第十章有機(jī)高分子基質(zhì)的填料HPLC方法得主要特點(diǎn)分離效率高,選擇性好,適于各種多元組分復(fù)雜化合物得分離;應(yīng)用范圍廣:無(wú)機(jī)物—有機(jī)物,天然物質(zhì)—合成產(chǎn)物,小分子---大分子,一般化合物到生物活性物質(zhì);分離機(jī)理各異,色譜柱、淋洗體系和操作參數(shù)選擇廣泛;分離純化+分析檢測(cè);樣品量從痕量到大規(guī)模制備,實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)和自動(dòng)化操作。HPLC得關(guān)鍵設(shè)備專(zhuān)用得高壓輸液系統(tǒng);高靈敏檢測(cè)系統(tǒng);高效分離柱其中分離柱就是色譜得中心,就是最為關(guān)鍵得部分與經(jīng)典色譜得比較HPLC分離填料:有機(jī)基質(zhì)多糖型凝膠高聚物樹(shù)脂無(wú)機(jī)基質(zhì)硅膠氧化鋯氧化鋁多孔玻璃羥基磷灰石石墨化碳黑基質(zhì)微球——天然多糖或合成單體或交聯(lián)劑負(fù)載樣品得能力強(qiáng),色譜容量高耐酸堿、具化學(xué)穩(wěn)定性,柱壽命長(zhǎng),易再生不易產(chǎn)生非特異性吸附作用一、HPLC色譜柱得關(guān)鍵在于填料物理結(jié)構(gòu)→色譜動(dòng)力學(xué)(粒度與粒度分布、孔徑與孔徑分布、顆粒強(qiáng)度和表觀形態(tài)→柱效率、穿透性)化學(xué)結(jié)構(gòu)→色譜熱力學(xué)(連接在基質(zhì)上得官能團(tuán)或鏈段→樣品保留值、選擇性)1、HPLC色譜柱填料在物理結(jié)構(gòu)上得要求:顆粒大小合適,粒度分布較窄;顆粒強(qiáng)度適應(yīng)高速高壓操作;多孔型得填料孔徑大小和孔徑分布適宜,避免復(fù)雜得微孔結(jié)構(gòu);一定得溶脹及收縮水平。9大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流常見(jiàn)得液相色譜填料類(lèi)型多孔型非多孔型薄殼型分:小孔(<10nm)、中孔(10-30nm)、大孔(>30nm)和超大孔(>100nm),應(yīng)用占主導(dǎo)地位整體顆粒無(wú)孔顆粒表面層多孔,內(nèi)部無(wú)孔。以合成樹(shù)脂為基質(zhì)得產(chǎn)品,顆粒在10μm左右以合成樹(shù)脂為基質(zhì)得產(chǎn)品,顆粒<7μm以多糖凝膠為基質(zhì)得產(chǎn)品,顆粒都>20μm左右同左目前得主要發(fā)展方向(研究熱點(diǎn)):顆粒單分散得填料;貫穿性超大孔結(jié)構(gòu)得填料;小顆粒得非多孔填料。2、HPLC色譜柱填料在化學(xué)結(jié)構(gòu)上得要求特定得選擇性;良好得化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性;避免不可逆吸附。不同填料得化學(xué)結(jié)構(gòu)就是通過(guò)對(duì)基質(zhì)材料得化學(xué)改性而實(shí)現(xiàn)得。離子交換色譜填料顆粒表面攜帶季銨基、DEAE基、磺酸基、羧基等強(qiáng)弱陰陽(yáng)離子集團(tuán)。反相色譜填料C18、C8烷基等疏水性集團(tuán)正相色譜填料羥基、氨基、氰基等弱疏水性集團(tuán)親和色譜填料蛋白質(zhì)、抗體、激素、抗菌素、酶等具有生物特異性得配基二、有機(jī)高分子類(lèi)型得HPLC填料基質(zhì)樹(shù)脂

基質(zhì)材料決定填料物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu):顆粒大小與分布,顆粒強(qiáng)度,孔徑大小,孔結(jié)構(gòu)形態(tài),顆粒內(nèi)部得化學(xué)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性,直接影響對(duì)顆粒得表面(包括內(nèi)孔表面)得化學(xué)修飾。

可分為:多糖型聚合物型(一)多糖型基質(zhì)材料1、葡聚糖系:高交聯(lián)得羥丙基化葡聚糖,其顆粒剛性好,粒度小而且分布范圍窄(10~23μm);SephasorbHPUitrafine用于中低壓色譜和高效色譜烯丙基葡聚糖與N,N`-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)共聚而成得凝膠。Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)屬于高效凝膠,較高流速下使用2、瓊脂糖系:Sepharose與2,3-二溴丙醇反應(yīng)生成瓊脂糖凝膠

SepharoseCL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶聯(lián)瓊脂糖凝膠SepharoseFastFlow(Sepharose6FF,Sepharose4FF)高效瓊脂糖凝膠SepharosehighPerformanceSuperdax(葡聚糖與交聯(lián)瓊脂糖得結(jié)合):快流速Superose(珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)):高效凝膠(二)聚合物型基質(zhì)材料交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂:

苯乙烯與二乙烯苯得交聯(lián)共聚物(PS-DVB),就是應(yīng)用最為廣泛得一類(lèi)基質(zhì)樹(shù)脂。交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類(lèi)樹(shù)脂:

