免疫學(xué)實驗?zāi)０嬉?、免疫學(xué)實驗概述

免疫學(xué)實驗是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與病原體、腫瘤等相互作用的重要手段。通過實驗，可以驗證免疫學(xué)理論、開發(fā)診斷試劑、評估免疫治療效果等。本模板旨在提供免疫學(xué)實驗的基本流程、常用技術(shù)和注意事項，確保實驗操作的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。

二、實驗準(zhǔn)備

（一）實驗材料

1.試劑：抗體、抗原、酶標(biāo)底物、緩沖液等。

2.儀器：酶標(biāo)儀、離心機、培養(yǎng)箱、移液器等。

3.樣本：血液、組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物等。

（二）實驗環(huán)境

1.保持無菌：實驗臺面需定期消毒，操作時佩戴手套和口罩。

2.溫度控制：細(xì)胞培養(yǎng)和酶反應(yīng)需在37℃恒溫條件下進(jìn)行。

3.濕度調(diào)節(jié)：實驗室濕度應(yīng)維持在50%-60%，避免試劑揮發(fā)。

（三）實驗前檢查

1.試劑效期：確保所有試劑在有效期內(nèi)使用。

2.儀器校準(zhǔn)：酶標(biāo)儀、離心機等需定期校準(zhǔn)，保證讀數(shù)準(zhǔn)確。

3.人員培訓(xùn)：操作人員需熟悉實驗步驟和應(yīng)急處理方法。

三、常用免疫學(xué)實驗技術(shù)

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

1.**樣本處理**：

(1)血清樣本需離心去除細(xì)胞碎片。

(2)組織樣本需勻漿后離心取上清液。

2.**實驗步驟**：

(1)包被：將抗原或抗體包被于酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

(2)封閉：用封閉液封閉非特異性位點，37℃1小時。

(3)結(jié)合：加入待測樣本，37℃1小時。

(4)顯色：加入酶標(biāo)底物，避光反應(yīng)30分鐘。

(5)定量：酶標(biāo)儀檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

3.**注意事項**：

(1)避免交叉污染，每步操作更換吸頭。

(2)溫度需嚴(yán)格控制，避免影響結(jié)合效率。

（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

1.**細(xì)胞制備**：

(1)血液樣本需用肝素抗凝。

(2)組織樣本需消化酶解后過濾去除碎片。

2.**實驗步驟**：

(1)染色：加入熒光標(biāo)記抗體，冰浴避光30分鐘。

(2)上機檢測：用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗體表達(dá)。

(3)數(shù)據(jù)分析：用軟件繪制細(xì)胞直方圖和門控分析。

3.**注意事項**：

(1)染色濃度需優(yōu)化，避免信號飽和。

(2)設(shè)門要合理，確保分析目標(biāo)細(xì)胞群體。

（三）WesternBlot

1.**樣本處理**：

(1)細(xì)胞或組織用裂解液提取總蛋白。

(2)BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。

2.**實驗步驟**：

(1)電泳：SDS分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

(2)封閉：用封閉液封閉膜表面，4℃過夜。

(3)一抗：加入特異性抗體，室溫孵育1小時。

(4)二抗：加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1小時。

(5)顯色：用ECL底物化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)條帶。

3.**注意事項**：

(1)電泳電壓需穩(wěn)定，避免條帶彌散。

(2)一抗?jié)舛刃杼荻葍?yōu)化，提高特異性。

四、實驗數(shù)據(jù)記錄與處理

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗條件：記錄試劑品牌、濃度、反應(yīng)時間等關(guān)鍵參數(shù)。

2.定量結(jié)果：記錄吸光度、熒光強度等原始數(shù)據(jù)。

3.質(zhì)量控制：記錄膜條帶完整性、背景信號等指標(biāo)。

（二）數(shù)據(jù)分析

1.ELISA數(shù)據(jù)：用Excel擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度（示例：線性范圍0.1-100ng/mL）。

2.FCM數(shù)據(jù)：用FACS軟件分析細(xì)胞比例（示例：陽性細(xì)胞率≥95%）。

3.WesternBlot數(shù)據(jù)：用ImageJ軟件定量條帶灰度值。

（三）結(jié)果報告

1.描述實驗現(xiàn)象：如抗體結(jié)合強度與濃度呈正相關(guān)。

2.統(tǒng)計學(xué)分析：用t檢驗或ANOVA比較組間差異（P<0.05為顯著）。

3.結(jié)論建議：根據(jù)結(jié)果提出進(jìn)一步實驗方向。

五、實驗安全與廢棄物處理

（一）個人防護

1.佩戴實驗服、護目鏡，必要時穿手套。

2.高風(fēng)險操作需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

（二）廢棄物處理

1.液體廢棄物需用專用容器收集，定期高壓滅菌。

2.化學(xué)試劑需分類存放，避免混合。

（三）應(yīng)急措施

1.試劑濺濺到皮膚需立即用大量清水沖洗。

2.儀器故障需立即斷電并報告維修。

六、總結(jié)

免疫學(xué)實驗涉及技術(shù)多樣，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。本模板通過系統(tǒng)化流程設(shè)計，可幫助實驗者高效完成實驗并確保數(shù)據(jù)可靠性。后續(xù)需結(jié)合具體項目需求，進(jìn)一步優(yōu)化實驗方案。

**二、實驗準(zhǔn)備（續(xù)）**

（一）實驗材料（續(xù)）

1.試劑（續(xù)）：

***抗體：**

*一抗：根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇特異性抗體，注明宿主來源（如兔源、鼠源）、克隆/多克隆類型、純度等級（如IgG純化）、存儲條件（如-20℃或-80℃）。需提供抗體說明書，包括推薦工作濃度、阻斷劑建議（如脫脂奶粉、BSA）。

*二抗：選擇與一抗宿主來源匹配的酶標(biāo)或熒光標(biāo)記二抗（如辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG）。同樣需注明存儲條件、工作濃度、是否需要封閉。

