2025年大學(xué)《化學(xué)生物學(xué)》專業(yè)題庫(kù)——生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧探究考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡(jiǎn)述凝膠過(guò)濾層析（凝膠滲透色譜）分離蛋白質(zhì)的原理，并指出其適用于分離蛋白質(zhì)的主要依據(jù)。二、在進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，為什么通常需要設(shè)置一系列不同的底物濃度？簡(jiǎn)述雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-BurkPlot）的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)。三、核酸電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常用技術(shù)。請(qǐng)簡(jiǎn)述瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理，并說(shuō)明影響核酸遷移速率的主要因素有哪些。四、在蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)中，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體后，為何需要進(jìn)行封閉處理？封閉不充分或封閉過(guò)度可能分別對(duì)后續(xù)的抗體結(jié)合產(chǎn)生什么影響？五、設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，用于檢測(cè)某酶制劑在不同溫度（例如4°C,25°C,37°C,50°C）下的活性變化。請(qǐng)寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)的核心步驟，包括所需主要試劑、儀器以及活性測(cè)定的簡(jiǎn)要方法。六、某學(xué)生在進(jìn)行蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白樣品在SDS電泳時(shí)出現(xiàn)多條主帶，且主帶位置與預(yù)期分子量不符。請(qǐng)分析可能的原因，并提出至少兩種進(jìn)一步確認(rèn)問(wèn)題所在或解決問(wèn)題的思路。七、簡(jiǎn)述PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本原理，并列舉三個(gè)影響PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的關(guān)鍵因素。八、在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，將外源DNA片段克隆到表達(dá)載體上后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化前，為何要對(duì)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理（如冰上融化、熱激等）？這些步驟的目的是什么？九、比較親和層析與離子交換層析在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用特點(diǎn)，說(shuō)明這兩種方法各自適合分離哪種類型的蛋白質(zhì)，并簡(jiǎn)述其基本原理。十、某研究項(xiàng)目需要從細(xì)胞中提取總RNA。請(qǐng)簡(jiǎn)述從細(xì)胞裂解到獲得高質(zhì)量RNA樣品的主要步驟，并說(shuō)明在操作過(guò)程中需要注意避免哪些因素對(duì)RNA質(zhì)量造成影響。試卷答案一、原理：利用多孔性凝膠顆粒作為固定相，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)凝膠時(shí)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小與凝膠孔道大小的相對(duì)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)大小不同的蛋白質(zhì)分離。大分子蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入或只能進(jìn)入少量凝膠孔道，主要受流體力學(xué)阻力影響，遷移速度較快；小分子蛋白質(zhì)可以進(jìn)入孔道，受流體力學(xué)阻力和孔道內(nèi)擴(kuò)散阻力雙重影響，遷移速度較慢。