布魯氏菌間接酶標(biāo)補(bǔ)體C1q結(jié)合試驗(yàn)(iEL-CFA)抗體檢測(cè)方法2025-9-30發(fā)布2025-9-30實(shí)施IT/CVMA288—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：廣東君睿生物技術(shù)研究有限公司、中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、新疆哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、博威(南京)生命科學(xué)技術(shù)有限公司、北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站。本文件主要起草人：毛開榮、梁小杰、何靜、孫雨、閆若潛、古麗曼·木哈買提拜、馬春江、劉桂林、王冠玉、哈達(dá)、李志、郭志剛、張春起、梁春菲、莫永熙、藍(lán)婷、孫航、王勝華、謝彩華、顏成旭、楊帆、格根塔娜、牧蘭、李曉艷、龍穎弘。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，附錄D.1“補(bǔ)體Clq抗體的制備”可能涉及到1條“一種用純化天然補(bǔ)體C1q制備補(bǔ)體Clq多克隆抗體的方法”相關(guān)的該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾，他愿意同任何申請(qǐng)人專利持有人姓名：廣東君睿生物技術(shù)研究有限公司(黃劍華、毛開榮、梁小杰、何靜、龐春蓮、李夢(mèng)瀅、藍(lán)婷、梁春菲、莫永熙、王慶福)地址：廣東省中山市火炬開發(fā)區(qū)歐亞路12號(hào)T/CVMA288—20251劑與耗材、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)果計(jì)算僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范OD:光密度(opticaldensity)PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffersaline)TMB:四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidi結(jié)合后，能進(jìn)一步結(jié)合補(bǔ)體成分中的Clq,通過酶標(biāo)補(bǔ)體Clq多克隆抗體及酶顯色系統(tǒng)可對(duì)抗原抗體與2T/CVMA288—20256.1.1除特別說明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T6682中二級(jí)6.1.2布魯氏菌LPS抗原，制備方法見附錄A。6.1.5補(bǔ)體C1q抗體，制備方法見附錄D.1。6.1.6HRP標(biāo)記補(bǔ)體Clq抗體，制備方法見附錄D.2。6.1.8樣品稀釋液，制備方法見附錄E.2。6.1.920倍濃縮洗滌液，制備方法見附錄E.3。6.1.10TMB顯色液，制備方法見附錄E.4。6.1.11終止液，制備方法見附錄E.5。6.2.1離心管(2.0mL,無核酸酶)。6.2.2微量移液器吸頭(10μL、200μL、1000μL,無核酸酶)。6.2.3血清稀釋板(96孔一次性U型血凝板或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。6.2.4一次性注射器或采血管(5mL、10mL)。7.1冰箱：2℃~8℃,-20℃以下。7.6微量移液器(量程為2μL～20μL、20μL～2007.7多道移液器(量程為30μL～300μL)。3應(yīng)按照NY/T541中的規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物血當(dāng)容器，采集血液不少于2mL。按照NY/T541中規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物血清或全血樣品的存~8℃條件下保存。若超過一周再檢測(cè)，應(yīng)置于-20℃以下冷凍保存。采集的血清樣品可用冰袋或保溫9.1樣品及對(duì)照血清稀釋：用樣品稀釋液將待檢血清樣品及對(duì)照血清按品加90μL樣品稀釋液)。9.2補(bǔ)體稀釋：用樣品稀釋液將補(bǔ)體作1:200稀釋。9.5加樣：檢測(cè)孔加入稀釋后的樣品血清50μL。陽性對(duì)照血清與陰性對(duì)照血清各設(shè)2孔，每孔分別加N值=陰性對(duì)照平均OD?50nm值；P/N值=陽性對(duì)照平均OD?50nm值/陰性對(duì)照平均OD?50nm值；4N值≤0.30,P/N值≥4時(shí)，試驗(yàn)成立。