凝膠層析

(Gelchromatography)12

凝膠層析(Gelchromatography)分子篩層析、凝膠擴(kuò)散層析、排阻層析、限制擴(kuò)散層析等。是將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離的層析方法。3第一節(jié)凝膠層析的基本原理凝膠層析的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進(jìn)行的。柱的總體積為VA，它包括填料的骨架體積VGM，填料的孔體積Vi(內(nèi)水體積)以及填料顆粒之間的體積V0（外水體積）。VA=V1+V0+VGM

45原理當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時，較小的分子在柱中停留時間比大分子停留的時間要長，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開，最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+ViKd

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6（一）平衡排除理論當(dāng)溶質(zhì)層流過一個填料顆料這段距離時，溶質(zhì)分子已多次進(jìn)出于填料的孔，達(dá)到平衡。平衡條件只是在流速很慢時的一個極端情況。7（二）擴(kuò)散分離理論溶質(zhì)分子在流經(jīng)色譜柱的過程中，在流動相和固定相之間沒有達(dá)到平衡，存在著流速依賴性。聚苯乙烯和苯乙烯樣品淋出曲線的流速依賴性1．流速為0.65ml/min；2．流速為2.0ml/min溶劑為甲苯

8（三）流動分離理論

紅細(xì)胞在毛血細(xì)管中流動時比血漿流得快.較大的分子較先通過或繞過這個填料顆粒，使溶質(zhì)能按其大小進(jìn)行分離。

9分離過程三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進(jìn)行分離。樣品加入，以水或其他溶液進(jìn)行洗脫，即得洗脫曲線。10分離過程最先流出物質(zhì)A，A分子量最大，完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過，“全排阻”。其流經(jīng)體積最小，等于外水體積V0。最后流出物質(zhì)C，它分子量最小，其分子可以自由進(jìn)出凝膠顆粒，“全滲入”。流經(jīng)體積是外水體積與內(nèi)水體積之和V0+Vi。物質(zhì)B分子量介于滲入限與排阻限之間，其分子能夠部分地進(jìn)入凝膠顆粒中?！安糠峙抛琛被颉安糠譂B入”。流徑體積Ve是全部外水體積加上內(nèi)水體積的一部分，即Ve=V0+KdVi

11分配系數(shù)Kd排阻系數(shù)：

當(dāng)Kd=1時，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當(dāng)Kd=0時，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。0＜Kd＜1時，洗脫體積Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。12物質(zhì)的Kd值13凝膠層析的特點（1）凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。（2）分離效果較好，重復(fù)性高。（3）分離條件緩和。（4）應(yīng)用廣泛。（5）分辨率不高，分離操作較慢。14第二節(jié)凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)一、葡聚糖凝膠

(Sephadex)二、修飾葡聚糖凝膠(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝膠

（Bio-GelP）四、瓊脂糖類凝膠

（Sepharose）

五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝膠（hydrophobicgels）

15一、葡聚糖凝膠(Sephadex)商品名為SephadexG類.交聯(lián)葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再經(jīng)3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。其交聯(lián)度是通過交聯(lián)劑的加量及反應(yīng)條件來控制的。

16SephadexG編號意義：

1、吸液量；

2、溶漲時間；

3、凝膠孔徑；

4、分離范圍蛋白質(zhì)、多糖17葡聚糖凝膠性能與編號的關(guān)系編號交聯(lián)度吸液量膨脹速度凝膠孔徑分離限凝膠強(qiáng)度大（SephadexG－150

）小大慢大大小?。⊿ephadexG－50

）大小快小小大18葡聚糖凝膠（G類）的規(guī)格19葡聚糖凝膠（G類）特點1、孔徑。2、穩(wěn)定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和雜環(huán)化合物。20保存保存的方法有干法、濕法和半縮法三種。濕法：加入一定量的防腐劑置于冰箱中作短期保存（6個月以內(nèi)）。常用0.02%疊氮化鈉、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用濃度逐漸升高的乙醇分步處理洗凈的凝膠，脫水收縮，抽濾，用60~80℃吹干。半縮法：21二、修飾葡聚糖凝膠

