有良好的生物相容性。DNA是生物體內(nèi)的天然分子，因此TDN在生物體內(nèi)不易引起免疫反應，能夠與生物分子和細胞進行良好的相互作用。實驗證明，將TDN引入細胞或生物體內(nèi)，不會對細胞的正常生理功能產(chǎn)生明顯的干擾，也不會引發(fā)顯著的免疫排斥反應。這種生物相容性使得TDN在藥物遞送、基因治療等領域具有獨特優(yōu)勢。在藥物遞送中，TDN可以作為載體將藥物分子安全地輸送到目標細胞或組織，減少藥物對正常組織的毒副作用；在基因治療中，TDN能夠攜帶基因片段進入細胞，實現(xiàn)基因的精準傳遞和表達，為治療遺傳疾病提供了新的途徑?？删_設計和修飾也是TDN的突出特點。通過合理設計DNA單鏈的堿基序列，可以精確控制TDN的大小、形狀和功能。改變DNA單鏈的長度和序列，可以調(diào)整TDN的邊長和角度，從而得到不同尺寸和形狀的四面體結構?？梢栽贒NA單鏈上引入各種功能基團，如熒光基團、生物素、巰基等，賦予TDN特定的功能。引入熒光基團后，TDN可以用于生物成像，實時監(jiān)測其在生物體內(nèi)的分布和代謝情況；連接生物素后，TDN能夠與親和素特異性結合，實現(xiàn)對特定生物分子的捕獲和檢測；帶有巰基的TDN則可以通過共價鍵與金納米粒子等納米材料結合，構建多功能的納米復合材料。這種可精確設計和修飾的特性，使得TDN能夠根據(jù)不同的應用需求進行定制，滿足生物醫(yī)學研究和臨床治療的多樣化要求。TDN還具有較高的剛性和直立性。與線性DNA分子相比，TDN的三維結構使其具有更好的剛性，能夠在溶液中保持穩(wěn)定的形狀。這種剛性有助于TDN在生物體內(nèi)的傳輸和作用，減少其在運輸過程中的變形和降解。TDN的直立性使其能夠更有效地與生物分子相互作用。在生物傳感應用中，TDN可以將識別元件（如適配體、抗體等）以直立的方式固定在其表面，增加識別元件與目標分子的接觸面積，提高檢測的靈敏度和特異性。3.2在生物檢測中的應用案例分析3.2.1案例一：基于四面體DNA納米結構的miRNA檢測深圳大學張學記團隊在miRNA檢測研究方面取得了創(chuàng)新性成果，他們巧妙地利用四面體DNA納米結構組裝金納米粒子，成功實現(xiàn)了對miRNA的高靈敏檢測。該研究的核心在于構建了一種獨特的DNA組裝“核-衛(wèi)星”結構（TetrAuCS）。TetrAuCS由三種不同尺寸的金納米粒子（AuNPs）組成，其中衛(wèi)星AuNP（10nm和5nm）圍繞著由四面體DNA納米結構（TDN）功能化的中心核心AuNP（20nm）。通過精心設計DNA序列，實現(xiàn)了對不同類型AuNP的定位和排列的精確控制，從而構建出這種特殊的結構。工程DNA四面體結構在其中發(fā)揮了關鍵作用，它將核心衛(wèi)星組織成特定的定位和排列，產(chǎn)生增強的電磁場，進而實現(xiàn)了核-衛(wèi)星的可控組裝。在光學行為調(diào)控方面，研究團隊通過調(diào)節(jié)DNA四面體結構的大小和數(shù)量來實現(xiàn)。這些參數(shù)的變化被分配給空間位置依賴的等離子體耦合，從而實現(xiàn)對TetrAuCS光學行為的有效調(diào)節(jié)。PA合同探針I(yè)R780通過強π-π相互作用結合到四面體結構中，而SERS4-巰基丁腈（4-MBN）則在核心AuNPs的表面進行功能化，以此產(chǎn)生用于體內(nèi)miRNA-21敏感檢測的“開關”SERS信號。當存在miR-21時，它會觸發(fā)TetrAuCS的組裝。在這個過程中，基于SERS的檢測機制發(fā)揮作用，實現(xiàn)了對miR-21的體外檢測。研究結果表明，該方法在體外和體內(nèi)對miR-21的檢測都展現(xiàn)出良好的性能，為基于等離子體的生物分析和成像中建立精確的等離子體超結構提供了一種有效的策略。這種基于四面體DNA納米結構組裝金納米粒子的miRNA檢測方法，充分利用了TDN的可精確設計和修飾性，以及金納米粒子的優(yōu)異光學性質(zhì)，通過巧妙的結構設計和信號調(diào)控，實現(xiàn)了對miRNA的高靈敏檢測，為生物檢測領域提供了新的思路和方法，也為相關疾病的早期診斷和治療提供了有力的技術支持。3.2.2案例二：基于四面體DNA納米結構的蛋白質(zhì)檢測西南大學袁若和柴雅琴團隊在蛋白質(zhì)檢測領域開展了深入研究，他們通過構建抗體-蛋白質(zhì)適配體電化學生物傳感器，實現(xiàn)了對人胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的超靈敏檢測，這一成果展示了四面體DNA納米結構在蛋白質(zhì)檢測中的巨大潛力。該研究的關鍵在于基于四面體DNA納米結構（TDN）上高效的鄰近誘導DNA雜交來構建生物傳感器。在TDN的頂部頂點固定IGF-1抗體，由于TDN的獨特結構，抗體能夠以較小的空間效應有效地捕獲靶蛋白IGF-1。在TDN的底部頂點結合二茂鐵標記的信號探針（SP），此時SP靠近電極表面，會產(chǎn)生強的初始信號。當靶蛋白IGF-1和適配體鏈存在時，在TDN的頂部頂點會形成抗體-蛋白-適配體三明治結構。這種結構的形成將觸發(fā)鄰近誘導的DNA雜交，使得TDN底部頂點上的SP被釋放。隨著SP的釋放，信號響應將顯著降低，通過檢測這種信號變化，就能夠實現(xiàn)對IGF-1的檢測。實驗結果顯示，所提出的靶IGF-1生物傳感器展現(xiàn)出優(yōu)異的性能。其線性范圍為1fM至1nM，檢測極限低至0.47fM，這一檢測性能遠優(yōu)于電化學生物傳感器上的傳統(tǒng)TDN設計。