*標(biāo)記物：除二抗外，還可能使用熒光標(biāo)記抗體（如AlexaFluor系列、PE、Cy7）、生物素標(biāo)記抗體等，需明確標(biāo)記類型、熒光通道、工作濃度。

***抗原：**

*包被抗原：可以是純化蛋白、多肽片段或重組蛋白，需提供純度證明和序列信息。若為組織抗原，需說明組織來源和固定方法。

*內(nèi)參照抗原：常用β-actin、GAPDH等，用于標(biāo)準(zhǔn)化樣本表達(dá)水平。

***酶標(biāo)底物：**根據(jù)二抗標(biāo)記的酶選擇（HRP用TMB或DAB，AP用NBT/BCIP），注明推薦反應(yīng)時間、終止液（如H?SO?或HCl）。

***緩沖液：**

*標(biāo)準(zhǔn)緩沖液：Tris-HCl緩沖液（pH7.4-8.0）、PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液）、TBS（Tris緩沖鹽溶液）。

*特殊緩沖液：封閉液（如5%脫脂奶粉TBST）、洗滌液（0.05%Tween-20PBST/TBS）、抗體稀釋液（如0.1-0.5M碳酸鈉緩沖液pH9.6，用于蛋白A/G包被）。

***其他：**過氧化物酶抑制劑（如疊氮化鈉、甲苯胺藍(lán)，用于ELISA抑制內(nèi)源性過氧化物酶）、BSA（牛血清白蛋白，用于封閉）、甘氨酸（用于SDS）。

2.儀器（續(xù)）：

***移液器：**精確到0.1μL或1μL的移液器，需定期校準(zhǔn)，根據(jù)不同體積選擇合適量程（如10-100μL用200μL移液器）。

***混勻器/磁力攪拌器：**用于試劑混合、細(xì)胞懸液制備，確保充分混勻。

***水浴鍋/恒溫金屬浴：**精確控溫（如37℃、4℃、-20℃、-80℃），用于抗體孵育、酶反應(yīng)等。

***高壓滅菌鍋：**用于培養(yǎng)基、緩沖液、廢棄物的滅菌。

***超純水器/去離子水：**提供符合實驗要求的純水。

***pH計：**用于精確測量和調(diào)節(jié)緩沖液pH值。

***離心機：**低速離心機（如4000-10000rpm）、高速冷凍離心機，需明確最大轉(zhuǎn)速/相對離心力（RCF），并校準(zhǔn)轉(zhuǎn)子。

***電泳設(shè)備：**SDS電泳系統(tǒng)（含電泳槽、電源）、轉(zhuǎn)膜設(shè)備（PVDF膜或NC膜、轉(zhuǎn)膜槽、冰?。?/p>

***凝膠成像系統(tǒng)：**用于WesternBlot結(jié)果成像，可配置化學(xué)發(fā)光或熒光成像系統(tǒng)。

***酶標(biāo)儀/微孔板讀取儀：**用于ELISA等檢測吸光度值，需定期用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。

***流式細(xì)胞儀：**用于FCM檢測，需校準(zhǔn)熒光通道和細(xì)胞計數(shù)。

***生物安全柜/超凈工作臺：**用于無菌操作，需定期進(jìn)行泄漏測試和表面消毒。

***培養(yǎng)箱：**CO?培養(yǎng)箱（控制溫度、濕度和CO?濃度）、普通恒溫培養(yǎng)箱。

***顯微鏡：**用于細(xì)胞觀察、組織切片觀察。

3.樣本（續(xù)）：

***細(xì)胞樣本：**提供細(xì)胞系名稱、來源（如ATCC）、傳代次數(shù)、凍存/培養(yǎng)狀態(tài)。若為組織樣本，需注明組織類型、來源（如腫瘤組織、正常組織）、固定液（如4%多聚甲醛）、脫水液（如乙醇）、包埋劑（如石蠟）。

***樣本處理：**提供詳細(xì)的樣本前處理流程，如細(xì)胞裂解（使用裂解緩沖液，含蛋白酶抑制劑）、組織勻漿（使用組織研磨液）、蛋白定量（BCA、Bradford法）。

（二）實驗環(huán)境（續(xù)）

1.**無菌操作：**

*操作前：進(jìn)行手部消毒，穿戴干凈實驗服、口罩、無菌手套。

*工作臺面：使用70-75%酒精擦拭工作臺面，靜置30分鐘進(jìn)行空間消毒。

*環(huán)境監(jiān)測：定期使用生物指示劑或孢子計數(shù)器監(jiān)測超凈工作臺或生物安全柜的滅菌效果。

*無菌物品：確保移液器頭、吸頭、無菌耗材等在有效期內(nèi)，并正確儲存。

2.**溫度控制（續(xù)）：**

*細(xì)胞培養(yǎng)：37℃、5%CO?為標(biāo)準(zhǔn)條件，需監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度和CO?濃度，每日校準(zhǔn)。

*酶反應(yīng)：通常在37℃進(jìn)行，需使用恒溫設(shè)備，反應(yīng)時間需精確控制。

*冷凍樣本：-20℃或-80℃冰箱溫度需定期監(jiān)測，避免溫度波動影響樣本活性。

3.**濕度調(diào)節(jié)（續(xù)）：**

*實驗室濕度：維持在40%-60%，過高可能導(dǎo)致試劑吸潮，過低可能引起靜電干擾（尤其流式細(xì)胞術(shù)）。

*防潮措施：對易吸潮試劑（如干燥型試劑）使用密封包裝。

（三）實驗前檢查（續(xù)）

1.試劑效期（續(xù)）：建立試劑臺賬，標(biāo)注入庫日期和有效期，優(yōu)先使用近期生產(chǎn)試劑。檢查試劑標(biāo)簽是否完整、清晰，有無變色、沉淀、渾濁等異?，F(xiàn)象。關(guān)鍵試劑（如抗體、酶標(biāo)底物）建議使用新鮮配制或小量分裝冷凍。