(ModifiedSephadex)（一）親脂性葡聚糖凝膠（LipophilicSephadex）骨架結(jié)構(gòu)上引入一些有機(jī)基團(tuán)，如甲基、羥丙基，使呈親脂性，同時保留親水性。（二）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑（Sephadex–ion-exchanger）將活性交換基團(tuán)連接于葡聚糖凝膠上制成的各種交換劑。22交聯(lián)葡聚糖離子交換劑23

（三）Supperdex系凝膠由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成。（四）Sephacryl系凝膠是由烯丙烷基葡聚糖經(jīng)甲叉雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成的。理化穩(wěn)定性好，為硬性凝膠，可耐高壓滅菌。24Supperdex系凝膠25Sephacryl系凝膠26三、聚丙烯酰胺凝膠

商品名為生物凝膠-P（Bio-GelP）。該凝膠由丙烯酰胺組成；以亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，聚合而成。特點：

1、孔徑；

2、穩(wěn)定性、強(qiáng)度；

3、無非特異吸附，保存方便；

4、編號反映出它的分離界限。

27聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)

生物凝膠的編號反映出它的分離界限。如Bio-GelP-100。28四、瓊脂糖類凝膠

（Sepharose）

（一）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)是由β-D-半乳糖與3，6-脫水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷鍵相間連接而成的鏈狀分子。29瓊脂糖凝膠特點1、沒有共價鍵的交聯(lián)。2、孔徑瓊脂糖的濃度。3、瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差。4、非特異性吸附力低。5、分離范圍大。6、顆粒強(qiáng)度差。30瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖凝膠有3個規(guī)格：Sepharose2B、4B、6B分別表示瓊脂糖濃度為2%，4%，6%。31幾種蛋白質(zhì)Kav值

32（二）架橋瓊脂糖凝膠（SepharoseCL）

架橋瓊脂糖凝膠為瓊脂線性分子經(jīng)1，3-二溴丙醇交聯(lián)的凝膠。它的凝膠孔徑均勻，機(jī)械強(qiáng)度明顯加大。對熱和化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性大大增加,在pH3~14范圍內(nèi)穩(wěn)定。

33SepharoseCL的性質(zhì)

34（三）超膠（Utro-gelACA）所謂超膠是瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠。商品名稱后面的編號為兩位數(shù)，各表示混合膠中聚丙烯酰胺與瓊脂糖的百分濃度。35

（四）

Superose系凝膠

是由珠狀瓊脂糖經(jīng)兩次交聯(lián)制得的可用于HPLC的高速凝膠過濾介質(zhì)。有6%和12%兩個規(guī)格。36五、多孔玻璃微球(Bio-glas)特點：1、化學(xué)穩(wěn)定性高、強(qiáng)度大。

2、對糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附作用。

3、編號表示其孔徑,越大，分離分子量也越大。37六、疏水性凝膠（hydrophobicgels）聚甲基丙烯酸酯凝膠和聚苯乙烯凝膠。Styragel商品,

分離范圍為1600～40000000。生物珠（Bio-BeadS），適于分離分子量較小的物質(zhì)。分離不溶水的有機(jī)物質(zhì)。38常用的商品化凝膠介質(zhì)

39一第三節(jié)

凝膠層析的實驗條件和操作

4041第三節(jié)

凝膠層析的實驗條件和操作

一、凝膠的選擇和處理

二、凝膠層析柱的設(shè)計和制備

三、凝膠層析操作

四、主要參數(shù)測算

42一、凝膠的選擇和處理（一）凝膠的選擇(1).將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。(2).將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。431．類分離（1）使大分子的分配系數(shù)Kd=0；（2）小分子的Kd=1。選用SephadexG-25凝膠，分離范圍1000～5000。442．分級分離（1）使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大。（2）不使分子量分布在凝膠分離范圍的一側(cè)。（3）分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用SephadexG-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比SephadexG-150為好。45（二）凝膠粒度的選擇細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率高，用于精制分離或分析。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率低，用于粗制分離，脫鹽。46（三）凝膠的預(yù)處理使用前須溶漲，使干膠顆粒充分吸收溶劑，并達(dá)到平衡。干膠以10倍以上吸液量的溶劑浸泡。熱法溶漲(水浴)。47二、凝膠層析柱的設(shè)計和制備