否則，試驗(yàn)結(jié)果無效，需重新試驗(yàn)。待檢樣品S/N值≥2.1,判為陽性。待檢樣品S/N值≤2.1,則判為陰性。5(規(guī)范性)布魯氏菌LPS抗原的制備A.1滅活檢驗(yàn)取布魯氏菌S2滅活菌液，按中華人民共和國(guó)獸藥典《無菌檢查法》進(jìn)行檢驗(yàn)，確認(rèn)無活菌后方可進(jìn)行以下操作。A.2LPS提取A.2.1將布魯氏菌滅活菌液10000rpm離心10min,棄上清液，稱取濕菌體重量。A.2.2以下制備程序按濕菌體50g為例：A.2.3取濕菌體50g,加入蒸餾水170ml重懸，66℃水浴30min,再加入90%苯酚溶液190ml,連續(xù)攪拌混合15min,4℃、10000g離心15min,用移液管吸取底層酚相，如酚相渾濁，使用濾紙過濾至溶液清亮。A.2.4向酚相中加入4℃預(yù)冷甲醇500ml(含5ml飽和醋酸鈉)沉淀LPS,混勻后4℃靜置2h。再4℃、10000g離心10min,棄上清液。A.2.5用80ml蒸餾水重懸沉淀物，4℃攪拌18h,4℃、10000g離心10min,取上清液置4℃保存。A.2.6沉淀物用80ml蒸餾水重懸沉淀物，4℃攪拌2h,4℃、10000g離心10min,取上清液置4℃保存。A.2.7合并2.6.項(xiàng)和2.7.項(xiàng)提取的上清液，加入8g三氯乙酸，4℃攪拌10min后，4℃、10000g離心10min,上清液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析3次。A.2.8取透析液冰浴超聲3次(約6瓦特),1min/次，121℃滅菌20min,按1ml/支精確分裝，凍干。A.2.9裝量測(cè)定：取5支LPS,分別稱重，計(jì)算裝量差異，重量差異范圍不得超過10%。計(jì)算平均重量作為標(biāo)示重量。A.3LPS檢驗(yàn)A.3.1裝量差異度測(cè)定：取5支LPS,分別稱重，計(jì)算裝量差異，與標(biāo)稱重量誤差不得超過5%。重量差異范圍不得超過10%。A.3.2無菌檢驗(yàn)：按中華人民共和國(guó)獸藥典《無菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)。A.3.3效價(jià)檢驗(yàn)：用5μg/ml的LPS包被ELISA板，100ul/孔。以iEL-CFA法測(cè)定，陽性對(duì)照血清OD450nm值應(yīng)≥1.0,陰性對(duì)照血清OD450nm值<0.3。6(規(guī)范性)取布魯氏菌S2滅活菌液，按中華人民共和國(guó)獸藥典《無菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢驗(yàn)，確認(rèn)無活菌后方可進(jìn)行后續(xù)操作。將布魯氏菌滅活菌液8000r/min離心10min,棄上清液，稱取濕菌體重量。用滅菌生理鹽免疫用動(dòng)物為兔或羊。兔首次免疫，用2ml免疫抗原與等量弗氏佐劑制成乳劑后背部皮下多點(diǎn)注射(羊首次免疫，用5ml免疫抗原與等量弗氏佐劑制成乳劑后腹股溝皮下多點(diǎn)注射)。首次免疫后2周，開始用不加佐劑的與首次等量免疫抗原皮下多點(diǎn)注射免疫，每次免疫間隔1周。第4次免疫開始，免疫前先采血，分離血清作凝集試驗(yàn)，當(dāng)效價(jià)到達(dá)1:800++或以上，則可以在15天后采集全部血液分離血清。用iEL-CFA標(biāo)定，當(dāng)OD值到達(dá)1.00以上陽性對(duì)照血清的最高稀釋度，則為陽性對(duì)照血清的使用值應(yīng)<0.3,符合規(guī)定即為合格的陰性對(duì)照血清。7T/CVMA288—2025 (規(guī)范性)補(bǔ)體的制備采集健康豚鼠血，提取血清即為備用補(bǔ)體。用樣品稀釋液將備用補(bǔ)體血清作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800稀釋，進(jìn)行iEL-CFA檢測(cè)補(bǔ)體C1q效價(jià)，OD450nm值不小于2.0時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為其效價(jià)，效價(jià)應(yīng)到達(dá)1:200以上。用補(bǔ)體保存液按效價(jià)適當(dāng)稀釋補(bǔ)體血清，使其效價(jià)為1:200。2℃~8℃保存。8(規(guī)范性)HRP標(biāo)記補(bǔ)體C1q抗體的制備D.1補(bǔ)體C1q抗體的制備D.1.1用親和層析法或免疫沉淀法等技術(shù)獲取豚鼠或適合動(dòng)物的高純度、高活性天然補(bǔ)體C1q。