I摘要【目的】當(dāng)前肉制品中喹乙醇代謝物檢測(cè),樣品前處理過(guò)程步驟繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)。欲結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，開(kāi)發(fā)一套既迅速高效,同時(shí)具備高靈敏度與精準(zhǔn)度,并且重現(xiàn)性佳的分析檢測(cè)方法,以有效支持實(shí)驗(yàn)室規(guī)模化檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織內(nèi)的喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）含量,保證其檢測(cè)結(jié)果的可信賴(lài)性?！痉椒ā繉⒉徊捎霉滔噍腿≈鶎?duì)樣品進(jìn)行凈化，從前處理過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)樣本快速高效的前處理?！窘Y(jié)果】通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制變量的平行實(shí)驗(yàn)，從回收情況來(lái)看,牛肉樣品在未經(jīng)鹽酸酸解條件下MQCA的回收率恒為零,0.2mol/L的鹽酸作為較理想的酸化介質(zhì)，回收率較為穩(wěn)定，能夠有效分離牛肉組織中的MQCA。因此，0.2mol/L鹽酸成為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的首選試劑;設(shè)置的三組溫度條件對(duì)MQCA的提取無(wú)明顯影響，回收率良好,綜合考慮選擇酸化溫度為20℃;設(shè)置的五組酸解時(shí)間,低于或高于30min的組份回收率不穩(wěn)定,會(huì)出現(xiàn)偏高或偏低的情況,選擇酸解時(shí)間為30min,回收率較為穩(wěn)定;四組提取試劑的回收率都較為穩(wěn)定,綜合考慮選擇乙酸乙酯為提取劑。最后通過(guò)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)試，證實(shí)了方法優(yōu)化的實(shí)用性?！窘Y(jié)論】本論文通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件得出實(shí)驗(yàn)條件為:酸解試劑為0.2mol/L鹽酸溶液,20℃下酸解30min,提取試劑為乙酸乙酯。經(jīng)回收率及精密度實(shí)驗(yàn),此方法優(yōu)化可大幅度節(jié)省樣品前處理時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)提供方法依據(jù)。關(guān)鍵詞：喹乙醇代謝物;MQCA;方法優(yōu)化;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;ABSTRACT【Purpose】Thecurrentdetectionofquinolineethanolmetabolitesinmeatproductsinvolvesacumbersomeandtime-consumingsamplepre-treatmentprocess.Weaimtodeveloparapid,efficient,highlysensitive,andreproducibleanalyticalmethodthatcombinesliquidchromatographytandemmassspectrometrydetectiontechnologytoeffectivelysupportthelarge-scaledetectionofthemetabolite3-methylquinoline-2-carboxylicacid(MQCA)inanimalmuscletissueinthelaboratory,ensuringthereliabilityofthedetectionresults.【Methods】Thesamplewillnotbepurifiedusingasolid-phaseextractioncolumn.Theexperimentalconditionsduringthepre-treatmentprocesswillbeoptimized,andliquidchromatographytandemmassspectrometrydetectiontechnologywillbecombinedtoachievefastandefficientpre-treatmentofthesample.【Results】Bychangingtheexperimentalconditionsandconductingaparallelexperimenttocontrolvariables,therecoveryrateofMQCAinbeefsamplesremainedconstantatzerowithouthydrochloricacidhydrolysis.0.2mol/Lhydrochloricacidwasusedasanidealacidificationmedium,andtherecoveryratewasrelativelystable,whichcouldeffectivelyseparateMQCAinbeeftissue.Therefore,0.2mol/Lhydrochloricacidbecamethepreferredreagentforexperimentaloptimization;ThethreesetsoftemperatureconditionssethavenosignificantimpactontheextractionofMQCA,andtherecoveryrateisgood.Consideringallfactors,theacidificationtemperatureisselectedas20℃;Thefivesetsofacidhydrolysistimeareset,andtherecoveryrateofcomponentsbeloworabove30minutesisunstable,leadingtohighorlowsituations.Choosinganacidhydrolysistimeof30minuteswillresultinamorestablerecoveryrate;Therecoveryratesofthefoursetsofextractionreagentsarerelativelystable,andconsideringallfactors,ethylacetateischosenastheextractionagent.Finally,thepracticalityofthemethodoptimizationwasconfirmedthroughexperimentaltestingofrecoveryrateandprecision.