主要依據(jù)：蛋白質(zhì)分子的大?。ㄖ睆交蛩畡?dòng)力學(xué)半徑）。不同大小的蛋白質(zhì)在凝膠孔道中的阻滯效應(yīng)不同，導(dǎo)致在洗脫時(shí)產(chǎn)生不同的遷移速率。二、原因：通過(guò)設(shè)置不同底物濃度，可以測(cè)量不同條件下（主要是不同底物濃度下）的酶反應(yīng)速率（V），從而繪制出酶促反應(yīng)速率（V）與底物濃度（[S]）的關(guān)系曲線（如Michaelis-Menten曲線），進(jìn)而分析酶的特性（如Km值）。原理：基于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基本方程V=(Vmax*[S])/(Km+[S])。通過(guò)取倒數(shù)，將非線性關(guān)系轉(zhuǎn)換為線性關(guān)系：1/V=(Km/Vmax)*(1/[S])+1/[S]。在雙倒數(shù)坐標(biāo)系中，該方程呈現(xiàn)直線形式，其縱軸截距為1/Vmax，斜率為Km/Vmax。優(yōu)點(diǎn)：將復(fù)雜的非直線關(guān)系簡(jiǎn)化為直線關(guān)系，便于通過(guò)作圖更直觀地求算酶的特征常數(shù)Vmax和Km。缺點(diǎn)：對(duì)縱軸截距（1/Vmax）的測(cè)定精度受Vmax值影響較大，當(dāng)Vmax較小時(shí)，誤差會(huì)顯著增大；且當(dāng)[S]>>Km時(shí)，1/[S]項(xiàng)接近零，直線趨于水平，難以準(zhǔn)確測(cè)定Km值；對(duì)低濃度底物下的反應(yīng)速率測(cè)量誤差較大。三、原理：利用核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極遷移。核酸分子（特別是DNA）是長(zhǎng)鏈大分子，其遷移速率不僅取決于電荷量和電荷密度，更主要受分子大小（長(zhǎng)度、構(gòu)象）和形狀的影響。在凝膠基質(zhì)中，分子需要“穿梭”通過(guò)網(wǎng)孔，分子越大，通過(guò)網(wǎng)孔的阻礙越大，遷移越慢。主要影響因素：1）核酸分子大小和構(gòu)象：大小是主要因素，越大越慢。構(gòu)象（如超螺旋、線性、環(huán)狀）也會(huì)影響遷移速率。2）凝膠濃度：瓊脂糖濃度越高，凝膠孔徑越小，對(duì)大分子核酸的阻礙越大，遷移速率越慢。3）電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓越高，遷移速率越快。4）緩沖液系統(tǒng)：緩沖液種類、離子強(qiáng)度、pH值會(huì)影響核酸的構(gòu)象和電荷狀態(tài)，進(jìn)而影響遷移速率。5）溫度：通常溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，遷移速率略有加快，但過(guò)高溫度可能導(dǎo)致核酸降解或凝膠熔化。四、目的：封閉處理是為了阻斷固相載體（如PVDF、NC膜）上未結(jié)合的活性位點(diǎn)（如氨基、羧基）與后續(xù)加入的抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，從而提高抗體結(jié)合的特異性和信號(hào)的穩(wěn)定性。影響：封閉不充分：會(huì)導(dǎo)致載體上的未封閉位點(diǎn)與抗體結(jié)合，產(chǎn)生大量非特異性背景，掩蓋或干擾特異性信號(hào)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以判讀。封閉過(guò)度：可能會(huì)使載體表面過(guò)度“惰化”，甚至封閉其上可能存在的與抗體有弱特異性結(jié)合的區(qū)域，導(dǎo)致抗體結(jié)合效率降低，即使存在特異性結(jié)合，也可能因?yàn)樾盘?hào)過(guò)弱而難以檢測(cè)到。五、核心步驟：1.準(zhǔn)備酶促反應(yīng)體系：包含待測(cè)酶樣品、特定底物、緩沖液（pH、溫度等條件應(yīng)預(yù)先設(shè)定并保持恒定）、以及必要的激活劑或抑制劑（如適用）。設(shè)置不同溫度梯度組（4°C,25°C,37°C,50°C）。2.設(shè)置反應(yīng)條件：將酶促反應(yīng)體系置于設(shè)定好溫度的恒溫水浴鍋中預(yù)熱。3.啟動(dòng)反應(yīng)：在統(tǒng)一時(shí)間點(diǎn)加入酶，開(kāi)始計(jì)時(shí)。