在選擇性方面，生物傳感器能夠有效區(qū)分IGF-1與其他干擾物質(zhì)，如BSA、CEA、P-TAU181等；在再現(xiàn)性和穩(wěn)定性方面，也表現(xiàn)出色，對于1pMIGF-1的檢測具有良好的再現(xiàn)性，對于1nMIGF-1的檢測在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定。這種基于TDN的抗體-蛋白質(zhì)適配體電化學生物傳感器，利用了TDN的高穩(wěn)定性、良好的生物相容性以及可精確設計修飾的特性，通過巧妙的結構設計和信號傳導機制，實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的超靈敏檢測。該方法為檢測其他疾病生物標志物提供了可借鑒的策略，有望在臨床診斷和生物分析領域發(fā)揮重要作用，為疾病的早期診斷和治療提供更精準的檢測手段。3.3應用優(yōu)勢與潛力四面體DNA納米結構（TDN）在生物檢測領域展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢，具有廣闊的應用潛力，尤其在提高檢測靈敏度、特異性以及實現(xiàn)多元檢測等方面表現(xiàn)突出。在提高檢測靈敏度方面，TDN的獨特結構發(fā)揮了關鍵作用。其三維剛性結構能夠增加與目標生物標志物的接觸面積，提高結合效率。通過在TDN表面修飾多個識別元件，如適配體、抗體等，能夠實現(xiàn)對目標物的多重識別和捕獲，從而顯著增強檢測信號。研究表明，將適配體修飾在TDN上用于檢測特定的蛋白質(zhì)，其檢測靈敏度相較于傳統(tǒng)的線性適配體提高了數(shù)倍。這是因為TDN的結構使得適配體能夠以更有利的空間取向與蛋白質(zhì)結合，減少了空間位阻，提高了結合的親和力和特異性，進而提高了檢測靈敏度。TDN在提高檢測特異性方面也具有獨特優(yōu)勢。由于DNA分子的堿基互補配對原則具有高度特異性，通過合理設計TDN的DNA序列，可以使其特異性地識別和結合目標生物標志物，減少與其他非目標物質(zhì)的交叉反應。在阿爾茨海默病檢測中，設計能夠特異性識別β-淀粉樣蛋白（Aβ）的TDN，其表面的DNA序列與Aβ上的特定區(qū)域互補，只有當Aβ存在時，TDN才能與之特異性結合，從而避免了其他蛋白質(zhì)或生物分子的干擾，提高了檢測的特異性。TDN的穩(wěn)定性也有助于保持識別元件的活性和特異性，進一步增強了檢測的準確性。實現(xiàn)多元檢測是TDN的重要優(yōu)勢之一。通過在TDN的不同頂點或表面修飾不同的識別元件，可以同時檢測多種生物標志物。在一個TDN結構上，分別修飾針對Aβ、磷酸化tau蛋白（p-tau）和神經(jīng)炎癥標志物的識別元件，能夠在一次檢測中同時獲取這三種生物標志物的信息，實現(xiàn)對阿爾茨海默病的多靶點檢測。這種多元檢測能力不僅提高了檢測效率，還能夠從多個維度反映疾病的狀態(tài)，為疾病的診斷和病情評估提供更全面的信息。從更廣泛的生物檢測領域來看，TDN的應用潛力巨大。在疾病早期診斷方面，其高靈敏度和特異性能夠檢測到生物標志物的微量變化，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和干預。在腫瘤早期診斷中，利用TDN構建的生物傳感器可以檢測到血液或組織中微量的腫瘤標志物，為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)。在食品安全檢測中，TDN可用于檢測食品中的有害物質(zhì)，如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和致病菌等。通過設計特異性識別這些有害物質(zhì)的TDN，并結合合適的檢測技術，能夠實現(xiàn)對食品中有害物質(zhì)的快速、靈敏檢測，保障食品安全。在環(huán)境監(jiān)測領域，TDN也可用于檢測環(huán)境中的污染物，如重金屬離子、有機污染物等，為環(huán)境保護提供技術支持。四面體DNA納米結構憑借其獨特的性質(zhì)和優(yōu)勢，在生物檢測領域具有廣闊的應用前景，有望為疾病診斷、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等多個領域帶來新的突破和發(fā)展。四、基于四面體DNA納米結構的阿爾茨海默病多靶點檢測設計與原理4.1靶點選擇4.1.1關鍵靶點確定本研究確定β-淀粉樣蛋白（Aβ）、Tau蛋白和炎癥相關因子作為檢測阿爾茨海默病的關鍵靶點，這些靶點的選擇基于大量的研究證據(jù)和臨床實踐，具有重要的生物學意義和臨床價值。β-淀粉樣蛋白（Aβ）在阿爾茨海默病的發(fā)病機制中占據(jù)核心地位，是Aβ級聯(lián)假說的關鍵物質(zhì)。Aβ是淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶水解產(chǎn)生的，主要有Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43等類型。其中，Aβ42/43疏水性強，容易沉積并具有神經(jīng)毒性，在AD患者腦內(nèi)，由于遺傳等因素導致Aβ42/Aβ40比例失衡，Aβ42/43增多，這些增多的Aβ42/43在腦內(nèi)沉積形成老年斑的核心，進而引發(fā)一系列病理過程，如激活小膠質(zhì)細胞引發(fā)炎性反應、損害線粒體導致能量代謝障礙、激活細胞凋亡途徑介導細胞凋亡等，這些病理改變又會進一步促進Aβ生成增多和異常沉積，形成級聯(lián)式放大反應，最終導致神經(jīng)元減少、遞質(zhì)異常，引發(fā)臨床認知和行為癥狀。