檸檬皮多酚提取及純化工藝的實(shí)證分析案例目錄TOC\o"1-3"\h\u29209檸檬皮多酚提取及純化工藝的實(shí)證分析案例 1118661.1材料與設(shè)備 2182821.1.1材料與試劑 2305821.1.2儀器與設(shè)備 219331.2試驗(yàn)方法 31931.2.1檸檬皮多酚樣品制備 3148901.2.2檸檬皮多酚含量的測定 3313801.2.3檸檬皮多酚提取的單因素試驗(yàn) 482761.2.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 4131351.2.5最佳大孔樹脂的選擇 45421.2.6大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化 52861.2.7大孔樹脂的動態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化 5311751.3數(shù)據(jù)處理 6181791.4結(jié)果與討論 6125681.4.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 6223141.4.2超聲波法提取檸檬皮多酚的單因素結(jié)果 6273791.4.3Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波法提取檸檬皮多酚的工藝條件 10176091.4.4檸檬皮多酚的大孔樹脂純化結(jié)果 15169341.4.5AB-8大孔樹脂樹脂靜態(tài)吸附與解析結(jié)果 1525901.4.6AB-8大孔樹脂樹脂動態(tài)吸附與解析結(jié)果 16檸檬皮中含有豐富的多酚類物質(zhì)，目前主要的活性成分提取的方法有超臨界流體萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取等方法。超聲波具有高頻率、強(qiáng)穿刺力、能量大且集中等特性，可以替代時(shí)間較長且提取效率較低的傳統(tǒng)的溶劑萃取法[86]。提取樣品時(shí)，會發(fā)生空化效應(yīng)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，使有效成分從細(xì)胞中擴(kuò)散出來，并在溶劑中溶解。超聲波法和溶劑提取法一起作用，具有時(shí)間短，效率高的特點(diǎn)。同時(shí)，提取物結(jié)構(gòu)和性能經(jīng)超聲波處理后不會有太大改變，成本低、高效率、耗時(shí)短的環(huán)境友好型提取方法，適用于檸檬皮等的物料提取，經(jīng)過溶劑提取法得到檸檬皮多酚粗提物中含有較多雜質(zhì)，為了得到高純度的多酚，需要進(jìn)行的純化。目前有柱層析法、膜分離技術(shù)、半制備液相色譜法等，應(yīng)用廣泛的純化技術(shù)[87]，在溶劑提取后采用操作簡單、高效的大孔樹脂技術(shù)對粗提液進(jìn)行分離純化，得到純度高的檸檬皮多酚。材料與設(shè)備材料與試劑原材料：檸檬購買于海南，本章所需主要試劑見表2-1。表2-1主要試劑Tab.2-1Mainreagents名稱等級生產(chǎn)廠家福林酚分析純上海源葉生物科技有限公司無水乙醇分析純天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司濃鹽酸分析純天津市耀華化學(xué)試劑責(zé)任公司沒食子酸分析純上海源葉生物科技有限公司氫氧化鈉分析純天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司無水碳酸鈉分析純天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司大孔樹脂AB-8--天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司大孔樹脂HPD-100--天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司大孔樹脂D101--天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司大孔樹脂NKA-2--天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司儀器與設(shè)備本章使用儀器見表2-2表2-2試驗(yàn)儀器設(shè)備Tab.2-2Experimentalapparatus儀器名稱型號廠家紫外可見分光光度計(jì)UV1800上海棱光技術(shù)有限公司真空冷凍干燥機(jī)FDU-1100日本東京理化儀器有限公司電子天平JJ200型電子天平美國雙杰兄弟有限公司離心機(jī)LD5-2B北京京立離心機(jī)有限公司超聲波清洗器KQ-250DE昆山市超聲儀器有限公司萬能粉碎機(jī)FW100北京市永光明醫(yī)療儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-25AA上海亞榮生化有限公司搖床BSD-TX345上海啟閔生物技術(shù)有限公司試驗(yàn)方法檸檬皮多酚樣品制備剝皮剝皮濃縮離心浸提凍干干燥提取物圖2-1多酚樣品制備流程圖Fig.2-1Flowchartofpolyphenolsamplepreparation將檸檬皮冷凍干燥后，進(jìn)行粉碎過60目篩。