4.定時(shí)取樣：在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)（例如，反應(yīng)達(dá)到線性期后），從各組中精確吸取等量反應(yīng)液。5.終止反應(yīng)：立即加入適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)終止液（如酸、甲醛等）使酶失活，并使產(chǎn)物反應(yīng)停止。6.測(cè)定活性：采用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定產(chǎn)物生成量或底物消耗量。常用方法如：分光光度法（測(cè)定產(chǎn)物OD值變化速率）、熒光法（測(cè)定熒光強(qiáng)度變化速率）或放射性同位素法（測(cè)定放射性產(chǎn)物積累速率）。7.數(shù)據(jù)處理：計(jì)算各溫度下酶的活性（通常表示為單位時(shí)間、單位酶量的產(chǎn)物量或底物消耗量），繪制酶活性隨溫度變化的曲線，確定最適溫度。六、可能原因：1.蛋白質(zhì)樣品純化不純：存在其他雜蛋白干擾，尤其是在SDS的還原條件下，某些雜蛋白可能跑偏或與目標(biāo)蛋白發(fā)生非特異性聚集。2.蛋白質(zhì)降解：樣品在純化過(guò)程中或儲(chǔ)存不當(dāng)發(fā)生了酶解或氧化等降解。3.蛋白質(zhì)發(fā)生聚集或變性：目標(biāo)蛋白可能形成了聚集體，或者雖然溶解但在電泳條件下部分區(qū)域發(fā)生異常聚集或沉淀。4.SDS操作問(wèn)題：如上樣量不準(zhǔn)、電壓或電泳時(shí)間不當(dāng)、樣品與凝膠混合不均、還原劑（如β-巰基乙醇）添加不足或過(guò)量等。5.載體或緩沖液?jiǎn)栴}：凝膠本身有問(wèn)題或緩沖液pH、離子強(qiáng)度異常。思路：1.重復(fù)進(jìn)行SDS，觀察條帶是否依然異常，以排除操作誤差。2.進(jìn)行凝膠成像定量分析，比較各條帶（包括主帶和預(yù)期條帶）的相對(duì)分子量和相對(duì)含量，看是否符合預(yù)期。3.嘗試進(jìn)行進(jìn)一步純化，看是否能得到單一主帶。4.進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序（如質(zhì)譜），鑒定主帶和異常條帶分別是什么蛋白質(zhì)，判斷是純化不純還是蛋白本身有問(wèn)題。5.嘗試使用不同濃度的SDS凝膠進(jìn)行分離，看是否能分離出更多細(xì)節(jié)或得到更清晰的單一主帶。6.檢查樣品的溶解性，嘗試超聲或透析等方法改善。七、原理：PCR利用DNA聚合酶在體外特定溫度循環(huán)條件下，以少量模板DNA、兩種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）和一對(duì)特異性引物，通過(guò)DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，選擇性、酶促、可控制地?cái)U(kuò)增特定DNA片段的過(guò)程。包括變性（高溫使模板DNA雙鏈解開(kāi)）、退火（低溫使引物與模板DNA互補(bǔ)結(jié)合）、延伸（中溫DNA聚合酶在引物3'端合成新鏈）三個(gè)基本步驟的重復(fù)循環(huán)。關(guān)鍵因素：1.DNA聚合酶的活性：酶的濃度和活性直接影響產(chǎn)物的擴(kuò)增效率。2.引物的質(zhì)量和濃度：引物需特異性強(qiáng)、無(wú)二聚體或非特異性結(jié)合，濃度合適。引物二聚體或非特異性結(jié)合會(huì)競(jìng)爭(zhēng)模板或占據(jù)酶，降低特異性擴(kuò)增效率。3.脫氧核苷三磷酸（dNTPs）的濃度和種類：dNTPs是合成新鏈的原料，其濃度必須足夠且比例正確。降解或錯(cuò)配的dNTPs會(huì)降低效率。4.模板DNA的質(zhì)量和濃度：模板量過(guò)少會(huì)降低擴(kuò)增信號(hào)，模板質(zhì)量差（如降解）會(huì)影響擴(kuò)增效率。5.PCR反應(yīng)緩沖液：包括pH值、離子強(qiáng)度（如Mg2?濃度）等，需優(yōu)化至適合所用酶的最適條件。八、目的：感受態(tài)細(xì)胞是指經(jīng)過(guò)特殊處理（通常是物理或化學(xué)方法）使其細(xì)胞壁或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變得通透，能夠吸收外源DNA分子的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化前對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的預(yù)處理是為了最大化其攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率。