【Conclusion】Throughoptimizingthepre-treatmentconditions,thispaperconcludesthattheexperimentalconditionsare:theacidhydrolysisreagentis0.2mol/Lhydrochloricacidsolution,acidhydrolysisat20℃for30minutes,andtheextractionreagentisethylacetate.Throughexperimentsonrecoveryrateandprecision,thismethodoptimizationcansignificantlysavesamplepretreatmenttimeandprovideamethodbasisforbatchtestinginthelaboratory.KEYWORDS:Quineethanolmetabolites;MQCA;methodoptimization;liquidchromatography-tandemmassspectrometry;

1前言喹噁啉類(lèi)藥物是一種化學(xué)合成類(lèi)的抗菌促生長(zhǎng)劑，主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹烯酮等[1]。喹噁啉類(lèi)化合物在動(dòng)物機(jī)體中可激發(fā)蛋白質(zhì)同化，提升了飼料轉(zhuǎn)化效率，促使更多的氮質(zhì)在體內(nèi)積累，表現(xiàn)出增進(jìn)生長(zhǎng)與促進(jìn)瘦肉產(chǎn)量的效果。因此，在畜牧業(yè)者中，它被看作是一種頗為理想的飼料增效劑，并已被廣泛應(yīng)用于家禽和家畜的飼養(yǎng)中?？珊罄m(xù)實(shí)驗(yàn)表明,喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)積累達(dá)到特定水平后可能對(duì)人體產(chǎn)生傷害,若食用會(huì)有致畸致癌致突變的“三致”作用[2]。由于的毒副作用較強(qiáng),喹乙醇被美國(guó)和歐盟都禁止用作飼料添加劑。2018年1月11號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2638號(hào)通告，宣布終止在食用動(dòng)物中應(yīng)用喹乙醇、氨苯胂酸以及洛克沙胂等三類(lèi)獸用藥品。[3]。喹乙醇化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,能在生物體中生成近10多種代謝物,其中3-甲基喹啉-2-羧酸（3-methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid，MQCA，CAS：74003-63-7）為最主要的一種，因在動(dòng)物體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，成為檢測(cè)的主要代謝物[4],也被國(guó)際食品法典委員會(huì)選為官方認(rèn)可的標(biāo)記性殘留物[5]。因此，在檢測(cè)過(guò)程中，主要把它視作殘留物分析及監(jiān)控的關(guān)鍵對(duì)象。如今有關(guān)MQCA的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法[11-12]、熒光微球免疫層析法、電化學(xué)檢測(cè)法、免疫膠體金法等,在這些方法當(dāng)中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其快速的分析效率、優(yōu)良的分離能力和高靈敏度等特點(diǎn)被廣泛采用。故本研究將使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。目前中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20746-2006《牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中具體包括以下步驟[13]：圖1GB/T20746-2006中前處理流程圖本論文將采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,通過(guò)優(yōu)化前處理流程,大幅度節(jié)省樣品前處理時(shí)間,為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的殘留量提供可靠的方法依據(jù)。1.1課題背景“民以食為天，食以安為先”，食物是人們得以生存的重要物質(zhì)基礎(chǔ),與人們的消費(fèi)和生活分不開(kāi),也與我國(guó)的民生密切相關(guān)。近年來(lái)，我國(guó)食品安全狀況總體在向好的方向發(fā)展，但問(wèn)題仍然突出。近日，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布《食品安全狀況報(bào)告（2016）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《報(bào)告》），從食品質(zhì)量、生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)、消費(fèi)安全等方面全面呈現(xiàn)我國(guó)食品安全狀況。《報(bào)告》顯示，2016年我國(guó)食品質(zhì)量總體保持穩(wěn)定，但仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)隱患。抽檢發(fā)現(xiàn)不合格食品以農(nóng)產(chǎn)品為主，種類(lèi)繁雜；從檢驗(yàn)項(xiàng)目看，主要是農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等項(xiàng)目不合格。