（一）層析柱的選擇層析柱長度與直徑的比值稱作“柱比”。對于類分離，柱床體積一般為樣品溶液體積的5倍，柱比5:1到10:1即可。對于分級分離，則要求柱床體積大于樣品體積25倍以上，甚至多達(dá)100倍。柱比在25至100之間。48凝膠柱床大小與所需凝膠量的關(guān)系

49（二）凝膠柱的裝填常用的支持物有棉花、玻璃纖維、玻璃珠、垂熔玻璃等?？罩袘?yīng)留約1/5的水或溶劑.不斷攪拌下使膠粒均勻沉降，使不發(fā)生凝膠分層和膠面傾斜。50（三）凝膠床的檢查和維護(hù)觀察有無凝膠分層、溝流和氣泡等現(xiàn)象。有色物質(zhì)溶液過柱，觀察柱床有無溝流，色帶是否平整。檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖。51操作壓

層析柱由于進(jìn)出口之間液位壓力差形成的對凝膠顆粒的壓力稱作“操作壓”。

52層析床橫截面所允許的最大壓力

53三、凝膠層析操作（一）樣品和加樣蛋白質(zhì)類樣品濃度:不大于4%。加樣時應(yīng)盡量減少樣品的稀釋，及凝膠床面的攪動。

樣品粘度對洗脫曲線的影響柱：交聯(lián)葡聚糖G-25，4×85cm；流速180ml/h；樣品：0.1%血紅蛋白+1.0%氯化鈉；（1）相對粘度為0.118；（2）相對粘度為0.042；（3）相對粘度為0.01054方法

（1）直接將樣品加到層析床表面。（2）樣品比重高。55

（二）洗脫與收集1、洗脫劑。2、流速（操作壓、型號、粒度）。3、分部收集器。56（三）凝膠柱的再生反沖。重新裝柱。57四、主要參數(shù)測算V0及Vi的測算Kd及Kav的值分辨率R58（一）V0及Vi的測算1．重量法Vt=Vo+Vi+Vg=π/4·d2h

Vi=g·WrVo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算為1cm3/g干膠。2．過柱法已知物質(zhì)的洗脫體積Ve=Vo+KdVi如用全滲入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物質(zhì)過柱，測量其洗脫體積，計算該凝膠柱的V0值及Vi值。常用藍(lán)色葡聚糖（Kd=0）及重鉻酸鉀（Kd=1）。59（二）分配系數(shù)測定分配系數(shù)當(dāng)測得某物質(zhì)的Ve及Vt

，內(nèi)水體積Vi及外水體積V0時，算出Kd及Kav的值。Kd及KavVe被認(rèn)為是一種組分對于某一個凝膠柱的特征常數(shù)。60（三）分辨率凝膠層析中，兩物質(zhì)（A和B）和分辨率（R）定義為：

當(dāng)R值＞1，兩物質(zhì)完全分開，小于1時則不能完全分離。分離時較大柱床體積可增大△Ve

。減少（WA+WB）的方法是適當(dāng)濃縮樣品、選用小粒度凝膠、流速適當(dāng)減慢等。61五、凝膠層析的擴(kuò)展

（一）上行凝膠層析

利用流動和重力方向相反的上行層析法，即洗脫液向上流動的層析法。反轉(zhuǎn)柱（二）增加有效床高

-提高分辨率

（1）串聯(lián)層析：有效柱長

（2）循環(huán)層析：即在同一根或兩根柱上，樣品反復(fù)進(jìn)行層析。62循環(huán)層析圖7.21人血漿藍(lán)蛋白的循環(huán)層析分離柱：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-100，3.2×93cm；樣品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h；洗脫液：0.1mol/LpH8.0Tris緩沖液（含0.5mol/LNaCl）

簡單的循環(huán)層析裝置選擇閥用于選擇待循環(huán)液或廢液，樣品從A→D上柱，經(jīng)B→D洗脫，經(jīng)檢出的廢液由E→C排出，需循環(huán)的物質(zhì)由E→D進(jìn)入層析柱。