2.儀器校準(zhǔn)（續(xù)）：除了定期校準(zhǔn)，每次使用前需檢查儀器狀態(tài)，如酶標(biāo)儀的光路是否清潔、讀數(shù)是否穩(wěn)定；離心機的轉(zhuǎn)子是否安裝正確、轉(zhuǎn)速顯示是否準(zhǔn)確；流式細(xì)胞儀的液面高度是否合適、鞘流是否穩(wěn)定。

3.人員培訓(xùn)（續(xù)）：新操作人員必須經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)，包括：

*實驗原理和目的。

*每一步操作的具體方法和注意事項（如移液技巧、孵育時間、溫度要求）。

*儀器使用和基本故障排除。

*實驗記錄規(guī)范和廢棄物處理要求。

*安全操作規(guī)程和應(yīng)急預(yù)案。

*建議進(jìn)行實際操作考核，確保持證上崗。

**三、常用免疫學(xué)實驗技術(shù)（續(xù)）**

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（續(xù)）

1.**樣本處理（續(xù)）：**

***細(xì)胞因子：**需根據(jù)說明書進(jìn)行細(xì)胞刺激（如LPS、PMA刺激）、裂解或收集上清。若樣本含高濃度鹽分，可能需要透析或稀釋。

***血清/血漿：**分離后可直接使用，或根據(jù)需要稀釋。

***組織樣本：**除了勻漿和離心，對于石蠟包埋組織，需進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)（如熱修復(fù)或酶修復(fù)）等步驟，以暴露抗原決定簇。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***包被（續(xù)）：**

*用包被緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS或Tris-HCl）將抗原稀釋至合適濃度（通常1-10μg/mL）。

*100μL/孔加入酶標(biāo)板，4℃過夜（或37℃2-4小時）。

*次日吸去液體，不吸干，用包被緩沖液洗滌3次（每次5-10分鐘）。

***封閉（續(xù)）：**

*加入封閉液（如5%BSA-TBST或5%脫脂奶粉-TBST），37℃1-2小時，或4℃過夜。

*吸去液體，洗滌3次。

***結(jié)合（續(xù)）：**

*用抗體稀釋液（如0.1M碳酸鈉緩沖液pH9.6，或TBST）將一抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1-10μg/mL）。

*100μL/孔加入，37℃孵育1小時，或4℃過夜。

*吸去液體，洗滌3-5次（關(guān)鍵步驟，用TBST洗滌）。

***結(jié)合二抗（續(xù)）：**

*用抗體稀釋液（如TBST）將HRP標(biāo)記二抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:1000-1:5000）。

*100μL/孔加入，37℃孵育1小時。

*吸去液體，洗滌5次（徹底洗滌，減少背景）。

***顯色（續(xù)）：**

*用底物緩沖液（如100mM檸檬酸緩沖液pH5.0或Tris-HCl緩沖液pH7.6）將TMB底物稀釋至工作濃度（按說明書或預(yù)實驗優(yōu)化）。

*100μL/孔加入，避光反應(yīng)15-30分鐘（時間需根據(jù)OD值變化速率調(diào)整）。

*可在反應(yīng)過程中用酶標(biāo)儀每隔幾分鐘檢測一次吸光度，監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。

***終止（續(xù)）：**

*加入終止液（如2MH?SO?或HCl），100μL/孔，終止酶促反應(yīng)。

*混勻，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。必要時可設(shè)置參考波長（如630nm）扣除背景。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***抗體濃度優(yōu)化：**一抗和二抗工作濃度需通過預(yù)實驗（如棋盤格法）確定最佳稀釋倍數(shù)，平衡敏感度和特異性。

***溫度和時間：**嚴(yán)格按說明書和優(yōu)化后的條件控制孵育溫度和時間，過高或過低、過長或過短均影響結(jié)果。

***洗滌：**洗滌是降低背景的關(guān)鍵，必須使用洗板機確保洗滌一致性和徹底性。洗滌次數(shù)和每次洗滌時間需優(yōu)化。

***蒸發(fā)：**孵育間隙或洗滌后若板內(nèi)液體蒸發(fā)過多，需用封閉液或TBST潤洗1-2次，防止板底干燥影響結(jié)合。

***質(zhì)控：**每次實驗需設(shè)置陰性對照（未加一抗或一抗用封閉液代替）、陽性對照（已知陽性樣本）、空白對照（不加任何試劑），用于評估實驗的特異性和靈敏度。

（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）（續(xù)）

1.**細(xì)胞制備（續(xù)）：**

***白細(xì)胞：**外周血需用肝素抗凝（避免EDTA等影響鈣離子）。通過密度梯度離心（如Ficoll-Paque）分離單個核細(xì)胞（PBMC）。淋巴細(xì)胞分離液對紅細(xì)胞和粒細(xì)胞有密度差，可有效分離出純度較高的淋巴細(xì)胞群體。

***組織細(xì)胞：**除了消化酶（如膠原酶、胰蛋白酶），可能需要組織研磨器或高壓勻漿輔助。消化后需用密度梯度離心或尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞碎片。

***細(xì)胞計數(shù)與活力檢測：**制備好的細(xì)胞需進(jìn)行計數(shù)（如使用血細(xì)胞計數(shù)板或細(xì)胞計數(shù)儀）和活力檢測（如臺盼藍(lán)染色法，要求活力>95%）。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***細(xì)胞固定（可選）：**對于某些表面標(biāo)志物，細(xì)胞需在染色前進(jìn)行固定（如4%多聚甲醛或甲醇），以穩(wěn)定細(xì)胞膜和抗原。固定后可能需要滲透化（如0.1%TritonX-100）。