我國(guó)食品安全形勢(shì)盡管總體發(fā)展明朗，但仍久潛伏著一定安全隱患，食用農(nóng)產(chǎn)品（含水產(chǎn)品）中農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等問(wèn)題依然存在，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全形勢(shì)仍不容樂(lè)觀。若要確保食品的品質(zhì)，不但要設(shè)立嚴(yán)格詳盡的管理規(guī)程并對(duì)生產(chǎn)者和作業(yè)員進(jìn)行專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，同時(shí)還要求食品監(jiān)督機(jī)構(gòu)加強(qiáng)對(duì)食品質(zhì)量的檢驗(yàn)和檢測(cè)工作。運(yùn)用尖端的檢測(cè)設(shè)備及檢驗(yàn)人員的專(zhuān)業(yè)技能，確保測(cè)試成果的準(zhǔn)確性。對(duì)于未達(dá)標(biāo)的食品，質(zhì)量部門(mén)應(yīng)嚴(yán)格把控，不可進(jìn)行生產(chǎn)及銷(xiāo)售，保障食品安全。根據(jù)人們密切關(guān)注的食品安全問(wèn)題，本論文針對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品中的獸藥殘留進(jìn)行展開(kāi)，檢測(cè)牛肉中喹乙醇代謝物的殘留情況，保障食品安全。1.2研究進(jìn)展與理論原理1.2.1研究進(jìn)展2013年發(fā)表于《中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)》雜志的研究中，開(kāi)發(fā)了一種基于堿性條件水解和高效液相色譜技術(shù)的草魚(yú)體內(nèi)喹乙醇代謝產(chǎn)物MQCA檢測(cè)方法。利用堿性水溶液對(duì)草魚(yú)組織進(jìn)行水解，以獲得喹乙醇的代謝物MQCA，并通過(guò)負(fù)離子模式的固相萃取柱對(duì)其進(jìn)行純化處理，最終應(yīng)用高效液相層析技術(shù)對(duì)之進(jìn)行定量分析。該方法在其添加范圍內(nèi)，回收效率平均達(dá)到80.5%至86.5%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差普遍不超過(guò)6%。該方法靈敏度高、精密度好，能夠?qū)Σ蒴~(yú)樣本中的喹乙醇代謝物進(jìn)行量化分析以及常規(guī)監(jiān)測(cè)。[14]。但通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行凈化，需經(jīng)過(guò)活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，檢測(cè)樣品量大時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)。2020年發(fā)表于食品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)報(bào)告中，研究者們開(kāi)發(fā)了一種基于QuEChERS配合超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，用于測(cè)量動(dòng)物肌肉樣本中的喹乙醇和其卡巴氧代謝產(chǎn)物含量的新方法。結(jié)果證明該方法在1～400ng/mI濃度范圍內(nèi)線性良好。2種代謝物在其添加水平范圍內(nèi)，回收率在88.9%到109.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值在2.18%到8.57%。此方法操作迅速、反應(yīng)靈敏，具有較高的精確性，適用于迅速檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織內(nèi)的喹乙醇與卡巴氧代謝產(chǎn)物[[15]。1.2.2理論原理本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)采用乙酸乙酯提取肌肉組織中的喹乙醇代謝物，之后經(jīng)氮吹儀進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，通過(guò)正己烷實(shí)現(xiàn)除脂過(guò)程,用定容液定容后過(guò)0.22μm孔徑有機(jī)濾膜進(jìn)行過(guò)濾后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，利用內(nèi)標(biāo)法以準(zhǔn)確定量分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)操作中通過(guò)控制變量法，改變實(shí)驗(yàn)條件，如改變酸解試劑、酸解溫度、酸解時(shí)間、提取試劑、對(duì)目標(biāo)物的回收率影響，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本、實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)安全和實(shí)驗(yàn)回收，選出最優(yōu)的前處理?xiàng)l件。其次，采用牛肉空白樣品作為基質(zhì)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，添加水平分別為0.5、1.0和5.0μg/kg,每個(gè)水平平行4次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。操作流程:精確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)充分混合均質(zhì)好的空白牛肉樣本5g(精確至0.01g)置于50毫升離心管中，加100ng/mL喹乙醇代謝物工作液內(nèi)標(biāo)125μL，加100ng/mL喹乙醇代謝物工作液外標(biāo)125μL，隨后加入8mL1mol/LHCl溶液，利用振蕩器渦旋振蕩1min，將離心管在20℃條件下靜置30分鐘，加入10mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1min。加入3g無(wú)水MgSO4，0.5gNaCl，渦旋振蕩1min，8500r/min離心5min，移取離心管中上清液在氮吹儀內(nèi)40℃下氮吹至近干。