以料液比1:40（g/mL）加入60%乙醇，在50°C超聲下提取45min后，5000g離心10min，取上清液，殘?jiān)俅翁崛?，重?fù)3次，合并上清液減壓濃縮，用蒸餾水定容至100mL，搖勻，備用。檸檬皮多酚含量的測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用Folin-Ciocalteu法[88]對檸檬皮多酚的含量進(jìn)行測定，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試管中加入0.5mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、4.5mL蒸餾水、0.5mL福林酚試劑，混合均勻后，加入1mL0.5mol/L碳酸鈉溶液，室溫避光放反應(yīng)1h后，于765nm處測定吸光度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。（2）供試品的測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法一致，將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液換為待測樣品，用蒸餾水作空白，于765nm處測定吸光度，按公式1.1進(jìn)行計(jì)算。多酚提取量（mg/g）=（1.1）v——試樣定容體積ml；c——為由粗提液測定吸光值后，在標(biāo)曲中計(jì)算所對應(yīng)沒食子酸質(zhì)量濃度，單位：mg/ml；n——稀釋倍數(shù)；m——樣品量；單位：g檸檬皮多酚提取的單因素試驗(yàn)乙醇濃度對檸檬皮多酚提取量的影響固定料液比1:40、50°C超聲波提取時(shí)間45min，考察55%、60%、65%、70%、75%的乙醇對檸檬皮多酚提取量的影響。提取時(shí)間對檸檬皮多酚提取量的影響固定料液比1:40、乙醇濃度60%，考察50°C超聲波提取分別提取35min、40min、45min、50min、55min對檸檬皮多酚提取量的影響。料液比對檸檬皮中多酚提取量的影響固定乙醇濃度60%、50°C超聲波提取時(shí)間45min，考察料液比1:40、1:50、1:60、1:70、l:80對檸檬皮多酚提取量的影響。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析響應(yīng)面的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行，依據(jù)單因素和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取三個(gè)因素：A：提取時(shí)間、B：醇濃度、C：料液比為響應(yīng)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。如表2-3所示為試驗(yàn)因素與水平。表2-3Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Tab2-3FactorsandlevelsusedinBox-Behnken因素水平A提取時(shí)間（min）B乙醇濃度（%）C料液比(g/mL)-140651:50045701:60150751:70最佳大孔樹脂的選擇分別對D101、AB-8、HPD-100、NKA-2這四種大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理后，分別加入50mL、pH=2、一定濃度的檸檬皮多酚粗提液，在30℃、100r/min的搖床中密封避光震蕩4h進(jìn)行吸附，取濾液按2.2.2方法測定其多酚含量。進(jìn)而計(jì)算樹脂的吸附率。將上述吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗凈后，加入50mL一定濃度的乙醇在30℃、100r/min的搖床中密封避光震蕩4h進(jìn)行解析，取濾液按2.2.2方法測定其多酚含量。計(jì)算樹脂的解析率。吸附率（%）=（1.2）解吸率（%）=（1.3）式中：A——多酚稀釋前的吸光值；A1——吸附完全后洗液的吸光值；A-A1——多酚被吸附的吸光值；大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化上樣液濃度確定稱取5份經(jīng)預(yù)處理的最佳樹脂，固定檸檬皮多酚添加量50mL，探究pH=2濃度為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL檸檬皮多酚在在30℃、100r/min的搖床中密封避光震蕩4h進(jìn)行吸附的吸附率。