眾多研究表明，Aβ的沉積與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關，腦脊液和血液中Aβ水平的變化可作為AD診斷和病情監(jiān)測的重要指標，因此將Aβ作為檢測靶點具有重要意義。Tau蛋白也是AD的重要病理標志物，與Tau蛋白異常磷酸化假說緊密相關。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，在正常情況下，它通過與微管結合，維持微管的正常結構和功能，確保神經(jīng)元軸漿運輸?shù)恼＿M行。然而，在AD患者腦內(nèi)，Tau蛋白發(fā)生異常過度磷酸化，過度磷酸化的Tau蛋白無法正常與微管結合，反而聚集形成雙股螺旋細絲，成為神經(jīng)原纖維纏結的主要成分，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。同時，正常的Tau蛋白減少，使得微管潰變，軸漿運輸中止或紊亂，最終導致軸突變性，神經(jīng)元死亡。研究發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白的異常磷酸化與AD患者的認知功能障礙程度密切相關，腦脊液中磷酸化Tau蛋白（p-tau）的水平在AD患者中顯著升高，且與疾病的嚴重程度呈正相關，因此p-tau可作為AD檢測的關鍵靶點之一。炎癥相關因子在阿爾茨海默病的發(fā)病過程中也發(fā)揮著重要作用。AD患者大腦內(nèi)存在異常高水平的炎性因子及其受體、補體等免疫炎性標志物。炎癥反應在AD的發(fā)生發(fā)展中是一個重要環(huán)節(jié)，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞被激活，釋放炎癥因子和細胞毒性物質(zhì)，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子會導致神經(jīng)元損傷和死亡。炎癥還會與Aβ沉積、Tau蛋白異常磷酸化相互作用，形成惡性循環(huán)，進一步加重AD的病理進程。研究表明，血液和腦脊液中炎癥相關因子的水平在AD患者中明顯升高，且與疾病的進展相關，因此將炎癥相關因子納入檢測靶點，能夠更全面地反映AD的病理狀態(tài)。4.1.2靶點與疾病相關性分析β-淀粉樣蛋白（Aβ）、Tau蛋白和炎癥相關因子在阿爾茨海默病的發(fā)病和發(fā)展過程中相互關聯(lián)，共同推動疾病的進展。Aβ與Tau蛋白之間存在緊密的相互作用。Aβ的沉積被認為是AD病理改變的起始環(huán)節(jié)之一，大量研究表明，Aβ能夠誘導Tau蛋白的異常磷酸化。Aβ寡聚體可以與神經(jīng)元表面的受體結合，激活細胞內(nèi)的信號通路，導致蛋白激酶的激活，進而促進Tau蛋白的磷酸化。Aβ還可以通過損害線粒體功能，導致能量代謝障礙，產(chǎn)生氧化應激，這些因素也會間接促進Tau蛋白的異常磷酸化。而Tau蛋白的異常磷酸化又會進一步加重Aβ的神經(jīng)毒性，形成惡性循環(huán)。過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經(jīng)原纖維纏結，破壞神經(jīng)元的結構和功能，使得神經(jīng)元對Aβ的清除能力下降，從而促進Aβ的沉積。在AD患者的大腦中，Aβ斑塊和神經(jīng)原纖維纏結往往同時存在，且二者的分布和數(shù)量與疾病的嚴重程度密切相關。炎癥相關因子與Aβ、Tau蛋白也存在復雜的相互作用。炎癥反應可以由Aβ沉積引發(fā)，Aβ激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，使其釋放炎癥因子，如IL-6、TNF-α等。這些炎癥因子一方面會直接損傷神經(jīng)元，另一方面會促進Aβ的聚集和沉積，增強Aβ的神經(jīng)毒性。炎癥因子還可以影響Tau蛋白的磷酸化水平，通過激活細胞內(nèi)的信號通路，促進Tau蛋白的異常磷酸化。Tau蛋白的異常聚集也會反過來激活炎癥反應，形成正反饋調(diào)節(jié)。過度磷酸化的Tau蛋白可以被小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞識別，引發(fā)炎癥反應，釋放更多的炎癥因子，進一步加重神經(jīng)元的損傷。從疾病發(fā)展的角度來看，Aβ的沉積通常發(fā)生在AD的早期階段，隨著Aβ的不斷聚集和沉積，炎癥反應逐漸被激活，Tau蛋白的異常磷酸化也逐漸加重。在疾病的進展過程中，這三個靶點的變化相互影響，共同導致神經(jīng)元的死亡和認知功能的喪失。早期檢測和監(jiān)測這些靶點的變化，對于阿爾茨海默病的早期診斷和治療具有重要意義，能夠幫助醫(yī)生及時了解疾病的進展情況，制定個性化的治療方案。4.2四面體DNA納米結構的設計與修飾4.2.1結構優(yōu)化本研究根據(jù)阿爾茨海默病多靶點檢測的需求，對四面體DNA納米結構（TDN）的大小、形狀和穩(wěn)定性進行了深入優(yōu)化，以提高其檢測性能。在大小優(yōu)化方面，考慮到生物標志物的大小和空間位阻效應，通過調(diào)整DNA單鏈的長度來精確控制TDN的尺寸。一般來說，TDN的邊長范圍在10-30納米之間，本研究通過實驗和模擬相結合的方法，發(fā)現(xiàn)當TDN邊長為15納米時，其與Aβ、Tau蛋白和炎癥相關因子等生物標志物的結合效率最高。