用1mL10%ACN進(jìn)行定容，使用3mL正己烷行脫脂處理，0.22μm孔徑有機(jī)濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)原料及主要試劑表1實(shí)驗(yàn)原料及主要試劑序號(hào)藥品名稱(chēng)純度生產(chǎn)廠家1鹽酸GR廣州化學(xué)試劑2乙酸銨LC-MS級(jí)上海安譜2乙酸銨GR科密歐3乙腈HPLC默克4乙腈HPLCCNW5乙酸乙酯HPLC天津科密歐化學(xué)試劑有限公司6正己烷HPLCCNW7無(wú)水硫酸鎂AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司8氯化鈉AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司9甲酸LCMSCNW103-甲基喹惡啉-2-羧酸（MQCA）99.1%安譜璀世11喹惡啉-2-羧酸-D4100mg/L安譜璀世2.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)喹乙醇代謝物(MQCA)進(jìn)行測(cè)定，使用的主要儀器見(jiàn)表2：表2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備序號(hào)設(shè)備名稱(chēng)型號(hào)/規(guī)格生產(chǎn)廠家1十萬(wàn)分之一分析天平MS105DU梅特勒2千分之一分析天平PX223ZH/E奧豪斯儀器（常州）有限公司3分散型固相萃取振蕩器X0500150B太瑋科技4瓶口分液器2.5-25mLBRAND5移液槍100-1000μLBRAND6移液槍20-200μLBRAND7移液槍1-10mLBRAND8氮吹儀TTL-DCⅡ北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司9離心機(jī)3K15SIGMA10三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀TRIPLEQUAD4500ABSCIEX2.3液相色譜儀器條件色譜柱:C18柱，粒徑1.6μm流動(dòng)相A:5mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)B:甲酸乙腈(含0.1%甲酸)流速:0.3mL/min駐留時(shí)間:5min進(jìn)樣量:2μL表3梯度洗脫程序時(shí)間(min)Time流速(mL/min)Flowrate流動(dòng)相A(%)MobilephaseA流動(dòng)相B(%)MobilephaseB0.000.380201.200.380202.500.310903.500.310904.000.380202.4質(zhì)譜系統(tǒng)儀器條件離子源:電噴霧離子源(ESI) 掃描方式:電噴霧離子化條件下正離子檢測(cè)檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子源溫度:450℃離子源噴霧氣(Gas1):50psi輔助加熱氣(Gas2):50psi氣簾氣：40psi表4MQCA及其內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)化合物名稱(chēng)母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞電壓/(V)去簇電壓/(V)MQCA18914324381891452238MQCA-D4179133283517913523502.5樣品采集與保存由公司承接博羅縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局的委托抽檢單，隨機(jī)抽取牛肉2kg,將牛肌肉組織攪碎均質(zhì)，置于清潔樣品容器中，于-18℃以下保存。2.6樣品前處理過(guò)程精確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)充分混合均質(zhì)好的空白牛肉樣本5g(精確至0.01g)置于50毫升離心管中，加100ng/mL喹乙醇代謝物工作液內(nèi)標(biāo)125μL，加100ng/mL喹乙醇代謝物工作液外標(biāo)125μL，隨后加入8mL1mol/LHCl溶液，利用振蕩器渦旋振蕩1min，將離心管在20℃條件下靜置30分鐘，加入10mL乙酸乙酯，渦旋振蕩1min。加入3g無(wú)水MgSO4，0.5gNaCl，渦旋振蕩1min，8500r/min離心5min，移取離心管中上清液在氮吹儀內(nèi)40℃下氮吹至近干。用1mL10%ACN進(jìn)行定容，使用3mL正己烷行脫脂處理，0.22μm孔徑有機(jī)濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。3實(shí)驗(yàn)優(yōu)化與結(jié)果3.1實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化3.1.1樣品的酸解試劑條件優(yōu)化對(duì)牛肉空白樣品進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，并以不同實(shí)驗(yàn)組的回收率高低作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)置四組酸解條件，分別為1mol/L鹽酸溶液、0.2mol/L鹽酸溶液、0.2mol/L乙酸銨溶液和不經(jīng)鹽酸水解,每組平行做四次，其余步驟與2.6相同。通過(guò)對(duì)比各組數(shù)據(jù)，明顯發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有進(jìn)行鹽酸處理的牛肉樣本里，MQCA的回收率s恒為零，而在經(jīng)鹽酸處理后，牛肉中MQCA的回收率s介于86.1%至100.7%。說(shuō)明經(jīng)鹽酸處理可有效釋放出牛肉樣品中的MQCA，有利于后續(xù)儀器檢測(cè)。綜合考慮試劑成本、安全因素，選擇0.2mol/L鹽酸溶液進(jìn)行酸化，可達(dá)到比較理想的結(jié)果。