***染色（續(xù)）：**

***直接染色：**用直接標(biāo)記的熒光抗體（如PE、AlexaFluor488/647）標(biāo)記細(xì)胞表面或胞外蛋白，通常在4℃冰箱避光孵育30分鐘。

***間接染色：**先用未標(biāo)記的一抗（如鼠抗人CD3）室溫孵育30分鐘，再用熒光標(biāo)記的二抗（如羊抗鼠PE-Cy7）孵育30分鐘。注意封閉（如用小鼠IgG封閉非特異性結(jié)合位點）和洗滌。

***胞內(nèi)染色：**若需檢測胞內(nèi)蛋白（如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子），需用細(xì)胞穿孔劑/固定劑（如Paraformaldehyde+Cytofix/Cytoperm）處理細(xì)胞，使抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。染色后需用封閉劑封閉非特異性位點。

***抗體組合：**同時檢測多個標(biāo)志物時，需優(yōu)化抗體組合，避免熒光串色?？墒褂貌煌瑹晒馔ǖ赖目贵w，并在不同溫度（如4℃直接染色，室溫間接染色）下進(jìn)行。

***上機檢測（續(xù)）：**

*用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。需設(shè)置合適的激光激發(fā)波長和熒光檢測通道，以匹配所用熒光染料的發(fā)射光譜。

***設(shè)定門控：**根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)初步去除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞（如設(shè)置FSC/SSC閾值），然后根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞群的特征（如特定標(biāo)志物陽性）設(shè)立門控區(qū)域，確保分析的是目標(biāo)細(xì)胞群體。

***采集參數(shù)：**設(shè)置采集事件數(shù)（如10000個事件），調(diào)整PMT電壓，確保熒光信號采集在線性范圍內(nèi)。

***數(shù)據(jù)分析（續(xù)）：**

***數(shù)據(jù)導(dǎo)出：**實驗結(jié)束后導(dǎo)出FCS原始數(shù)據(jù)文件和相應(yīng)的列表文件（ListFile）。

***軟件分析：**使用FlowJo、FCSExpress等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

***散點圖：**查看細(xì)胞群體分布，如FSCvsSSC初步看細(xì)胞質(zhì)和核，不同熒光標(biāo)記抗體繪制雙參數(shù)圖（如CD3vsCD4）或三參數(shù)圖（如CD3vsCD4vsCD8）。

***直方圖：**分析單一熒光標(biāo)記細(xì)胞的陽性率或表達(dá)強度分布（如CD8陽性細(xì)胞比例）。

***設(shè)門優(yōu)化：**精細(xì)調(diào)整門控區(qū)域，排除背景噪聲和無關(guān)細(xì)胞。

***定量分析：**計算陽性細(xì)胞百分比、平均熒光強度（MFI）等。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***抗體質(zhì)量：**選擇高純度、高特異性的抗體，避免批間差異。首次使用新批號的抗體需驗證其性能。

***熒光串色：**不同熒光染料之間可能存在串色，需查閱抗體說明書了解其串色情況，并選擇發(fā)射光譜相互獨立的染料組合。必要時使用熒光淬滅劑。

***染色時間與溫度：**嚴(yán)格遵守說明書推薦的染色時間和溫度。間接染色時，二抗孵育時間不宜過長，避免非特異性結(jié)合。

***細(xì)胞活力：**活細(xì)胞是獲得可靠結(jié)果的保證，避免反復(fù)凍融，染色前細(xì)胞活力應(yīng)>95%。

***對照設(shè)置：**必須設(shè)置對照：

*陰性對照：未加一抗或用同型IgG替代一抗。

*陽性對照：已知表達(dá)該標(biāo)志物的細(xì)胞或標(biāo)準(zhǔn)品。

***Stain-Free：**不加任何熒光抗體，用于評估細(xì)胞自發(fā)熒光水平，判斷染色背景。

***數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：**對于比較不同實驗組的數(shù)據(jù)，建議進(jìn)行細(xì)胞數(shù)校正或MFI標(biāo)準(zhǔn)化。

（三）WesternBlot（續(xù)）

1.**樣本處理（續(xù)）：**

***蛋白定量（續(xù)）：**使用BCA、Bradford或Laemmli快速銀染法（若需直接測序）進(jìn)行蛋白定量。確保上樣量一致（通常20-50μg/lane），并根據(jù)膠濃度和目標(biāo)條帶位置調(diào)整上樣量。

***樣品緩沖液：**根據(jù)蛋白大小選擇合適的樣品緩沖液（如4-20%SDS）。含有SDS（使蛋白變性并帶負(fù)電荷）、甘油（增加樣品密度便于上樣）、溴酚藍(lán)/二甲苯青FF（指示電泳進(jìn)程）、還原劑（如β-巰基乙醇或DTT，斷裂二硫鍵）。

***加熱變性：**將樣品與樣品緩沖液混合后，100℃加熱5-10分鐘，使蛋白充分變性并斷裂二硫鍵。

***上樣前準(zhǔn)備：**加入TrackingDye（如溴酚藍(lán)，用于指示樣品在凝膠中的位置）和LoadingBuffer（如甘油、SDS、染料），確保上樣體積一致。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***SDS電泳（續(xù)）：**

***凝膠制備：**根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量范圍選擇凝膠濃度（如12-15%SDS）。配制分離膠和濃縮膠，注意pH值（分離膠pH8.8-9.0，濃縮膠pH6.8）。加入APS（引發(fā)劑）和TEMED（加速劑）時需快速混合，并立即灌膠。

***樣品上樣：**用梳子（comb）在濃縮膠上預(yù)留加樣孔。小心加入樣品，確保無氣泡。上樣量需與膠孔容積匹配。

***電泳：**接通電源，設(shè)定合適電壓（濃縮膠80-100V，分離膠100-120V）。觀察溴酚藍(lán)遷移情況，確保樣品在預(yù)定時間內(nèi)進(jìn)入分離膠。

***終止電泳：**當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時，關(guān)閉電源，取出凝膠。

***轉(zhuǎn)膜（續(xù)）：**

***轉(zhuǎn)膜條件：**選擇合適的轉(zhuǎn)膜裝置（PVDF膜或NC膜）。配置轉(zhuǎn)膜緩沖液（如含20%甲醇的Tris-Glycine緩沖液或含20%甲醇的APS緩沖液）。設(shè)定轉(zhuǎn)膜參數(shù)（電壓：100V；時間：1-2小時；溫度：4℃）。PVDF膜需預(yù)濕（甲醇20分鐘，水洗2次，Tris-Glycine緩沖液平衡1小時）。