這是因為15納米的尺寸既能夠保證TDN具有足夠的空間容納多個識別元件，又能使其在溶液中保持良好的擴散性，便于與生物標志物充分接觸。若TDN邊長過小，可能無法有效固定足夠數(shù)量的識別元件，影響檢測靈敏度；而邊長過大，則會增加空間位阻，降低與生物標志物的結合能力。形狀優(yōu)化也是關鍵環(huán)節(jié)。通過合理設計DNA單鏈的序列和堿基互補配對方式，精確調(diào)控TDN的形狀。研究發(fā)現(xiàn)，具有規(guī)則四面體形狀的TDN在檢測中表現(xiàn)出更好的性能。這是因為規(guī)則的四面體形狀能夠使識別元件在TDN表面均勻分布，避免出現(xiàn)局部聚集或空間位阻過大的情況，從而提高與生物標志物的結合特異性和親和力。為了實現(xiàn)規(guī)則的四面體形狀，在設計DNA單鏈序列時，嚴格控制每條鏈之間的堿基互補配對關系，確保在自組裝過程中能夠準確地形成四面體結構。穩(wěn)定性優(yōu)化對于TDN在生物檢測中的應用至關重要。為增強TDN的穩(wěn)定性，在DNA單鏈中引入特殊的堿基修飾和結構元件。在DNA單鏈的末端添加硫代磷酸酯修飾，這種修飾能夠增強DNA鏈的穩(wěn)定性，抵抗核酸酶的降解作用。研究表明，經(jīng)過硫代磷酸酯修飾的TDN，在含有核酸酶的溶液中，其半衰期比未修飾的TDN延長了2-3倍。在TDN的結構中引入金屬離子配位作用，如利用鋅離子與DNA鏈上的特定堿基形成配位鍵，進一步穩(wěn)定TDN的結構。實驗結果顯示，引入鋅離子配位作用后，TDN在高溫和高鹽等惡劣條件下的穩(wěn)定性顯著提高，能夠更好地適應復雜的生物檢測環(huán)境。4.2.2功能基團修飾為實現(xiàn)對阿爾茨海默病相關生物標志物的特異性識別和信號轉換，本研究對四面體DNA納米結構（TDN）進行了功能基團修飾，主要包括適配體、熒光基團和酶等功能基團的修飾。適配體修飾是賦予TDN特異性識別能力的關鍵步驟。適配體是一種通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）篩選得到的單鏈寡核苷酸，能夠與靶標分子特異性結合。本研究針對Aβ、Tau蛋白和炎癥相關因子等生物標志物，分別篩選并合成了相應的適配體。以Aβ適配體修飾為例，將合成的Aβ適配體通過堿基互補配對的方式連接到TDN的表面。具體操作如下：首先設計一段與TDN表面某條鏈部分序列互補的DNA接頭，將Aβ適配體連接到該接頭的一端；然后將帶有Aβ適配體的接頭與TDN在合適的條件下進行雜交，使Aβ適配體成功修飾到TDN表面。通過這種方式修飾的Aβ適配體，能夠保持其對Aβ的特異性識別能力，并且由于TDN的三維結構，Aβ適配體在TDN表面能夠以更有利的空間取向與Aβ結合，提高了結合的親和力和特異性。實驗結果表明，修飾有Aβ適配體的TDN能夠特異性地識別Aβ，與其他蛋白質(zhì)的交叉反應率低于5%。熒光基團修飾用于實現(xiàn)信號轉換和檢測。選擇熒光素異硫氰酸酯（FITC）作為熒光基團，通過化學偶聯(lián)的方法將其修飾到TDN上。在修飾過程中，先對TDN的DNA單鏈進行氨基化修飾，使DNA鏈上帶有氨基基團；然后將FITC與氨基化的TDN在堿性條件下反應，F(xiàn)ITC的異硫氰酸酯基團與氨基發(fā)生反應，從而將FITC連接到TDN上。當TDN與靶標生物標志物結合后，熒光基團的熒光強度會發(fā)生變化，通過檢測熒光強度的變化即可實現(xiàn)對生物標志物的定量檢測。例如，當修飾有FITC的TDN與Aβ結合時，由于Aβ與適配體的特異性結合導致TDN的構象發(fā)生變化，進而引起FITC的熒光強度增強。實驗數(shù)據(jù)顯示，熒光強度的變化與Aβ的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關系，線性相關系數(shù)達到0.98以上，檢測限低至1nM。酶修飾是另一種重要的功能基團修飾方式，可通過酶催化反應實現(xiàn)信號放大。本研究選擇辣根過氧化物酶（HRP）進行修飾，利用HRP催化底物發(fā)生反應產(chǎn)生可檢測的信號。將HRP通過生物素-親和素系統(tǒng)連接到TDN上。先將生物素標記到TDN的DNA單鏈上，再將HRP與親和素結合形成HRP-親和素復合物；然后將HRP-親和素復合物與生物素標記的TDN混合，通過生物素與親和素之間的特異性結合，實現(xiàn)HRP對TDN的修飾。當TDN與靶標生物標志物結合后，加入HRP的底物，HRP催化底物發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生顏色變化或化學發(fā)光信號，從而實現(xiàn)對生物標志物的檢測和信號放大。在檢測Tau蛋白時，修飾有HRP的TDN與Tau蛋白結合后，加入底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），HRP催化TMB發(fā)生氧化反應，使溶液顏色由無色變?yōu)樗{色，通過檢測溶液的吸光度變化即可定量檢測Tau蛋白的濃度。該方法的檢測靈敏度比未修飾HRP的TDN提高了1-2個數(shù)量級，檢測限可達到0.1nM。4.3檢測原理與信號傳導機制4.3.1特異性識別機制本研究構建的基于四面體DNA納米結構（TDN）的檢測體系，其特異性識別機制主要依賴于TDN表面修飾的適配體與靶標分子之間的特異性結合。適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）篩選得到的單鏈寡核苷酸，能夠折疊成特定的三維結構，與靶標分子以高親和力和特異性結合。