63（三）薄層凝膠層析

用交聯(lián)葡聚糖作為薄層層析的支撐載體，稱“薄層凝膠層析”。僅適用于分析。特點：

生化分析；設(shè)備簡單，操作方便，分離迅速；分辨率高；同一薄板可同時分析數(shù)個樣品；64第四節(jié)

色譜峰變寬的問題

樣品的洗脫曲線不是一個窄的矩形峰，而是一個較寬的高斯峰。洗脫曲線：樣品的分子量分布，儀器造成的峰加寬效應(yīng)。

65一、溶液通過色譜柱造成的峰加寬Giddings提出的無規(guī)則行走模型。溶質(zhì)分子本身的運動是無規(guī)則的。（一）分子擴(kuò)散（二）渦流擴(kuò)散（三）流動相中傳質(zhì)阻力（三）固定相中傳質(zhì)阻力66（一）分子擴(kuò)散

濃度梯度

(HETP)d=2γDm/V

（HETP）d—溶質(zhì)分子縱向擴(kuò)散對塔板高度的貢獻(xiàn)γ—擾動因子，表示柱內(nèi)填料對于溶質(zhì)分子擴(kuò)散的擾動作用。Dm—是溶質(zhì)分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)；V—流速。(1)小而均勻的填料(2)適當(dāng)?shù)娜軇?3)提高流速67（二）渦流擴(kuò)散與填料顆粒的形狀，尤其是顆粒尺寸有關(guān)。(HETP)e=2λdp

dp—填料顆粒的直徑；

λ—是與填料及裝填有關(guān)的常數(shù)。(1)小而均勻的填料(2)粒度一致且裝得均勻68（三）流動相中傳質(zhì)阻力流動相在柱中的流速是不均勻的。溶質(zhì)分子有流速的梯度而導(dǎo)致溶質(zhì)分子的濃度梯度，徑向擴(kuò)散。

（HETP）m=ωd2pV/Dm

(1)填料裝得規(guī)整、緊密。(2)采用粒度小的填料；(3)降低流速；(4)選用合適的溶劑（溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)較大）。69（四）固定相中傳質(zhì)阻力在色譜柱中溶質(zhì)分子的一部分F在流動相中，而另一部分（1—F）在固定相中。分子從固定相中脫離出來到流動相中去，而另一些分子則從流動相進(jìn)入固定相中。結(jié)果：（1）溶質(zhì)層變寬；（2）溶質(zhì)層作為一個整體以FV的速度運動。70色譜柱內(nèi)造成的峰加寬填充介質(zhì)粒度越小,峰加寬效應(yīng)越小。71溶液在柱外產(chǎn)生的峰加寬

（一）連接管路

當(dāng)液體流經(jīng)細(xì)管時，徑向速度梯度使矩形溶液脈沖變成拋物面形，并導(dǎo)致濃度的徑向梯度。減小管徑

（二）檢測池

72二、峰寬的表示方法W是峰寬，它是通過曲線的兩個拐點的切線和基線交點之間的距離。拐點之間的距離等于2δ，δ稱為峰的標(biāo)準(zhǔn)偏差。δ是衡量峰的寬度的量。

W=4δ

73分離效果—分離度

分離效果用兩個峰的峰尖距離以及兩個峰的峰寬來表示。分離度Rs的定義為：選擇性決定分離能力，表現(xiàn)在兩個峰之間的距離上；柱效決定峰的擴(kuò)張程度，表現(xiàn)在峰寬W和標(biāo)準(zhǔn)偏差σ上。74分離能力：填料顆粒的孔徑大小孔徑分布溶質(zhì)分子量分布.柱效：

溶質(zhì)分子的擴(kuò)散填料的粒度和分布填料顆粒的幾何形狀柱子的尺寸流速75第五節(jié)凝膠層析的應(yīng)用一、脫鹽和濃縮二、分子量測定三、分離純化76一、脫鹽和濃縮脫鹽用的凝膠多為大粒度的，高交聯(lián)度的凝膠。交聯(lián)度大，凝膠顆粒強(qiáng)度好；凝膠粒度大，流速高。