ICS67.080.20

CCSB31

43

湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB43/T2812—2023

普通絲瓜雜交種純度鑒定（SSR法）技術(shù)

規(guī)程

Codeofpracticeforpurityidentificationofspongegourdhybrid(SSRmethod)

2023-11-09發(fā)布2024-02-09實(shí)施

湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB43/T2812—2023

目次

前言II

1范圍1

2規(guī)范性引用文件1

3原理1

4主要儀器設(shè)備、試劑耗材1

5試劑配制2

6引物2

7鑒定流程2

8純度計(jì)算3

附錄A（資料性）常用試劑配方5

附錄B（資料性）引物信息7

I

DB43/T2812—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。

本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件主要起草單位：湖南省蔬菜研究所、長沙市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、長沙縣農(nóng)業(yè)局、岳陽市農(nóng)業(yè)科

學(xué)研究院，湖南湘妹子農(nóng)業(yè)科技有限公司。

本文件起草人：韓小霞、胡新軍、閔子揚(yáng)、李勇奇、鄧穩(wěn)橋、盧亞楠、劉昆言、粟建文。

II

DB43/T2812—2023

普通絲瓜雜交種純度鑒定（SSR法）技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了絲瓜雜交種純度鑒定的主要儀器設(shè)備、試劑耗材、試劑配制、引物、鑒定流程和純度

計(jì)算。

本文件適用于普通絲瓜雜交種純度鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

3原理

SSR標(biāo)記技術(shù)是一種以特異引物PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。由于SSR標(biāo)記廣泛存在于植物基因

組上，不同材料每個(gè)位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量及序列可能不同，故而形成擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性。根據(jù)擴(kuò)增

片段電泳譜帶的差異，可鑒定雜交種純度。

4主要儀器設(shè)備、試劑耗材

主要儀器設(shè)備

研缽、鑷子、電子天平（精度值為0.001）、高速臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、PCR

擴(kuò)增儀、電泳儀、垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、酸度計(jì)、微量移液器、搖床、高壓滅菌鍋、通風(fēng)柜、膠

片觀察燈、數(shù)碼相機(jī)、4℃冰箱和-20℃冰箱。

主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，EDTA-2Na）、鹽酸（HCl）、

氫氧化鈉（NaOH）、三羥甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane，Tris）】、三

氯甲烷(Chloroform)、十二烷基磺酸鈉（Sodiumdodecylsulfonate，SDS）、乙醇（Ethanol）、異丙

醇（Isopropanol）、異戊醇（Isoamylalcohol）、TaqDNA聚合酶、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、

引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（N，N，-methylemebisacrylamide）、四甲基乙

二胺（TEMED）、硼酸（Boricacid）、過硫酸銨（Ammoniumpersulfate）、硝酸銀（Silvernitrate）、

冰醋酸（Glacialaceticacid）、醋酸鈉（Sodiumacetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符

合GB-T6682-2016規(guī)定。

主要耗材

離心管（0.6ml、1.5ml、2.0ml）、槍頭（白槍頭、黃槍頭、藍(lán)槍頭）、槍頭盒、48孔板、96孔

PCR擴(kuò)增板、96孔PCR擴(kuò)增板管蓋、量筒、發(fā)芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。

1

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5試劑配制

相關(guān)試劑配制方法見附錄A

6引物

部分SSR引物信息見附錄B

7鑒定流程

種子催芽

種子扦樣參考GB/T3543.2。取絲瓜雜交種約250粒，父母本約各10粒，溫湯浸種后，28℃～30℃催

芽至種子露出子葉。

取樣

取發(fā)芽種子胚軸0.5cm～1cm，用于DNA提取.

DNA提取方法

可采用CTAB小樣法或者快速堿煮法提取。

7.3.1CTAB小樣法

將絲瓜樣品放于研缽中，加入0.8mLDNA緩沖液，研磨均勻，將磨好的樣品倒回至2ml離心管，冰

上放置或者放冰箱冷凍。

將研磨好的樣品放置于48孔板架上，60℃水浴30min，中間每隔5min搖一次，使樣品受熱均勻。

取出管架，打開2mL離心管管蓋，然后加入0.8mL氯仿:異戊醇（24:1）溶液，顛倒混勻。室溫下靜置

5cm～10min后10,000rpm離心5min；將上清仔細(xì)移至另一2mL離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，

室溫靜置3min，5,000rpm離心5min，去除上清。用70%的乙醇洗滌沉淀2次，待乙醇全部風(fēng)干后，加

入500μL60℃預(yù)熱的ddH2O，再加入5μLRNaseA(10μg/μl)，37℃溫浴10min，最后加入1/10體積

的3mol/LNaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min。5,000rpm離心5min，去上清，用

70%的乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干乙醇后加入200μLddH2O。

用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度并將DNA溶液用ddH2O稀釋到20ng/μL，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