***轉(zhuǎn)膜過程：**將凝膠、膜、吸水紙按順序放入轉(zhuǎn)膜盒中，確保所有界面接觸良好，膜有輕微褶皺但無氣泡。連接電源，開始轉(zhuǎn)膜。

***轉(zhuǎn)膜后處理：**轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用Tris-Glycine緩沖液洗滌，準(zhǔn)備封閉。

***封閉（續(xù)）：**

***封閉液：**TBST或TBS緩沖液分別加入5%脫脂奶粉或5%BSA，可加入0.1%Tween-20以減少非特異性吸附。

***封閉方法：**將膜放入封閉液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時，或4℃過夜（若需過夜，次日需重新封閉1小時）。

***一抗孵育（續(xù)）：**

***抗體稀釋：**用封閉液將一抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:1000-1:5000）。可加入0.1%牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉以減少非特異性結(jié)合。

***孵育條件：**將膜放入含一抗的封閉液中，4℃孵育過夜（最佳選擇），或室溫?fù)u床孵育1-2小時（若時間較短，需增加洗滌次數(shù)）。

***洗滌（續(xù)）：**

***洗滌液：**0.05%Tween-20的TBST或TBS緩沖液。

***洗滌步驟：**用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。對于高豐度蛋白或長時間孵育，建議增加洗滌次數(shù)（如洗滌5-6次，每次10分鐘）。

***二抗孵育（續(xù)）：**

***抗體稀釋：**用TBST將HRP標(biāo)記二抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:5000-1:10000）。

***孵育條件：**將膜放入含二抗的TBST中，室溫?fù)u床避光孵育1小時。

***洗滌：**同一抗孵育后，用TBST洗滌3-5次，每次10分鐘。

***顯色（續(xù)）：**

***底物選擇：**TMB（常用，呈藍(lán)色，加入酸后變黃色）或DAB（呈棕色）。

***顯色反應(yīng)：**將膜放入新鮮配制的底物溶液中，避光孵育10-30分鐘（TMB）或5-15分鐘（DAB）。期間可用肉眼或酶標(biāo)儀監(jiān)測顏色變化。

***終止反應(yīng)：**加入終止液（如H?SO?或HCl），終止酶促反應(yīng)，顏色變淺。

***成像與分析（續(xù)）：**

***成像：**使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ECL）或熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。ECL建議在顯色后1小時內(nèi)成像，信號強度隨時間衰減。設(shè)置好曝光時間，確保條帶清晰且背景干凈。

***圖像處理：**使用ImageJ、QuantityOne等軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析。使用內(nèi)參照（如β-actin）對目標(biāo)條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

***定量分析：**計算目標(biāo)條帶的相對灰度值，用于比較不同實驗組間的差異。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***凝膠跑膠：**保證電壓和電流穩(wěn)定，確保加樣孔位置準(zhǔn)確，避免樣品溢出。

***轉(zhuǎn)膜：**確保膜平整，無氣泡，轉(zhuǎn)膜參數(shù)（電壓、時間、溫度）和轉(zhuǎn)膜緩沖液成分準(zhǔn)確。轉(zhuǎn)膜后可用麗春紅（PonceauS）染色或銀染短暫染色，檢查蛋白轉(zhuǎn)移情況。