免疫適合動(dòng)物制備補(bǔ)體C1q抗體(以下以豚鼠補(bǔ)體C1q免疫羊?yàn)槔?。D.1.2每10ml豚鼠血清提取的補(bǔ)體Cl1q用2ml生理鹽水懸浮，與等量弗氏完全佐劑乳化后多點(diǎn)腹股溝皮下注射羊，每只4mL。初免21d后，每間隔一周免疫一次不加弗氏完全佐劑抗原，每只4mL。從第3次免疫開始，頸靜脈采血，用酶標(biāo)抗羊抗體作iEL-CFA法檢測(cè)血清效價(jià)，效價(jià)達(dá)1:5000以上后，頸靜脈采血，分離血清。D.1.3向高免血清中加入4倍體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液，再加入0.1mol/LNaOH調(diào)至pH4.5,于室溫下邊攪拌邊緩慢滴加正辛酸(每1L抗體稀釋液加入25mL),攪拌30min。10000r/min離心20min,收集上清夜，上清液用無菌濾膜過濾除去懸浮物并記錄其體積。按1/10上清液體積加入0.1mol/LPBS,用5mol/LNaOH調(diào)至pH7.4。4℃(冰浴)下邊攪拌邊按0.277g/mL加入硫酸銨，使終濃度達(dá)到45%飽和度，攪拌30min。5000r/min離心15min,棄去上清液，沉淀用少量透析液溶解后透析過夜，期間更換三次透析液。透析后抗體溶液10000r/min離心30min,得到上清液為純化的補(bǔ)體Clq抗體。D.2HRP標(biāo)記補(bǔ)體C1q抗體的制備D.2.1稱取10mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解于1mL蒸餾水中。加入0.2mL新配的0.1mol/LNaIO?溶液，室溫下避光攪拌20min。將上述溶液裝入透析袋中，用1mmol/LpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。然后加入20μL0.2mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5。醛化HRP溶液與用1ml0.01mol/L碳酸鹽緩沖液溶解的10mg抗體混合，室溫避光輕輕攪拌2h,加0.1mL新配的4mg/mLNaBH?液，混勻，再于4℃放置2h。將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15mol/LpH7.4PBS透析，4℃過夜。取透析液在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4℃靜置1h后，3000r/min離心30min,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨(用氨水調(diào)pH7.8)洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15mol/LpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(溶解液置透析袋內(nèi)，置50～100倍體積透析液內(nèi)進(jìn)行透析，4℃透析過夜，期間更換3次以上透析液，直至透析液用奈勒斯試劑檢測(cè)，透析液不出現(xiàn)變黃，透析結(jié)束)。10,000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為HRP標(biāo)記C1q抗體。D.2.2用iEL-CFA標(biāo)定效價(jià)。當(dāng)陰性對(duì)照血清OD450nm平均值≤0.30,試驗(yàn)成立，能使iEL-CFA強(qiáng)陽性對(duì)照血清OD?50nm值≥1.00的HRP標(biāo)記補(bǔ)體Clq抗體最高稀釋度為其效價(jià)，效價(jià)應(yīng)不低于1:5000。D.2.3加保護(hù)劑小劑量分裝后冷凍(-20℃)或冷藏保存。9(規(guī)范性)E.1.1包被緩沖液的制備。包被緩沖液為0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖2.93g,加雙蒸水800mL,攪拌溶解，加入10mlProclin300再加雙蒸水定容至1000mL。E.1.2封閉液制備。稱取Na?HPO?·12H?OE.1.3抗原包被。用抗原包被緩沖液溶解稀釋布魯氏菌LPS抗原，將抗原稀釋為5μg/mL,將稀釋后的LPS抗原以100μL/孔加入酶標(biāo)板中，封板，置2℃~8℃包被18h。甩掉孔中液體，密封包裝，置2℃~8℃保存。3001ml,加蒸餾水定容至1000ml,過濾除菌。無菌定量分