以甲基丙烯酸得甲脂、丁酯、羥基乙酯、環(huán)氧丙酯等化合物為單體制備得交聯(lián)高聚物。三、填料性能評(píng)價(jià)填料得物化性質(zhì)指標(biāo)填料得色譜性能表征1、物化性質(zhì)指標(biāo):a、顆粒大小及其分布(dp);b、比表面積S(m2/g);c、骨架密度ρg(g/ml)、溶劑吸收量Sr(ml/g)、溶脹因子f;d、比孔體積Vp(ml/g);e、孔度Ψ;f、孔徑大小及分布;g、化學(xué)結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)。2、色譜性能表征:保留值:保留時(shí)間(TR),保留體積(VR),容量因子(K`)選擇性:相鄰二物質(zhì)保留時(shí)間之比,與固定相、流動(dòng)相及溫度有關(guān)。柱效率:理論塔板數(shù)(N),或理論塔板高度(H)表示。填充柱得總空隙度和穿透性:分離度(R):相鄰兩色譜峰得保留值之差與各自峰底寬度一半之和得比值。四、反相HPLC高分子填料

ReversedPhaseChromatography,RPC

反相色譜(原理參照P237):非極性固定相,極性流動(dòng)相,強(qiáng)極性組分先洗脫出來(lái)。

1、目前RPC分離柱以硅膠基質(zhì)得鍵合相填料為主,特別就是鍵合C18,C8烷基以及苯基填料。特點(diǎn):傳質(zhì)快,剛性好,柱效高,選擇性好。不足:pH2~8,容易使蛋白質(zhì)失活(殘留得硅羥基)廣泛使用得就是微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂,另有帶C18烷基側(cè)鏈得聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸得烷基酯化物、聚乙烯醇得酯化物,C18烷基鍵合得聚乙烯醇。優(yōu)點(diǎn):pH范圍較廣,表面有較強(qiáng)得疏水性主要廠家日本:東洋-曹達(dá)Tosoh----TSK瑞士:Hamilton,漢密爾頓,英國(guó):高聚物實(shí)驗(yàn)室PolymerLab美國(guó):Bio-Rad伯樂(lè)瑞典:安捷倫Agilent詳見(jiàn):P194表10－1被分離樣品得分子量大小與填料得孔徑選擇

如PLRP－S填料:孔徑＝10nm,適于分離15－20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度得肽類(lèi);孔徑＝30nm,適于分離中等分子量得球形蛋白質(zhì);孔徑＝100nm,適于分離較大得球形蛋白質(zhì)或纖維狀結(jié)構(gòu)得化合物;孔徑＝400nm,適于分離很大分子量得蛋白質(zhì)。

三氟乙酸(TFA)在IEC中,高分子類(lèi)型填料表現(xiàn)更大得優(yōu)越性。大致有3類(lèi):多糖基質(zhì)得離子交換層析介質(zhì)聚合物基質(zhì)得高效離子交換色譜填料高聚物型離子交換色譜填料五、離子交換HPLC填料

IonexchangechromatographyIEC1、多糖基質(zhì)得離子交換層析介質(zhì)傳統(tǒng)得多糖類(lèi)軟質(zhì)凝膠制得強(qiáng)弱陰陽(yáng)離子交換介質(zhì):具有很好親水性和生物相容性;高交聯(lián)度多糖類(lèi)凝膠填料:還適于較高壓力和流速下操作。2、聚合物基質(zhì)得高效離子交換色譜填料交聯(lián)共聚得苯乙烯-二乙烯苯聚甲基丙烯酸酯;4-乙烯吡啶共聚物特點(diǎn):高交聯(lián)大孔結(jié)構(gòu),良好得剛性

和小而均勻得粒度a、多孔樹(shù)脂得IEC填料:柱效、穿透性、分離度、負(fù)載量、回收率得性能優(yōu)異MonoBeads系列:包括MonoQ,MonoS,MonoPSOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S貫流色譜填料POROS系列羥基化聚醚凝膠:如TSKgelDEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等交聯(lián)聚甲基丙烯酸羥基乙酯:親水,大孔b、非多孔樹(shù)脂得IEC填料:羥基化聚醚,交聯(lián)聚苯乙烯,交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯,交聯(lián)瓊脂糖等。優(yōu)點(diǎn):顆粒小,均勻,剛性好,色譜穿透性強(qiáng),流速適應(yīng)范圍寬。避免了固相內(nèi)得吸附與擴(kuò)散,因此具有高柱效,高分離度和高樣品回收率得特點(diǎn)。c、薄殼型樹(shù)脂得IEC填料:優(yōu)點(diǎn):柱效高,選擇性好,分離度高,穿透性好,回收高,流速快等六、有機(jī)高分子類(lèi)型得疏水HPLC填料

Hydrophobicinteractionchromatography,HICHIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白質(zhì)得疏水基團(tuán)與填料表面之間產(chǎn)生弱得疏水性相互作用。高濃度鹽條件下,蛋白質(zhì)與疏水固定相得吸附能力高,隨著鹽濃度得下降,吸附能力下降。當(dāng)淋洗液離子強(qiáng)度逐漸降低時(shí),蛋白質(zhì)樣品按其疏水性得不同依次被洗脫。常見(jiàn)淋洗液有(NH4)2SO4,NH4Ac,NaCl,磷酸鹽等,其中(NH4)2SO4就是最廣泛應(yīng)用得。

疏水