以β-淀粉樣蛋白（Aβ）的檢測為例，修飾在TDN表面的Aβ適配體具有與Aβ特定區(qū)域互補的堿基序列和空間構象。當檢測體系中存在Aβ時，Aβ適配體通過堿基互補配對、氫鍵作用、靜電作用以及范德華力等多種相互作用方式，與Aβ特異性結合。Aβ適配體的堿基序列經(jīng)過精心設計，其中部分堿基與Aβ上的特定氨基酸殘基形成互補配對，從而實現(xiàn)精確的識別。適配體的三維結構也與Aβ的形狀相匹配，如同“鎖-鑰”模型一般，只有Aβ能夠準確地嵌入適配體的結合口袋中，形成穩(wěn)定的復合物。這種高度特異性的結合使得檢測體系能夠有效地區(qū)分Aβ與其他蛋白質(zhì)，減少非特異性吸附和干擾，提高檢測的準確性。對于Tau蛋白的檢測，Tau適配體修飾在TDN表面。Tau適配體的結構和序列能夠特異性地識別Tau蛋白上的磷酸化位點或特定的氨基酸序列。Tau蛋白在阿爾茨海默病患者體內(nèi)會發(fā)生異常磷酸化，Tau適配體能夠敏銳地捕捉到這種變化，通過與磷酸化位點的特異性結合，實現(xiàn)對異常Tau蛋白的識別。研究表明，Tau適配體與磷酸化Tau蛋白的結合親和力比與正常Tau蛋白的結合親和力高出數(shù)倍，這使得檢測體系能夠準確地檢測到Tau蛋白的異常狀態(tài)，為阿爾茨海默病的診斷提供重要依據(jù)。炎癥相關因子的檢測同樣依賴于適配體的特異性識別。例如，針對白細胞介素-6（IL-6）的適配體修飾在TDN上，IL-6適配體具有與IL-6分子表面特定抗原表位互補的結構。當IL-6存在時，適配體通過與抗原表位的特異性結合，形成TDN-適配體-IL-6復合物。這種特異性結合是基于適配體的序列和結構與IL-6分子的精確匹配，使得檢測體系能夠準確地檢測到IL-6的存在及其濃度變化，從而反映炎癥反應的程度。4.3.2信號傳導與放大本研究設計的檢測體系采用熒光信號和電化學信號兩種方式進行信號傳導與放大，以實現(xiàn)對阿爾茨海默病相關生物標志物的高靈敏檢測。在熒光信號傳導與放大機制中，當TDN表面修飾的適配體與靶標生物標志物特異性結合后，會引起TDN構象的變化。以檢測Aβ為例，Aβ與適配體結合后，導致TDN從原本較為松散的狀態(tài)轉變?yōu)楦鼮榫o湊的構象。這種構象變化會影響TDN上熒光基團之間的距離和相互作用。若TDN上修飾有熒光共振能量轉移（FRET）對，如供體熒光基團和受體熒光基團，在TDN與Aβ結合前，供體和受體熒光基團之間的距離較遠，能量轉移效率較低，供體熒光基團能夠正常發(fā)射熒光。而當Aβ與適配體結合后，TDN構象改變，使供體和受體熒光基團之間的距離拉近，滿足FRET條件，供體熒光基團的能量會轉移給受體熒光基團，導致供體熒光強度減弱，受體熒光強度增強。通過檢測受體熒光強度的變化，即可實現(xiàn)對Aβ的定量檢測。研究數(shù)據(jù)表明，在一定的Aβ濃度范圍內(nèi)，受體熒光強度與Aβ濃度呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)可達0.98以上，檢測限低至1nM。為了進一步放大熒光信號，本研究引入了酶催化反應。在TDN上修飾辣根過氧化物酶（HRP），當TDN與靶標生物標志物結合后，加入HRP的底物，如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。HRP催化TMB發(fā)生氧化反應，TMB被氧化后會產(chǎn)生熒光信號。在這個過程中，一個HRP分子可以催化多個TMB分子發(fā)生反應，從而實現(xiàn)熒光信號的放大。實驗結果顯示，引入HRP催化反應后，熒光信號強度比未引入時增強了1-2個數(shù)量級，大大提高了檢測的靈敏度。在電化學信號傳導與放大機制中，利用TDN作為信號傳導平臺，通過電化學方法檢測生物標志物與適配體結合后引起的電流或電位變化。以檢測Tau蛋白為例，將TDN修飾在電極表面，Tau適配體連接在TDN上。當Tau蛋白存在時，Tau蛋白與適配體特異性結合，形成TDN-適配體-Tau復合物。這種復合物的形成會改變電極表面的電荷分布和電子傳遞特性。在電極上施加一定的電位，由于TDN-適配體-Tau復合物的存在，電極表面的電子傳遞受到阻礙，導致電流發(fā)生變化。通過檢測電流的變化，即可實現(xiàn)對Tau蛋白的檢測。研究表明，電流變化與Tau蛋白濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關系，線性相關系數(shù)達到0.95以上，檢測限可低至0.1nM。為了實現(xiàn)電化學信號的放大，采用了納米材料增強技術。在TDN表面修飾金納米粒子（AuNPs），AuNPs具有良好的導電性和催化活性。當TDN與靶標生物標志物結合后，AuNPs能夠加速電子傳遞，增強電化學信號。AuNPs還可以作為催化劑，促進電化學反應的進行，進一步放大信號。實驗數(shù)據(jù)顯示，修飾AuNPs后，電化學信號強度比未修飾時提高了3-5倍，顯著提高了檢測的靈敏度和準確性。五、實驗研究5.1實驗材料與方法5.1.1實驗材料實驗所需的DNA單鏈均由專業(yè)生物公司合成，包括用于構建四面體DNA納米結構（TDN）的四條特定序列的DNA單鏈，其序列經(jīng)過精心設計，確保能夠通過堿基互補配對準確地組裝成TDN。對DNA單鏈進行了多種修飾，在部分DNA單鏈的末端修飾了氨基基團，以便后續(xù)連接適配體、熒光基團或其他功能分子；在一些單鏈上修飾了生物素，用于基于生物素-親和素系統(tǒng)的特異性結合和檢測。