解析液濃度確定稱取5份吸附飽和后的樹脂，固定乙醇添加量50mL，探究濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在30℃、100r/min的搖床中密封避光震蕩4h進(jìn)行解析的解吸率。大孔樹脂的動態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化上樣流速確定在層析柱中加入一定量（約為柱高的三分之二）的預(yù)處理好的大孔樹脂，用蒸餾水將樹脂壓實(shí)，分別以1.0mL/min、2.0mL/min、3.0mL/min，的流速向?qū)游鲋屑尤霛舛葹?mg/mL的檸檬皮多酚粗提液進(jìn)行動態(tài)吸附，每流出10mL流出液，測定其多酚含量，繪制上樣曲線。洗脫流速的確定以2.0mL/min的速度用蒸餾水將動態(tài)吸附飽和的層析柱沖洗干凈，直至無有色溶液流出后，分別為1.0mL/min、2.0mL/min、3.0mL/min的速度，加入80%的乙醇溶液進(jìn)行動態(tài)洗脫，每流出10mL流出液，測定其多酚含量，繪制洗脫曲線。數(shù)據(jù)處理SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（圖中用不同字母標(biāo)注差異顯著性），用OriginPro8.5作圖，響應(yīng)面的分析和作圖用Design-Expert8.0.6軟件。結(jié)果與討論沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線依照2.2.2繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2-2所示，線性方程為y=5.6091x-0.0044，R2=0.999，線性關(guān)系良好。圖2-2沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-2Gallicacidstandardcurve超聲波法提取檸檬皮多酚的單因素結(jié)果乙醇濃度對檸檬皮多酚提取的影響在控制提取時(shí)間，料液比的條件下只改變乙醇體積分?jǐn)?shù)，而在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的多酚提取量如圖2-3所示。圖2-3溶劑體積分?jǐn)?shù)對檸檬皮多酚提取的影響Fig.2-2Effectofsolventvolumefractiononextractionofpolyphenolsfromlemonpeel注:不同字母表示差異顯著性（P<0.05）根據(jù)圖2-3所知，隨著乙醇濃度的不斷增加，檸檬皮多酚的含量呈現(xiàn)先增加后降低的情況，乙醇濃度在50%-70%之間上升趨勢明顯，在70%-75％呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，引起這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是過高乙醇濃度破壞了檸檬皮多酚的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[89]，在乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)檸檬皮多酚的合量達(dá)到最高。因此選擇65%、70%、75%，為后續(xù)進(jìn)行響應(yīng)面提取的條件。提取時(shí)間對檸檬皮多酚提取的影響在控制乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比條件不變時(shí)，只改變提取時(shí)間，在不同提取時(shí)間下多酚提取量如圖2-4所示。圖2-4提取時(shí)間對檸檬皮多酚提取的影響Fig.2-4Effectofextractiontimeonpolyphenolextractionfromlemonpeel注:不同字母表示差異顯著性（P<0.05）結(jié)果如圖2-4所示，在34-45min時(shí)，檸檬皮多酚含量隨時(shí)間的增加而增加，可能是因?yàn)樵谝欢ǖ臅r(shí)間范圍內(nèi)，多酚含量與提取時(shí)間成正比；當(dāng)提取時(shí)間為45min時(shí)，檸檬皮多酚含量最高達(dá)到峰值；而在45-55min時(shí)，檸檬皮多酚含量隨時(shí)間增加而下降，導(dǎo)致多酚在長時(shí)間的高溫狀態(tài)，會發(fā)生氧化分解導(dǎo)致含量降低。因此選擇40min、45min、50min，為后續(xù)進(jìn)行響應(yīng)面提取的條件。料液比對檸檬皮的多酚提取的影響在控制乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間條件不變時(shí)，只改變料液比的條件下，不同料液比下多酚提取量如圖2-5所示。