***抗體特異性：**選擇特異性強、已驗證過的抗體。必要時進(jìn)行抗體交叉反應(yīng)性檢測。

***封閉充分：**封閉不充分會導(dǎo)致背景高，需確保封閉時間足夠，封閉液濃度合適。

***孵育條件：**一抗、二抗的濃度和孵育時間需通過預(yù)實驗優(yōu)化，以達(dá)到最佳靈敏度和特異性，同時避免高背景。

***洗滌徹底：**洗滌是降低背景的關(guān)鍵，務(wù)必使用洗板機或搖床充分洗滌，減少游離二抗的干擾。

***顯色控制：**顯色時間不宜過長，避免顏色過深導(dǎo)致條帶模糊。ECL信號不穩(wěn)定時，需檢查二抗工作濃度、底物新鮮度、曝光時間等。

**五、實驗安全與廢棄物處理（續(xù)）**

（一）個人防護（續(xù)）

1.**防護裝備清單：**

*實驗服：長袖、長褲、無破洞的實驗服。

*手套：根據(jù)接觸試劑選擇丁腈、乳膠或乙烯基手套。處理化學(xué)試劑或生物樣本時必須佩戴。建議雙層佩戴或佩戴更耐化學(xué)腐蝕的手套。

*護目鏡：防濺型護目鏡，處理揮發(fā)性試劑、產(chǎn)生氣溶膠或進(jìn)行高風(fēng)險操作時佩戴。

*口罩：普通醫(yī)用口罩或N95/KN95口罩，處理氣溶膠或呼吸道傳染性樣本時佩戴。

*鞋套：必要時佩戴，防止鞋底污染。

*安全圍裙：處理腐蝕性或刺激性試劑時佩戴。

2.**操作要求：**

*嚴(yán)禁穿拖鞋、涼鞋進(jìn)入實驗室。

*操作化學(xué)試劑時，禁止佩戴戒指、手表、手鏈等飾品。

*如發(fā)生皮膚或眼睛接觸，立即用大量流動清水沖洗，并報告給相關(guān)人員。

*定期進(jìn)行健康檢查，特別是接觸有毒有害試劑的人員。

（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.**廢棄物分類清單：**

***化學(xué)廢棄物：**

*有機溶劑廢液：如乙醇、乙醚、丙酮等，需按實驗室規(guī)定收集于專用容器中，不可隨意混合。

*無機酸/堿廢液：如鹽酸、硫酸、氫氧化鈉溶液等，需用大量水稀釋后中和，再按廢水處理。

*含重金屬廢液：如含鉻、鉛、汞的試劑廢液，需特殊收集和處理。

*漂白劑/消毒劑廢液：如次氯酸鈉溶液，需用水稀釋后排放。

***生物安全廢棄物：**

*污染的培養(yǎng)基、吸管、離心管、試管等。

*組織樣本、細(xì)胞培養(yǎng)物。

*涂抹了血液或體液的廢棄物。

*針頭、注射器等銳器，需放入專用銳器盒。

***銳器廢棄物：**必須使用符合標(biāo)準(zhǔn)的銳器盒收集，封口前確保無泄漏。

***實驗動物廢棄物：**如使用實驗動物，需按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行尸體處理（如焚燒）和場地消毒。

***廢液處理原則：**

*酸堿廢液先中和。

*有機溶劑廢液分類收集。

*含害物質(zhì)廢液需與普通廢液分開。

*廢液需交由有資質(zhì)的專業(yè)公司處理。

***固體廢棄物處理原則：**

*污染的固體廢棄物需先滅菌（如高壓滅菌），再按醫(yī)療廢物或危險廢物處理。

*銳器、化學(xué)廢液瓶需按類別貼上明確標(biāo)簽。

2.**處理流程：**

***即時處理：**產(chǎn)生銳器、生物樣本等需立即放入指定容器。

***定期收集：**按實驗室規(guī)定的時間，將分類好的廢棄物收集到專用容器中。

***轉(zhuǎn)移與處置：**由指定人員按照規(guī)定流程，將廢棄物轉(zhuǎn)移至指定地點，并交由有資質(zhì)的單位進(jìn)行最終處置。所有操作需記錄在案。

（三）應(yīng)急措施（續(xù)）

1.**化學(xué)品泄漏：**

***小范圍泄漏：**戴好防護手套，用合適的吸收材料（如吸附棉、沙子）小心吸收，并按化學(xué)廢棄物處理。

***大面積泄漏：**立即疏散無關(guān)人員，佩戴防護裝備，用大量水沖洗稀釋（如酸堿泄漏），并上報。

***腐蝕性物質(zhì)濺入眼睛：**立即用大量流動清水或生理鹽水沖洗至少15分鐘，并立即就醫(yī)。

2.**火災(zāi)：**

*熟悉消防器材位置和使用方法（滅火器、消防栓）。

*小火嘗試用濕布、滅火器撲滅，大火立即報警（119），并疏散人員。

*切斷電源和氣源，關(guān)閉相關(guān)閥門。

3.**觸電：**

*立即切斷電源，或用絕緣物體將觸電者與電源分開。

*對觸電者進(jìn)行急救（如心肺復(fù)蘇），并呼叫急救中心（120）。

4.**生物樣本暴露：**

*皮膚接觸：立即用肥皂和流動水清洗。

*眼睛接觸：立即用大量流動清水或生理鹽水沖洗至少15分鐘，并就醫(yī)。

*吸入：立即移至空氣新鮮處，必要時吸氧并就醫(yī)。

5.**儀器故障：**

*記錄故障現(xiàn)象和時間。

*立即停止使用故障儀器，并報告給設(shè)備維護人員。

*在儀器修復(fù)前，使用備用設(shè)備或調(diào)整實驗方案。

**六、總結(jié)（續(xù)）**

免疫學(xué)實驗種類繁多，本模板詳細(xì)介紹了ELISA、FCM和WesternBlot三種常用技術(shù)的基本原理、關(guān)鍵步驟和注意事項。成功進(jìn)行免疫學(xué)實驗需要嚴(yán)格遵循以下原則：

1.**實驗設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)：**明確實驗?zāi)康?，選擇合適的技術(shù)，設(shè)置必要的對照，優(yōu)化實驗條件。

2.**操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)：**嚴(yán)格遵守SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程），精確控制溫度、時間、濃度等關(guān)鍵參數(shù)。

3.**質(zhì)量控制嚴(yán)格：**使用高質(zhì)量試劑和抗體，定期校準(zhǔn)儀器，設(shè)置多個對照以驗證結(jié)果的可靠性。

4.**安全意識強：**全程佩戴適當(dāng)?shù)膫€人防護裝備，規(guī)范處理化學(xué)和生物廢棄物，掌握應(yīng)急處理流程。

5.**數(shù)據(jù)記錄完整：**詳細(xì)記錄實驗過程、條件和結(jié)果，便于結(jié)果分析和問題追溯。

6.**持續(xù)學(xué)習(xí)改進(jìn)：**關(guān)注領(lǐng)域內(nèi)的新技術(shù)和新方法，不斷優(yōu)化實驗方案，提高實驗效率和結(jié)果準(zhǔn)確性。

一、免疫學(xué)實驗概述

免疫學(xué)實驗是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與病原體、腫瘤等相互作用的重要手段。通過實驗，可以驗證免疫學(xué)理論、開發(fā)診斷試劑、評估免疫治療效果等。本模板旨在提供免疫學(xué)實驗的基本流程、常用技術(shù)和注意事項，確保實驗操作的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。