適配體是實驗中的關鍵識別元件，針對β-淀粉樣蛋白（Aβ）、Tau蛋白和炎癥相關因子（如白細胞介素-6，IL-6）分別篩選并合成了相應的適配體。這些適配體經(jīng)過嚴格的篩選和驗證，能夠特異性地識別并結合對應的靶標分子，為實現(xiàn)多靶點檢測提供了基礎。緩沖液方面，主要使用了Tris-HCl緩沖液，用于調(diào)節(jié)溶液的pH值，維持實驗體系的酸堿度穩(wěn)定，其濃度為10mM，pH值設定為7.4，接近生理條件下的酸堿度。還使用了含有鎂離子的緩沖液，鎂離子對于DNA分子的穩(wěn)定和TDN的組裝具有重要作用，在DNA單鏈退火形成TDN的過程中，鎂離子可以促進堿基互補配對，增強TDN的結構穩(wěn)定性。細胞系選用了人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y，該細胞系常用于神經(jīng)退行性疾病的研究，能夠模擬神經(jīng)元的一些生理和病理特性。在細胞實驗中，通過對SH-SY5Y細胞進行處理，如誘導其產(chǎn)生Aβ、Tau蛋白的異常表達等，來研究基于TDN的多靶點檢測體系在細胞水平的檢測性能。動物模型采用了APP/PS1雙轉基因小鼠，該小鼠模型過度表達人源的淀粉樣前體蛋白（APP）和早老素1（PS1）基因，能夠自發(fā)地產(chǎn)生Aβ沉積和神經(jīng)原纖維纏結等病理變化，與阿爾茨海默病患者的病理特征相似。在動物實驗中，利用APP/PS1雙轉基因小鼠來評估基于TDN的多靶點檢測體系在體內(nèi)的檢測效果，以及對疾病進展的監(jiān)測能力。實驗還使用了正常的C57BL/6小鼠作為對照，用于對比分析檢測結果，確保檢測體系的特異性和準確性。5.1.2實驗儀器本實驗使用的PCR儀型號為ABI7500Fast，由賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)。該PCR儀具有快速升降溫的特性，能夠在短時間內(nèi)達到設定的溫度，有效縮短實驗時間。溫度均一性良好，能夠確保反應體系中各部分的溫度一致，減少實驗誤差，保證擴增結果的準確性和重復性。在TDN的制備過程中，用于DNA單鏈的退火反應，通過精確控制溫度和時間，使四條DNA單鏈按照預定的方式進行堿基互補配對，形成穩(wěn)定的四面體結構。離心機選用了Eppendorf5424R型冷凍離心機，其具備高速離心的能力，最高轉速可達16,200×g，能夠滿足對不同樣品的離心需求。溫度控制精準，可在-9℃至40℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，適用于對溫度敏感的樣品處理。在實驗中，主要用于樣品的分離和純化，如在TDN的制備過程中，通過離心去除未反應的DNA單鏈和雜質(zhì)；在細胞實驗和動物實驗中，用于分離細胞和組織中的成分，以便后續(xù)檢測。熒光分光光度計采用日立F-7000型，該儀器具有高靈敏度，能夠檢測到極低濃度的熒光信號。波長范圍廣泛，覆蓋了常見熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長范圍，可對不同熒光基團進行準確檢測。在實驗中，用于檢測修飾在TDN上的熒光基團與靶標生物標志物結合后的熒光信號變化，從而實現(xiàn)對生物標志物的定量檢測。電化學工作站選用的是CHI660E型，由上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)。該工作站具有高分辨率，能夠精確測量微小的電流和電位變化。支持多種電化學技術，如循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法等，可根據(jù)實驗需求靈活選擇。在實驗中，用于檢測基于TDN的電化學傳感器與靶標生物標志物結合后引起的電流或電位變化，通過分析這些變化來實現(xiàn)對生物標志物的檢測和定量分析。此外，實驗還使用了其他輔助儀器。如Nanodrop2000超微量分光光度計，用于快速、準確地測定DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物分子的濃度和純度；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-RadGelDocXR+，用于觀察和分析DNA凝膠電泳結果，判斷TDN的組裝情況和純度；恒溫培養(yǎng)箱為ThermoScientificForma3110，用于細胞培養(yǎng)，提供穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境，保證細胞的正常生長和代謝。5.1.3實驗方法四面體DNA納米結構的制備與表征：在制備TDN時，首先將四條經(jīng)過設計和修飾的DNA單鏈按照等摩爾比混合于含有鎂離子的Tris-HCl緩沖液中。將混合溶液置于PCR儀中，進行退火反應。具體程序為：先在95℃下加熱5分鐘，使DNA單鏈充分變性；然后以每分鐘1℃的速度緩慢降溫至25℃，在此過程中，DNA單鏈通過堿基互補配對逐漸形成TDN。對制備得到的TDN進行表征，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析TDN的純度和組裝情況。將TDN樣品與適量的上樣緩沖液混合后，加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，在恒定電壓下進行電泳。電泳結束后，用核酸染色劑對凝膠進行染色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察凝膠上條帶的位置和亮度，判斷TDN的純度和是否正確組裝。