圖2-5料液比對檸檬皮多酚提取的影響Fig.2-5Effectofsolid-liquidratioonextractionofpolyphenolsfromlemonpeel注:不同字母表示差異顯著性（P<0.05）由圖2-5可以看出，在1:40（g/mL）到1:60（g/mL）的料液比范圍之中時(shí)，多酚的含量增加，繼續(xù)增加料液比時(shí)，檸檬皮中多酚的含量呈下降趨勢。所以當(dāng)料液比過大時(shí)，多酚的提取量不僅不會增加，而且還會造成資源的大量浪費(fèi)。因此選擇料液比為1:50、1:60、1:70（g/mL），為后續(xù)進(jìn)行響應(yīng)面提取的條件。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波法提取檸檬皮多酚的工藝條件響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓敖Y(jié)果用Design-Expert8.0.6軟件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取檸檬皮中的多酚提取量三個(gè)因素：A：溶提取時(shí)間、B：乙醇濃度、C：料液比為響應(yīng)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)的方案與所得的試驗(yàn)結(jié)果見表2-4，方差分析見表2-5。表2-4Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2-4Box-Behnkendesignwiththeobservedresponses試驗(yàn)號A提取時(shí)間（min）B乙醇濃度（%）C料液比(g/ml)多酚含量（mg/g)1-10-15.6320006.2430006.174-1105.6550006.2960115.6370006.4280-115.5491015.2310-1015.42110006.261210-15.5113-1-105.661401-15.95150-1-15.67161-105.77171105.76表2-4中數(shù)據(jù)采用Design-expert8.0.6進(jìn)行回歸擬合，得出提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比3個(gè)因素對檸檬皮多酚提取量的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=6.28-0.011×A+0.044×B-0.12×C-0.017×A×C-0.048×B×C-0.41×A2-0.16×B2-0.42×C2，回歸模型方差分析見表2-5。根據(jù)表2-5可知，P<0.01模型差異極顯著，F(xiàn)值為2.15，P=0.2396，失擬項(xiàng)不顯著，因此回歸方程屬于小誤差試驗(yàn)，有較高的可信度。回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9543，多酚含量與模型預(yù)測結(jié)果吻合，因此該模型優(yōu)化出的檸檬皮多酚的提取工藝條件合理。三個(gè)單因素對檸檬皮多酚提取量的影響程度為：C>B>A，即料液?對檸檬皮多酚提取量影響最大，其次是乙醇濃度和提取時(shí)間。表2-5二次回歸方程模型方差分析Tab.2-5ANOVAfortheregressionmodel方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型1.8490.2016.250.0007極顯著A-提取時(shí)間1.013E-00311.013E-0030.0800.7848B-乙醇濃度0.01510.0151.220.3063C-料液比0.1110.118.780.0210AB0.00010.0000.0001.0000AC1.225E-00311.225E-0030.0970.7641BC9.025E-00319.025E-0030.720.4250A20.7010.7055.720.0001B20.1110.118.360.0233C20.7410.7459.190.0001殘差0.08870.013失擬項(xiàng)0.05430.0182.150.2369不顯著誤差項(xiàng)0.03448.430E-003總和1.9316R2=0.9543響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化圖2-6、圖2-7和圖2-8為模型的等高線圖和響應(yīng)面圖。通過A、B、C三因素和響應(yīng)值構(gòu)成的曲面圖，可看出各因素對其響應(yīng)值的影響，響應(yīng)值的變化越大，該因素對提取量的影響就越大。