二、實驗準(zhǔn)備

（一）實驗材料

1.試劑：抗體、抗原、酶標(biāo)底物、緩沖液等。

2.儀器：酶標(biāo)儀、離心機、培養(yǎng)箱、移液器等。

3.樣本：血液、組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物等。

（二）實驗環(huán)境

1.保持無菌：實驗臺面需定期消毒，操作時佩戴手套和口罩。

2.溫度控制：細(xì)胞培養(yǎng)和酶反應(yīng)需在37℃恒溫條件下進(jìn)行。

3.濕度調(diào)節(jié)：實驗室濕度應(yīng)維持在50%-60%，避免試劑揮發(fā)。

（三）實驗前檢查

1.試劑效期：確保所有試劑在有效期內(nèi)使用。

2.儀器校準(zhǔn)：酶標(biāo)儀、離心機等需定期校準(zhǔn)，保證讀數(shù)準(zhǔn)確。

3.人員培訓(xùn)：操作人員需熟悉實驗步驟和應(yīng)急處理方法。

三、常用免疫學(xué)實驗技術(shù)

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

1.**樣本處理**：

(1)血清樣本需離心去除細(xì)胞碎片。

(2)組織樣本需勻漿后離心取上清液。

2.**實驗步驟**：

(1)包被：將抗原或抗體包被于酶標(biāo)板孔中，4℃過夜。

(2)封閉：用封閉液封閉非特異性位點，37℃1小時。

(3)結(jié)合：加入待測樣本，37℃1小時。

(4)顯色：加入酶標(biāo)底物，避光反應(yīng)30分鐘。

(5)定量：酶標(biāo)儀檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

3.**注意事項**：

(1)避免交叉污染，每步操作更換吸頭。

(2)溫度需嚴(yán)格控制，避免影響結(jié)合效率。

（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

1.**細(xì)胞制備**：

(1)血液樣本需用肝素抗凝。

(2)組織樣本需消化酶解后過濾去除碎片。

2.**實驗步驟**：

(1)染色：加入熒光標(biāo)記抗體，冰浴避光30分鐘。

(2)上機檢測：用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗體表達(dá)。

(3)數(shù)據(jù)分析：用軟件繪制細(xì)胞直方圖和門控分析。

3.**注意事項**：

(1)染色濃度需優(yōu)化，避免信號飽和。

(2)設(shè)門要合理，確保分析目標(biāo)細(xì)胞群體。

（三）WesternBlot

1.**樣本處理**：

(1)細(xì)胞或組織用裂解液提取總蛋白。

(2)BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。

2.**實驗步驟**：

(1)電泳：SDS分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

(2)封閉：用封閉液封閉膜表面，4℃過夜。

(3)一抗：加入特異性抗體，室溫孵育1小時。

(4)二抗：加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1小時。

(5)顯色：用ECL底物化學(xué)發(fā)光檢測目標(biāo)條帶。

3.**注意事項**：

(1)電泳電壓需穩(wěn)定，避免條帶彌散。

(2)一抗?jié)舛刃杼荻葍?yōu)化，提高特異性。

四、實驗數(shù)據(jù)記錄與處理

（一）數(shù)據(jù)記錄

1.實驗條件：記錄試劑品牌、濃度、反應(yīng)時間等關(guān)鍵參數(shù)。

2.定量結(jié)果：記錄吸光度、熒光強度等原始數(shù)據(jù)。

3.質(zhì)量控制：記錄膜條帶完整性、背景信號等指標(biāo)。

（二）數(shù)據(jù)分析

1.ELISA數(shù)據(jù)：用Excel擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度（示例：線性范圍0.1-100ng/mL）。

2.FCM數(shù)據(jù)：用FACS軟件分析細(xì)胞比例（示例：陽性細(xì)胞率≥95%）。

3.WesternBlot數(shù)據(jù)：用ImageJ軟件定量條帶灰度值。

（三）結(jié)果報告

1.描述實驗現(xiàn)象：如抗體結(jié)合強度與濃度呈正相關(guān)。

2.統(tǒng)計學(xué)分析：用t檢驗或ANOVA比較組間差異（P<0.05為顯著）。

3.結(jié)論建議：根據(jù)結(jié)果提出進(jìn)一步實驗方向。

五、實驗安全與廢棄物處理

（一）個人防護

1.佩戴實驗服、護目鏡，必要時穿手套。

2.高風(fēng)險操作需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

（二）廢棄物處理

1.液體廢棄物需用專用容器收集，定期高壓滅菌。

2.化學(xué)試劑需分類存放，避免混合。

（三）應(yīng)急措施

1.試劑濺濺到皮膚需立即用大量清水沖洗。

2.儀器故障需立即斷電并報告維修。

六、總結(jié)

免疫學(xué)實驗涉及技術(shù)多樣，需嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。本模板通過系統(tǒng)化流程設(shè)計，可幫助實驗者高效完成實驗并確保數(shù)據(jù)可靠性。后續(xù)需結(jié)合具體項目需求，進(jìn)一步優(yōu)化實驗方案。

**二、實驗準(zhǔn)備（續(xù)）**

（一）實驗材料（續(xù)）

1.試劑（續(xù)）：

***抗體：**

*一抗：根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇特異性抗體，注明宿主來源（如兔源、鼠源）、克隆/多克隆類型、純度等級（如IgG純化）、存儲條件（如-20℃或-80℃）。需提供抗體說明書，包括推薦工作濃度、阻斷劑建議（如脫脂奶粉、BSA）。

*二抗：選擇與一抗宿主來源匹配的酶標(biāo)或熒光標(biāo)記二抗（如辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG）。同樣需注明存儲條件、工作濃度、是否需要封閉。

*標(biāo)記物：除二抗外，還可能使用熒光標(biāo)記抗體（如AlexaFluor系列、PE、Cy7）、生物素標(biāo)記抗體等，需明確標(biāo)記類型、熒光通道、工作濃度。

***抗原：**

*包被抗原：可以是純化蛋白、多肽片段或重組蛋白，需提供純度證明和序列信息。若為組織抗原，需說明組織來源和固定方法。

*內(nèi)參照抗原：常用β-actin、GAPDH等，用于標(biāo)準(zhǔn)化樣本表達(dá)水平。

***酶標(biāo)底物：**根據(jù)二抗標(biāo)記的酶選擇（HRP用TMB或DAB，AP用NBT/BCIP），注明推薦反應(yīng)時間、終止液（如H?SO?或HCl）。

***緩沖液：**

*標(biāo)準(zhǔn)緩沖液：Tris-HCl緩沖液（pH7.4-8.0）、PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液）、TBS（Tris緩沖鹽溶液）。