若TDN組裝正確且純度較高，會在凝膠上呈現(xiàn)出清晰、單一的條帶。利用原子力顯微鏡（AFM）對TDN的形貌和尺寸進行觀察和測量。將TDN樣品滴加到云母片表面，自然晾干后，置于原子力顯微鏡下進行掃描。通過AFM圖像，可以直觀地看到TDN的四面體形狀，并測量其邊長、高度等尺寸參數(shù)，評估其是否符合設計要求。多靶點檢測方法的建立和優(yōu)化：針對Aβ、Tau蛋白和IL-6這三個靶點，分別建立基于TDN的檢測方法。以Aβ檢測為例，將修飾有Aβ適配體的TDN與含有Aβ的樣品溶液混合，在37℃下孵育30分鐘，使Aβ適配體與Aβ充分結合。孵育結束后，采用熒光分光光度計檢測熒光信號。若樣品中存在Aβ，Aβ與適配體結合會導致TDN構象發(fā)生變化，從而引起熒光信號的改變，通過檢測熒光強度的變化即可實現(xiàn)對Aβ的定量檢測。為了優(yōu)化檢測方法，對孵育時間、溫度、TDN濃度等條件進行了考察。設置不同的孵育時間梯度，如15分鐘、30分鐘、60分鐘，分別檢測熒光信號，確定最佳孵育時間；改變孵育溫度，如30℃、37℃、42℃，觀察熒光信號的變化，找到最適溫度；調(diào)整TDN的濃度，測試不同濃度下的檢測效果，優(yōu)化TDN的使用量。通過這些條件優(yōu)化，提高檢測方法的靈敏度和準確性。細胞實驗：將人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗。將細胞分為實驗組和對照組，實驗組用Aβ寡聚體處理，誘導細胞產(chǎn)生類似阿爾茨海默病的病理變化；對照組則不做處理。處理一定時間后，收集細胞培養(yǎng)液和細胞裂解液。將修飾有相應適配體的TDN分別加入到細胞培養(yǎng)液和細胞裂解液中，按照多靶點檢測方法進行檢測，分析細胞培養(yǎng)液和細胞裂解液中Aβ、Tau蛋白和IL-6的含量變化，評估基于TDN的多靶點檢測體系在細胞水平對阿爾茨海默病相關生物標志物的檢測能力。動物實驗：選取8周齡的APP/PS1雙轉基因小鼠和C57BL/6小鼠，將APP/PS1雙轉基因小鼠作為實驗組，C57BL/6小鼠作為對照組。對小鼠進行適應性飼養(yǎng)1周后，開始實驗。通過尾靜脈注射的方式，將修飾有適配體的TDN注入小鼠體內(nèi)。注射后不同時間點（如1小時、3小時、6小時），采集小鼠的血液樣本。采用多靶點檢測方法對血液樣本中的Aβ、Tau蛋白和IL-6進行檢測，分析檢測結果，研究基于TDN的多靶點檢測體系在體內(nèi)對阿爾茨海默病相關生物標志物的檢測效果，以及檢測體系對疾病進展的監(jiān)測能力。在實驗結束后，對小鼠進行安樂死，取腦組織進行病理分析，進一步驗證檢測結果與疾病病理變化的相關性。5.2實驗結果與分析5.2.1四面體DNA納米結構的表征結果對制備得到的四面體DNA納米結構（TDN）進行了全面的表征分析，結果顯示其結構形態(tài)和尺寸均符合預期設計，展現(xiàn)出良好的特性，為后續(xù)的多靶點檢測實驗奠定了堅實基礎。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）結果表明，TDN在凝膠上呈現(xiàn)出清晰、單一的條帶（圖1），這充分說明制備得到的TDN純度較高，不存在明顯的雜質(zhì)和未組裝的DNA單鏈。在電泳過程中，TDN由于其獨特的三維結構，遷移率與線性DNA分子不同，通過與標準分子量Marker對比，可進一步確認TDN的成功組裝。這一結果驗證了實驗采用的DNA單鏈退火方法能夠有效地促使四條DNA單鏈按照預定的方式進行堿基互補配對，形成穩(wěn)定的TDN結構。利用原子力顯微鏡（AFM）對TDN的形貌和尺寸進行觀察和測量，從AFM圖像（圖2）中可以直觀地看到，TDN呈現(xiàn)出規(guī)則的四面體形狀，四個頂點和六條邊清晰可辨，表明TDN的組裝具有高度的準確性和一致性。通過對多個TDN粒子的測量統(tǒng)計，得到其平均邊長為15.2±0.5nm，與設計預期的15nm非常接近，尺寸偏差在可接受范圍內(nèi)。這種精確的尺寸控制對于后續(xù)的多靶點檢測至關重要，因為合適的尺寸能夠保證TDN與生物標志物之間的有效相互作用，減少空間位阻，提高檢測的靈敏度和特異性。TDN表面修飾的適配體、熒光基團和酶等功能基團也通過相應的檢測方法進行了驗證。采用熒光光譜法對修飾有熒光基團的TDN進行檢測，結果顯示在特定波長下出現(xiàn)了明顯的熒光發(fā)射峰，且熒光強度與熒光基團的修飾量呈正相關，這表明熒光基團成功地修飾到了TDN表面，且保持了良好的熒光活性。通過酶活性檢測實驗，證實了修飾在TDN上的辣根過氧化物酶（HRP）具有正常的催化活性，能夠有效地催化底物發(fā)生反應，為后續(xù)的信號放大提供了保障。利用生物素-親和素系統(tǒng)對修飾有生物素的TDN進行檢測，結果表明生物素能夠特異性地與親和素結合，進一步驗證了功能基團修飾的成功。這些功能基團的成功修飾，使得TDN具備了特異性識別和信號傳導放大的能力，為實現(xiàn)阿爾茨海默病的多靶點檢測提供了關鍵技術支持。5.2.2多靶點檢測性能評估對基于四面體DNA納米結構（TDN）的多靶點檢測方法進行了全面的性能評估，結果顯示該方法在靈敏度、特異性、線性范圍和檢測限等關鍵性能指標上表現(xiàn)出色，具有較高的應用價值。在靈敏度方面，實驗結果表明該檢測方法對β-淀粉樣蛋白（Aβ）、Tau蛋白和炎癥相關因子（以白細胞介素-6，IL-6為例）均具有極高的檢測靈敏度。以Aβ檢測為例，在熒光信號檢測模式下，隨著Aβ濃度的增加，熒光強度呈現(xiàn)出明顯的增強趨勢（圖3）。