酸解試劑回收率(縱坐標(biāo)表示回收率,橫坐標(biāo)表示組次)0.2mol/L乙酸銨、不經(jīng)鹽酸水解0.2mol/LHCL1mol/LHCL0.2mol/L乙酸銨、不經(jīng)鹽酸水解0.2mol/LHCL1mol/LHCL樣本條件12341molHCl97.7%91.9%93.5%97.6%0.2mol/LHCl98.4%100.5%100.7%86.1%0.2mol乙酸銨0000不經(jīng)鹽酸水解00003.1.2樣品的酸解溫度條件優(yōu)化對(duì)牛肉空白樣品進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，并以不同實(shí)驗(yàn)組的回收率高低作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)置三組酸解溫度條件，分別20℃、40℃、60℃。在各溫度下酸化30min，每組平行做四次，其余步驟與2.6相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三組溫度條件對(duì)MQCA的提取無(wú)明顯影響，回收率范圍在85.4%~93.6%之間，回收率良好。因此選擇酸化溫度為20℃，可達(dá)到比較理想的結(jié)果。酸解溫度回收率(縱坐標(biāo)表示回收率,橫坐標(biāo)表示組次)60℃40℃20℃60℃40℃20℃樣本條件123420℃92.4%91.9%93.2%91.6%40℃90.0%91.8%93.6%91.9%60℃92.7%90.7%85.4%87%3.1.3樣品的酸解時(shí)間條件優(yōu)化對(duì)牛肉空白樣品進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，并以不同實(shí)驗(yàn)組的回收率高低作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)置五組酸解時(shí)間條件，分別為酸化1min，酸化10min，酸化30min，酸化60min，酸化120min，每組平行做四次，其余步驟與2.6相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的酸解五組實(shí)驗(yàn)回收率都偏高，酸解時(shí)間為30min時(shí)回收率趨于穩(wěn)定，回收率范圍在97.1%~112.1%之間。酸解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短其回收率均過(guò)高，回收率范圍在97.8%~118.6%之間。為有較理想的結(jié)果,因此選擇酸化時(shí)間在30min。酸解時(shí)間回收率(縱坐標(biāo)表示組次,橫坐標(biāo)表示回收率)樣本條件12341min113.9%101.1%115.4%117.8%10min103.7%113.3%106.6%111.3%30min100.2%97.1%112.1%107.8%60min115.8%97.8%118.5%108%120min118.6%110%114.8%115.8%3.1.4樣品的提取試劑優(yōu)化對(duì)牛肉空白樣品進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，并以不同實(shí)驗(yàn)組的回收率高低作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)置四組提取試劑，分別為10mL乙腈提取，10mL乙酸乙酯提取，10mL乙酸乙酯-乙腈(1:1)提取，10mL乙酸乙酯-乙腈(2:1)提取，每組平行做四次，其余步驟與2.6相同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四組提取試劑的回收率都較為理想，回收率范圍在89.2%~117.1%之間。其中乙酸乙酯相比于乙腈毒性較低，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體傷害較小，且乙酸乙酯的揮發(fā)速度較快，在氮?dú)鉂饪s的步驟中能大幅縮短處理時(shí)間，并在處理大量樣本時(shí)可顯著增強(qiáng)前處理過(guò)程的效率，因此選定乙酸乙酯為提取試劑。提取試劑回收率(縱坐標(biāo)表示回收率,橫坐標(biāo)表示組次)樣本條件1234乙腈95.8%96.7%96.4%89.2%乙酸乙酯97.8%104.3%117.1%108.2%乙腈：乙酸乙酯（1：1）96.5%93.0%92.7%98.9%乙腈：乙酸乙酯（1：2）98.7%105.2%88.9%91.7%3.2方法的線性范圍及檢出限設(shè)定并配制2、5、10、20、50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中12.5ng/mL為內(nèi)標(biāo)濃度。通過(guò)觀察記錄各濃度下的峰值面積，MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液在2～50ng/mL范圍線性良好，其線性回歸系數(shù)r2=0.99822。該方法MQCA的檢出限為0.5μg/kg。3.3回收率及精密度實(shí)驗(yàn)選用牛肉空白樣品作為基質(zhì)來(lái)測(cè)試方法的準(zhǔn)確度和精密度。將其添加到0.5、1.0以及5.0μg/kg的不同水平，并且在這四種不同的水平上重復(fù)4次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。具體的平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差請(qǐng)參閱以下的表格。按照GB/T20746-2006的規(guī)定，優(yōu)化后的檢測(cè)方法符合其中對(duì)精密度的要求?；衔锩Q(chēng)添加水平:0.5μg/kg添加水平:1.0μg/kg添加水平:5.0μg/kg平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%平均回收率%RSD%MQCA1018.3889.82.8787.63.103.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)上述以改變實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制變量的平行實(shí)驗(yàn)，得出檢測(cè)牛肉中喹乙醇代謝物檢測(cè)流程中對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化是必要的，通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制變量的平行實(shí)驗(yàn)，從回收情況來(lái)看,牛肉樣品在未經(jīng)鹽酸酸解條件下MQCA的回收率恒為零,0.2mol/L的鹽酸作為較理想的酸化介質(zhì)，回收率較為穩(wěn)定，能夠有效分離牛肉組織中的MQCA。