7.3.2快速堿煮法

將絲瓜胚軸放入96孔PCR板管底部，并加入0.25mol/L的NaOH溶液50μL，用96孔板蓋蓋好PCR板，

置于沸水中煮3min，最后加入0.1mol/L的Tris﹒HCl(pH=8.0)150μL。

PCR擴(kuò)增

7.4.1擴(kuò)增體系

DNA模板約0.5μL，10×Buffer1μL，10mmol/ldNTP0.1μL，10pmol/lSSR引物0.2μL，2.5

U/μlrTaq0.1μL，加滅菌ddH2O至總體積10μL。

7.4.2反應(yīng)程序

2

DB43/T2812—2023

94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延

伸5min，4℃保存。

電泳檢測

PCR結(jié)束后，在每孔中加入2μL6×加樣緩沖液，混勻，置于4℃冰箱待檢測。對于擴(kuò)增條帶大小

差別不大的擴(kuò)增產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴(kuò)增條帶大小差別較大的擴(kuò)增產(chǎn)物宜采用普通瓊

脂糖凝膠電泳。

7.5.1變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳裝置準(zhǔn)備

將玻璃板清洗干凈，蓋上凹槽玻璃板。利用瓊脂糖凝膠封好玻璃板。將封膠好的玻璃板放在電泳槽

中，將電泳槽的正極和負(fù)極分別與電泳儀連接。

灌膠

將現(xiàn)配的8%丙烯酰胺（PAGE）凝膠，輕輕搖勻，緩緩灌入玻璃膠室，膠灌滿整個(gè)膠室后，插入樣

品梳，室溫下聚合90min。膠完全聚合后，加入0.5×TBE電泳緩沖液，拔出樣品梳。

點(diǎn)樣與電泳檢測

每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加2μL6×加樣緩沖液，充分混勻后，每個(gè)加樣孔加入3μL樣品，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)

分子量DNA作片段大小標(biāo)準(zhǔn)。180V恒壓電泳90min左右。

染色、顯色和拍照

電泳結(jié)束后，將凝膠放在專用盆中，加入500ml蒸餾水清洗2遍～3遍后，放入染色液中，染色3min～

5min，取出膠板，用蒸餾水漂洗2次～3次。將膠板放入盛有400mL顯影液的托盤中，輕輕搖動(dòng)至條帶

清晰后，迅速用蒸餾水漂洗3遍～5遍，將膠用保鮮膜包好，置于膠片觀察燈上，觀察帶型并拍照記錄。

7.5.2普通瓊脂糖凝膠電泳

將PCR產(chǎn)物與2μL6×加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣至1.0%～3.0%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)（含有0.5

μg/ml的溴化乙錠或者其它指示劑），同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA作片段大小標(biāo)準(zhǔn)，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行

凝膠電泳，電泳電壓120V，電泳時(shí)間約30min，并在凝膠成像系統(tǒng)控制軟件上觀察記錄PCR擴(kuò)增條帶。

8純度計(jì)算

SSR擴(kuò)增條帶表現(xiàn)雙親帶型，則為雜交種；表現(xiàn)任一親本帶型或者其他帶型，則為假雜種。分別統(tǒng)

計(jì)雜交種和假雜種的樣品數(shù)量，根據(jù)式(1)計(jì)算雜交種純度。

=×100%···································································(1)

????1?????2

????1

式中：????

——代表雜交種純度

1——代表檢測總數(shù)

????

2——代表非雜交種譜帶類型的個(gè)體數(shù)量

????

????

3

DB43/T2812—2023

4

DB43/T2812—2023

A

A

附錄A

（資料性）

常用試劑配方

A.1DNA提取試劑

A.1.10.5mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）（pH8.0）溶液

稱EDTA186.1g，加入已有800ml雙蒸水的燒杯中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0，補(bǔ)雙蒸水至1000

ml，用玻璃棒攪拌、搖勻，分裝至100ml的玻璃瓶中，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）后，置于4℃

冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.21mol/LTris-HCl（三羥基氨基甲烷鹽酸，pH8.0）溶液

稱121.1gTris加入含有800ml雙蒸水的燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，補(bǔ)雙蒸水定容至1L，搖

勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.3DNA提取液

取1mol/LTris-HCl溶液50ml、0.5mol/LEDTA溶液20ml，稱SDS7.5g和氯化鈉14.6g加入到

500ml燒杯中，用雙蒸水定容至500ml，充分混勻，使得溶液中的最終濃度為Tris?HCl100mmol/L，

EDTA20mMol/L，NaCl500mmol/L，SDS1.5%（v/v）。

A.1.4氯仿:異戊醇:乙醇（80:4:16）

取160ml三氯甲烷，8ml異戊醇和32ml乙醇加在一起混勻，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.50.25mol/L的NaOH

稱取NaOH1g，加入雙蒸水定容至100ml。

A.1.60.1mol/L的Tris﹒HCl

取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10ml，加雙蒸水定容至100ml。

A.2PCR擴(kuò)增試劑

PCR擴(kuò)增所用的dNTP，TaqDNA聚合酶均從試劑公司（北京全式金生物技術(shù)有限公司）購買，-20℃

保存?zhèn)溆?。引物委托上海生工生物工程公司合成，并將合成后的正向和反向引物用滅菌的雙蒸水配置成

100μM的儲(chǔ)存液，從中取10μl加90μl雙蒸水配置成10μM的工作液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑

A.3.110×TBE緩沖液

稱取108gTris，55g硼酸，40ml0.5MEDTA(pH8.0)，加入燒杯中，用雙蒸水定容到1L，搖

勻。

A.3.210%（W/V）過硫酸銨溶液（APS）

稱0.1g過硫酸銨，加入1ml雙蒸水，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用（保質(zhì)期48h）。

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DB43/T2812—2023

A.3.31×TBE緩沖液

取10×TBE緩沖液200ml，加雙蒸水1800ml，搖勻。

A.3.41×TAE緩沖液

取10×TAE緩沖液200ml，加雙蒸水1800ml，搖勻。

A.3.56×加樣緩沖液

稱取溴酚藍(lán)0.25g，二甲苯青0.25g，加98ml甲酰胺溶液和2mlEDTA（pH8.0）溶液溶解，混

勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3.68%PAGE（丙烯酰胺）凝膠

40%PAGE8ml、10×TBE4ml、ddH2028ml、10%AP400μl、TEMED20μl，總體積40ml，

實(shí)踐中可根據(jù)垂直板的大小按比例配置凝膠。

A.4銀染、顯影試劑

A.4.1染色液

稱1.5g硝酸銀，加雙蒸水1000ml溶解，再加1.5ml甲醛混勻。

A.4.2顯影液

稱15g氫氧化鈉，加入1000ml雙蒸水溶解，再加7.5ml甲醛，混勻。

6

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B

B

附錄B

（資料性）

引物信息

表B.1給出了部分引物信息，更多引物設(shè)計(jì)請參考國際葫蘆科基因組網(wǎng)站（）

公布的信息。

表B.1部分SSR引物信息

引物編號(hào)5'-3'正向引物序列3'-5'正向引物序列

S01CTCCCTCTTTCCCTCACTCCGACAGGACCGTTAACCCAAA

S02TAAATACCCGCCTCGAACACTCCATCCCAGATTTTGCTTC

S03GGGAGAACAAGATAGCCCAATGCAAACTTCGATTTGCTCA

S04CAGCTCTACAACAACATCTCATCATTGGATGTGGGATTCTC

S05AAGATTGAAGTGGGAAAATGCGGCAATCATCTTATCTTTC

S06TGGAGTGTTGACATTGTTTTCAGGTTGGAGTAAGCCAAATTACA

S07TTGAAGATGAAGCCGGAGTTCTAGAGTCAGATGCCTCGCC

S08AGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGAAC

S09CAGCTCTACAACAACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAAC

S10ACTCAATCCAACCCACGAATAGTGGCATTTGAACGCTAAGTTG

S11TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTT

S12TTTGAATCTCGCCATGAAGCTACCCTGTTTTGCAGCTACG

S13CTCCTCAAGAAAATCCACTTCCCCAGGTAATTCTCCTCCATGTC

S14TATTGCCCCAAACTCTTCTCTCATGGACAAAACTTCATAACGCC

S15TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTT

S16TTCCCCATCCATACATTTCTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCTCA

S17GGCGGAATACAAGAAAGATACCCATGTGAAAAGGGAACAGAGAA

S18CCAACTATCACCCCTACAATCAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAG

S19GTCTTCCTGAGAGCTTTTGCATCCCTCTTCTCCTTCGATCTTCT

S20AACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGTGG

S21CGTTTGAGATGTGTGCATGTAGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGA

S22TACCTTCACCCAACTCGCTATTGTGTGTGTTTGATCGGCTGTT

S23TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCATCGATTACGACGACTTTCTTGA

S24TCAGGAAGTGGAGACAACACCGGGAAAAGACTGCACCATCA

S25GCTCTCGATTCTAACCAAAACCTCATTCTACCTCTCCAATTCCA

S26ACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGTGCCCATGTATAGGAAGCAA

S27GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGAGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTT

S28TTTGGGCTCTGACATTAGATGAACACCTTTGGGAGATAACAAGC

S29CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACCAATACTGCCACATCATCAGCTC

S30GGAGGAGGGAAGAGGAGATGAGGTAAAGCAACAACCCCATAA

S31GTCGCCACCGTTGAGTTTAACCTTAATCCGGCTAGGAAAG

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表B.1部分SSR引物信息（續(xù)）

引物編號(hào)5'-3'正向引物序列3'-5'正向引物序列

S32CATCACCACCACCACAACCGCCACCAAAATCAGCTCTATG

S33AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGAGGC

S34TCCACCAACTCTCACTTTCCTTGCATATCCCCAAAACGAACTAA

S35AAGACAAATTAAGGAGGGGAGGTAAGACGAGCGTAATGGTTGAC

S36TTCTTTCTCCTTCGCTGTCTTCGGGATGATGATATTCGGAGCTA

S37CCACCCCATTTCATACACAATACATTCAACCTAAGAGCGAGTGA

S38AATTTTATGGACCTCATTCCCC