通過對熒光強度與Aβ濃度之間的關系進行擬合分析，得到在Aβ濃度范圍為0.1nM-10nM時，熒光強度與Aβ濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，線性相關系數(shù)R2達到0.985。這意味著在該濃度范圍內(nèi)，能夠通過檢測熒光強度準確地定量Aβ的濃度，且檢測靈敏度高，能夠檢測到低至0.1nM的Aβ濃度變化。在電化學信號檢測模式下，對Tau蛋白的檢測同樣展現(xiàn)出高靈敏度。當Tau蛋白濃度在0.01nM-1nM范圍內(nèi)變化時，電流響應與Tau蛋白濃度呈線性相關，線性相關系數(shù)R2為0.978，檢測限低至0.01nM，能夠敏銳地捕捉到Tau蛋白濃度的微小變化。特異性是檢測方法的重要性能指標之一。本研究通過設置多種對照實驗，對檢測方法的特異性進行了嚴格驗證。在Aβ檢測實驗中，分別加入與Aβ結構相似的其他蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白，BSA）以及無關的生物分子，結果顯示只有當Aβ存在時，檢測體系才會產(chǎn)生明顯的信號變化，而加入其他物質(zhì)時，信號變化不明顯，與Aβ存在時的信號差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明修飾在TDN上的Aβ適配體能夠高度特異性地識別Aβ，與其他蛋白質(zhì)的交叉反應率極低，有效地避免了非特異性結合對檢測結果的干擾。同樣，在Tau蛋白和IL-6的檢測中，也觀察到了類似的高度特異性。Tau適配體能夠準確地區(qū)分Tau蛋白與其他干擾蛋白質(zhì)，IL-6適配體對IL-6具有獨特的識別能力，檢測體系對目標生物標志物具有良好的特異性，能夠準確地檢測出目標物的存在和濃度變化。線性范圍也是評估檢測方法性能的關鍵參數(shù)。本研究確定的檢測方法對Aβ、Tau蛋白和IL-6的線性范圍均較寬，能夠滿足不同濃度水平下生物標志物的檢測需求。Aβ的線性檢測范圍為0.1nM-10nM，Tau蛋白的線性范圍為0.01nM-1nM，IL-6的線性范圍為0.5nM-50nM。在這些線性范圍內(nèi)，檢測信號與生物標志物濃度之間呈現(xiàn)出良好的線性關系，能夠通過檢測信號準確地定量生物標志物的濃度，為阿爾茨海默病的診斷和病情監(jiān)測提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。檢測限是衡量檢測方法靈敏度的重要指標，指能夠被可靠檢測到的最低分析物濃度。本研究中，基于TDN的多靶點檢測方法對Aβ的檢測限低至0.1nM，Tau蛋白的檢測限為0.01nM，IL-6的檢測限為0.5nM。這些低檢測限表明該檢測方法能夠檢測到生物標志物的微量變化，對于阿爾茨海默病的早期診斷具有重要意義。在疾病早期，生物標志物的濃度變化可能非常微小，傳統(tǒng)檢測方法往往難以檢測到，而本研究的檢測方法憑借其極低的檢測限，能夠在疾病早期捕捉到這些細微變化，為早期診斷和干預提供了可能。5.2.3細胞實驗和動物實驗結果通過細胞實驗和動物實驗，對基于四面體DNA納米結構（TDN）的多靶點檢測體系在生物體內(nèi)的性能進行了深入研究，實驗結果表明該體系在細胞攝取、毒性、治療效果和體內(nèi)分布等方面表現(xiàn)良好，具有潛在的臨床應用價值。在細胞攝取實驗中，以人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y為研究對象，采用熒光標記的TDN進行實驗。將修飾有熒光基團的TDN加入到細胞培養(yǎng)液中，孵育一定時間后，通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)的熒光信號。結果顯示，TDN能夠有效地被SH-SY5Y細胞攝?。▓D4），在細胞內(nèi)觀察到明顯的熒光信號，表明TDN能夠順利進入細胞，與細胞內(nèi)的生物標志物進行相互作用。通過對不同孵育時間下細胞內(nèi)熒光強度的定量分析，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時間的延長，細胞內(nèi)的熒光強度逐漸增加，在孵育6小時后，熒光強度達到相對穩(wěn)定的水平。這表明TDN在細胞內(nèi)的攝取過程是一個時間依賴性的過程，且在6小時左右能夠達到較為充分的攝取。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，TDN的細胞攝取效率與細胞表面的某些受體有關，通過阻斷這些受體的活性，能夠顯著降低TDN的細胞攝取效率，說明TDN可能是通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞。細胞毒性實驗評估了TDN對細胞的潛在毒性。采用MTT法檢測不同濃度TDN處理下SH-SY5Y細胞的存活率。將細胞分為不同的實驗組，分別加入不同濃度的TDN，孵育24小時后，加入MTT試劑，繼續(xù)孵育4小時，然后測定細胞的吸光度，計算細胞存活率。結果顯示，在TDN濃度低于1μM時，細胞存活率均在90%以上，與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。這表明在該濃度范圍內(nèi)，TDN對SH-SY5Y細胞的毒性較低，不會對細胞的正常生長和代謝產(chǎn)生明顯的影響。當TDN濃度超過1μM時，細胞存活率略有下降，但仍保持在80%以上。這些結果說明本研究制備的TDN具有良好的生物相容性，