因此，0.2mol/L鹽酸成為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的首選試劑;設(shè)置的三組溫度條件對(duì)MQCA的提取無(wú)明顯影響，回收率良好,綜合考慮選擇酸化溫度為20℃;設(shè)置的五組酸解時(shí)間,低于或高于30min的組份回收率不穩(wěn)定,會(huì)出現(xiàn)偏高或偏低的情況,選擇酸解時(shí)間為30min,回收率較為穩(wěn)定;四組提取試劑的回收率都較為穩(wěn)定,綜合考慮選擇乙酸乙酯為提取劑。最后通過(guò)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)試，證實(shí)了方法優(yōu)化的實(shí)用性。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)論與展望4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)論本論文通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件得出實(shí)驗(yàn)條件為:酸解試劑為0.2mol/L鹽酸溶液,20℃下酸解30min,提取試劑為乙酸乙酯。經(jīng)回收率及精密度實(shí)驗(yàn),此優(yōu)化可大幅度節(jié)省樣品前處理時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)提供方法依據(jù)。此方法優(yōu)化對(duì)于目前喹乙醇代謝物的檢測(cè)工作有著一定的優(yōu)勢(shì)，相比食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20746-2006，牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代謝物殘留量的測(cè)定這一方法，本方法減少了樣品通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行凈化這一步驟，大幅減少前處理過(guò)程的時(shí)間，為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)提供便利。按照以上條件對(duì)實(shí)驗(yàn)精密度回收率進(jìn)行檢測(cè)得出，檢測(cè)牛肉中喹乙醇代謝物不經(jīng)固相萃取柱凈化這一方法是具有可行性的，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)技術(shù)，可大幅度節(jié)省前處理時(shí)間，開(kāi)發(fā)一種快速高效靈敏度準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的殘留量提供方法依據(jù),為肉制品中喹乙醇代謝物實(shí)際檢測(cè)工作提供便利。4.2研究展望本研究旨在結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀技術(shù)開(kāi)發(fā)一種快速、高效的檢測(cè)牛肉中喹乙醇代謝物的檢測(cè)方法，利用得出的結(jié)論為實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)志物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的殘留量提供方法依據(jù)。通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的研究與探索,該方法再進(jìn)一步優(yōu)化后運(yùn)用于實(shí)際檢測(cè)中有一定前景。在譜圖分析結(jié)果中,目標(biāo)峰周?chē)谐霈F(xiàn)雜峰,會(huì)對(duì)結(jié)果分析造成一定困擾,有可能積錯(cuò)目標(biāo)峰而導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程中的定性定量困難;此外在此方法優(yōu)化過(guò)程中,平行實(shí)驗(yàn)的組數(shù)只進(jìn)行了4組,樣品數(shù)量不足,若要使實(shí)驗(yàn)結(jié)論更可信,后續(xù)研究需增加樣品數(shù)量,增加平時(shí)實(shí)驗(yàn)的組數(shù),減小因個(gè)別樣品所帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。今后的研究方向應(yīng)針對(duì)以上兩處進(jìn)行改進(jìn),讓樣品凈化更加完全,減少譜圖雜峰;適當(dāng)增加樣品量進(jìn)行平行試驗(yàn),增大實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度,減少單一樣品帶來(lái)的誤差。附錄酸解試劑譜圖(3-JiaJKEL-2-SS-1表示MQCA外標(biāo)，D4為MQCA內(nèi)標(biāo)下同)圖20.2mol/LHCl酸解質(zhì)譜圖如下IDXAnalyteNameTraceISAreaRT(min)IonRatioAreaAccuracy(%)ActConc.C.Conc.(ng/mL)2-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.07.74e31.660.4491.41e498.412.5012.2992D4-1179.0/133.0--1.617.74e3--1.00--2-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.24e41.640.5682.31e4100.512.5012.5568D4-1179.0/133.0--1.601.24e4--1.00--2-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.09.13e31.650.4611.70e4100.712.5012.5846D4-1179.0/133.0--1.609.13e3--1.00--2-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.07.76e31.650.4651.23e486.112.5010.7666D4-1179