圖2-6提取時(shí)間和乙醇濃度交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2-6Extractcontourmapandresponsesurfacemapofinteractionbetweentimeandethanolconcentration由圖2-6可知，提取時(shí)間和乙醇濃度的曲面的弧度較小，表明提取時(shí)間和乙醇濃度對檸檬皮多酚提取量變化不大；圖2-7提取時(shí)間和料液比交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2-7Extractthecontourmapandresponsesurfacemapoftimeandmaterial-liquidratiointeraction由圖2-7可知提取時(shí)間和料液比的響應(yīng)曲面的弧度較大，因此這兩個(gè)因素對多酚提取量的作用明顯；圖2-8乙醇濃度和料液比交互作用等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2-8Contourmapandresponsesurfacemapofinteractionbetweenethanolconcentrationandsolid-liquidratio由圖2-8可知乙醇濃度和料液比響應(yīng)面的弧度最大，說明乙醇濃度和料液比對多酚提取量的響應(yīng)值作用最明顯。響應(yīng)面結(jié)果與表2-5中的方差分析結(jié)果相吻合。采用Design-expert8.0.6軟件對模型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，預(yù)測條件為：提取時(shí)間48.88min、乙醇濃度70.74%、料液比1:58.53，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為：提取時(shí)間49min、乙醇濃度71%、料液比1:59，此條件下檸檬皮中的多酚的提取量為6.08mg/g。左龍亞等[90]通過5種不同的溶劑對北京檸檬和尤力克檸檬的果皮多酚進(jìn)行提取，得出的提取物多酚含量在（1.88±0.07）~（24.94±0.50）mg/g范圍內(nèi)，與試驗(yàn)結(jié)果相符，說明不同類型的檸檬皮多酚含量基本穩(wěn)定在同一范圍內(nèi)；柳偉[91]等對12種水果果皮多酚進(jìn)行提取，得出檸檬皮多酚含量為5.24mg/g；本試驗(yàn)通過對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，與其比較使檸檬皮的提取量提高了16.03%。檸檬皮多酚的大孔樹脂純化結(jié)果最佳樹脂的篩選比較四種大孔樹脂吸附率和解吸率，選擇最佳純化的大孔樹脂，表2-6為樹脂的吸附率和解吸率結(jié)果，從表中得知弱極性的AB-8樹脂對檸檬皮多酚的解析率最高，為86.17%，且吸附率也較高為81.40%。所以選擇AB-8大孔樹脂對檸檬皮多酚進(jìn)行純化。表2-6四種型號樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果Tab2-6Theresultoffourmodelsresinstaticadsomtionanddesorotion樹脂型號極性孔徑（A）比表面（m2/g）吸附率（%）解析率（%）D101非極性90-110500-55072.76±1.2%63.84±0.98%HPD-100非極性90-100650-70068.64±0.99%59.07±0.85%NKA-2極性145-155160-20062.58±0.77%51.14±1.0%AB-8弱極性130-140480-52081.40±0.82%86.17±0.76%AB-8大孔樹脂樹脂靜態(tài)吸附與解析結(jié)果AB-8樹脂靜態(tài)吸附上樣液濃度的確定從圖2-9中可以看出上樣液濃度決定AB-8樹脂吸附率的大小，當(dāng)上樣液濃度為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，吸附率先升高后降低，當(dāng)濃度為3mg/mL時(shí)，吸附率最高。當(dāng)上樣液濃度過高時(shí)，會使多酚過早的泄露，使樹脂吸附的多酚含量變少，當(dāng)上樣液濃度過低時(shí)，會使反應(yīng)時(shí)間延長，降低效率[92]，故選擇3mg/mL為最佳上樣液濃度。圖2-9上樣液濃度與吸附率的關(guān)系Fig.2-9Therelationshipbetweensampleconcentrationandadsorptionrate注:不同字母表示差異顯著性AB-8樹脂靜態(tài)解析解析液濃度的確定乙醇是大孔樹脂常用的洗脫液，因?yàn)橐掖紵o毒無害且好去除[93]，從圖2-10中可看出當(dāng)乙醇濃度小于70%時(shí)，解析率逐漸升高，當(dāng)繼續(xù)增大乙醇濃度時(shí)，解析率下降，因此70%的乙醇溶液為最佳解析液濃度。圖2-10解析液濃度與解析率的關(guān)系Fig.2-10Therelationshipbetweenanalyticalco