預(yù)處理步驟及目的：1.冰上融化：使細(xì)胞處于低溫狀態(tài)，降低其代謝活動(dòng)，減緩DNA降解（如果DNA是預(yù)冷的），并使細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，有利于后續(xù)的熱激處理。2.熱激（HeatShock）：將融化的感受態(tài)細(xì)胞短暫暴露于較高溫度（通常42°C，持續(xù)幾秒到一分鐘），這一步驟通常與鈣離子（Ca2?）存在有關(guān)。高溫會(huì)瞬間改變細(xì)胞膜的通透性，形成暫時(shí)性的孔道，使外源DNA能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。3.（有時(shí)還包括）鈣離子處理：Ca2?有助于穩(wěn)定細(xì)胞膜和DNA，促進(jìn)DNA與細(xì)胞表面的結(jié)合，并在熱激時(shí)幫助DNA進(jìn)入細(xì)胞。九、親和層析：應(yīng)用特點(diǎn)：利用抗原-抗體、酶-底物、受體-配體等具有高度特異性結(jié)合的分子對(duì)進(jìn)行分離。結(jié)合力強(qiáng)，特異性高，通常能實(shí)現(xiàn)高效純化。適用蛋白：適合分離純化那些表面具有特定識(shí)別位點(diǎn)的蛋白質(zhì)（如已知抗體結(jié)合位點(diǎn)、酶活性位點(diǎn)、特定激素受體等）。原理：將帶有特異性配體的固定相（填料）裝在層析柱中，樣品流過(guò)時(shí)，目標(biāo)蛋白因其與配體的特異性結(jié)合而被吸附在柱子上，而其他蛋白則流出。用洗脫液改變配體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合條件（如改變pH、離子強(qiáng)度、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑濃度等），使目標(biāo)蛋白特異性解離下來(lái)而被洗脫收集。離子交換層析：應(yīng)用特點(diǎn)：利用蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷與帶有相反電荷的離子交換樹(shù)脂之間的靜電作用進(jìn)行分離。分離機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單，可調(diào)節(jié)參數(shù)多，應(yīng)用廣泛。適用蛋白：適合分離純化等電點(diǎn)（pI）與層析柱填料電荷性質(zhì)相反的蛋白質(zhì)。通過(guò)改變緩沖液pH或離子強(qiáng)度，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)電荷和樹(shù)脂電荷，控制蛋白質(zhì)的吸附和洗脫。原理：離子交換樹(shù)脂帶有固定電荷（如季銨基團(tuán)帶正電，磺酸基團(tuán)帶負(fù)電）。當(dāng)帶相反電荷的蛋白質(zhì)樣品流過(guò)柱子時(shí)，會(huì)與樹(shù)脂發(fā)生靜電吸附。通過(guò)改變洗脫緩沖液的pH值（改變蛋白質(zhì)電荷）或離子強(qiáng)度（改變?nèi)芤褐凶杂呻x子濃度，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)），可以降低蛋白質(zhì)與樹(shù)脂之間的靜電引力，使蛋白質(zhì)從樹(shù)脂上解離下來(lái)，按其電荷或大小差異被洗脫。十、主要步驟：1.細(xì)胞裂解：使用合適的裂解緩沖液（通常含有高鹽、非離子去垢劑、蛋白酶抑制劑等）在適當(dāng)條件下（如冰浴、超聲波、高壓勻漿等）破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。裂解需徹底但避免過(guò)度剪切或蛋白質(zhì)變性。2.去除細(xì)胞核和細(xì)胞器：通過(guò)低速離心去除細(xì)胞核和有膜細(xì)胞器，保留胞質(zhì)中的RNA。3.RNA沉淀：加入異丙醇或乙醇，低溫孵育，使RNA在高鹽濃度下沉淀出來(lái)。4.洗滌：將RNA沉淀用乙醇洗滌，去除殘留的鹽分、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。5.終止洗滌并溶解：棄去上清，小心吸干乙醇，將RNA沉淀在DEPC水或無(wú)RNA酶水中懸浮、重懸或溶解。6.（