.0/133.0--1.607.76e3--1.00--2-13-JiaJKEL-2-SS-12-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.41e42-1D4-1179.0/133.07.74e32-23-JiaJKEL-2-SS-12-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.02.31e42-2D4-1179.0/133.01.24e42-33-JiaJKEL-2-SS-12-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.70e42-3D4-1179.0/133.09.13e32-43-JiaJKEL-2-SS-12-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.23e42-4D4-1179.0/133.07.76e3圖320℃下酸解質(zhì)譜圖如下IDXAnalyteNameTraceISAreaRT(min)IonRatioAreaAccuracy(%)ActConc.C.Conc.(ng/mL)A-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.06.79e31.650.3451.14e492.412.5011.5534D4-1179.0/133.0--1.616.79e3--1.00--A-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.07.68e31.640.3561.28e491.912.5011.4820D4-1179.0/133.0--1.607.68e3--1.00--A-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.08.77e31.640.3641.48e493.212.5011.6464D4-1179.0/133.0--1.608.77e3--1.00--A-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.09.97e31.650.3861.65e491.612.5011.4481D4-1179.0/133.0--1.609.97e3--1.00--A-13-JiaJKEL-2-SS-1A-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.14e4A-1D4-1179.0/133.06.79e3A-23-JiaJKEL-2-SS-1A-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.28e4A-2D4-1179.0/133.07.68e3A-33-JiaJKEL-2-SS-1A-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.48e4A-3D4-1179.0/133.08.77e3A-43-JiaJKEL-2-SS-1A-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.65e4A-4D4-1179.0/133.09.97e3圖4酸解時(shí)間為30min質(zhì)譜圖如下IDXAnalyteNameTraceISAreaRT(min)IonRatioAreaAccuracy(%)ActConc.C.Conc.(ng/mL)30m-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.09e41.630.4001.86e4100.212.5012.5262D4-1179.0/133.0--1.591.09e4--1.00--30m-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.06e41.610.3921.75e497.112.5012.1360D4-1179.0/133.0--1.571.06e4--1.00--30m-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.23e41.630.4622.34e4112.112.5014.0157D4-1179.0/133.0--1.591.23e4--1.00--30m-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.09.70e31.620.3611.78e4107.812.5013.4741D4-1179.0/133.0--1.589.70e3--1.00--30M-13-JiaJKEL-2-SS-130M-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.86e430M-1D4-1179.0/133.01.09e430M-23-JiaJKEL-2-SS-130M-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.75e430M-2D4-1179.0/133.01.06e430M-33-JiaJKEL-2-SS-130M-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.02.34e430M-3D4-1179.0/133.01.23e430M-43-JiaJKEL-2-SS-130M-43-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.78e430M-4D4-1179.0/133.09.70e3圖5提取試劑為乙酸乙酯一組酯質(zhì)譜圖如下IDXAnalyteNameTraceISAreaRT(min)IonRatioAreaAccuracy(%)ActConc.C.Conc.(ng/mL)E-13-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.13e41.610.3662.08e497.812.5012.2290D4-1179.0/133.0--1.571.13e4--1.00--E-23-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.99e41.620.4673.90e4104.312.5013.0361D4-1179.0/133.0--1.581.99e4--1.00--E-33-JiaJKEL-2-SS-1189.0/143.01.75e41.630.3713.88e4117.112.50