*特殊緩沖液：封閉液（如5%脫脂奶粉TBST）、洗滌液（0.05%Tween-20PBST/TBS）、抗體稀釋液（如0.1-0.5M碳酸鈉緩沖液pH9.6，用于蛋白A/G包被）。

***其他：**過氧化物酶抑制劑（如疊氮化鈉、甲苯胺藍(lán)，用于ELISA抑制內(nèi)源性過氧化物酶）、BSA（牛血清白蛋白，用于封閉）、甘氨酸（用于SDS）。

2.儀器（續(xù)）：

***移液器：**精確到0.1μL或1μL的移液器，需定期校準(zhǔn)，根據(jù)不同體積選擇合適量程（如10-100μL用200μL移液器）。

***混勻器/磁力攪拌器：**用于試劑混合、細(xì)胞懸液制備，確保充分混勻。

***水浴鍋/恒溫金屬?。?*精確控溫（如37℃、4℃、-20℃、-80℃），用于抗體孵育、酶反應(yīng)等。

***高壓滅菌鍋：**用于培養(yǎng)基、緩沖液、廢棄物的滅菌。

***超純水器/去離子水：**提供符合實驗要求的純水。

***pH計：**用于精確測量和調(diào)節(jié)緩沖液pH值。

***離心機：**低速離心機（如4000-10000rpm）、高速冷凍離心機，需明確最大轉(zhuǎn)速/相對離心力（RCF），并校準(zhǔn)轉(zhuǎn)子。

***電泳設(shè)備：**SDS電泳系統(tǒng)（含電泳槽、電源）、轉(zhuǎn)膜設(shè)備（PVDF膜或NC膜、轉(zhuǎn)膜槽、冰?。?/p>

***凝膠成像系統(tǒng)：**用于WesternBlot結(jié)果成像，可配置化學(xué)發(fā)光或熒光成像系統(tǒng)。

***酶標(biāo)儀/微孔板讀取儀：**用于ELISA等檢測吸光度值，需定期用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。

***流式細(xì)胞儀：**用于FCM檢測，需校準(zhǔn)熒光通道和細(xì)胞計數(shù)。

***生物安全柜/超凈工作臺：**用于無菌操作，需定期進(jìn)行泄漏測試和表面消毒。

***培養(yǎng)箱：**CO?培養(yǎng)箱（控制溫度、濕度和CO?濃度）、普通恒溫培養(yǎng)箱。

***顯微鏡：**用于細(xì)胞觀察、組織切片觀察。

3.樣本（續(xù)）：

***細(xì)胞樣本：**提供細(xì)胞系名稱、來源（如ATCC）、傳代次數(shù)、凍存/培養(yǎng)狀態(tài)。若為組織樣本，需注明組織類型、來源（如腫瘤組織、正常組織）、固定液（如4%多聚甲醛）、脫水液（如乙醇）、包埋劑（如石蠟）。

***樣本處理：**提供詳細(xì)的樣本前處理流程，如細(xì)胞裂解（使用裂解緩沖液，含蛋白酶抑制劑）、組織勻漿（使用組織研磨液）、蛋白定量（BCA、Bradford法）。

（二）實驗環(huán)境（續(xù)）

1.**無菌操作：**

*操作前：進(jìn)行手部消毒，穿戴干凈實驗服、口罩、無菌手套。

*工作臺面：使用70-75%酒精擦拭工作臺面，靜置30分鐘進(jìn)行空間消毒。

*環(huán)境監(jiān)測：定期使用生物指示劑或孢子計數(shù)器監(jiān)測超凈工作臺或生物安全柜的滅菌效果。

*無菌物品：確保移液器頭、吸頭、無菌耗材等在有效期內(nèi)，并正確儲存。

2.**溫度控制（續(xù)）：**

*細(xì)胞培養(yǎng)：37℃、5%CO?為標(biāo)準(zhǔn)條件，需監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度和CO?濃度，每日校準(zhǔn)。

*酶反應(yīng)：通常在37℃進(jìn)行，需使用恒溫設(shè)備，反應(yīng)時間需精確控制。

*冷凍樣本：-20℃或-80℃冰箱溫度需定期監(jiān)測，避免溫度波動影響樣本活性。

3.**濕度調(diào)節(jié)（續(xù)）：**

*實驗室濕度：維持在40%-60%，過高可能導(dǎo)致試劑吸潮，過低可能引起靜電干擾（尤其流式細(xì)胞術(shù)）。

*防潮措施：對易吸潮試劑（如干燥型試劑）使用密封包裝。

（三）實驗前檢查（續(xù)）

1.試劑效期（續(xù)）：建立試劑臺賬，標(biāo)注入庫日期和有效期，優(yōu)先使用近期生產(chǎn)試劑。檢查試劑標(biāo)簽是否完整、清晰，有無變色、沉淀、渾濁等異?，F(xiàn)象。關(guān)鍵試劑（如抗體、酶標(biāo)底物）建議使用新鮮配制或小量分裝冷凍。

2.儀器校準(zhǔn)（續(xù)）：除了定期校準(zhǔn)，每次使用前需檢查儀器狀態(tài)，如酶標(biāo)儀的光路是否清潔、讀數(shù)是否穩(wěn)定；離心機的轉(zhuǎn)子是否安裝正確、轉(zhuǎn)速顯示是否準(zhǔn)確；流式細(xì)胞儀的液面高度是否合適、鞘流是否穩(wěn)定。

3.人員培訓(xùn)（續(xù)）：新操作人員必須經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)，包括：

*實驗原理和目的。

*每一步操作的具體方法和注意事項（如移液技巧、孵育時間、溫度要求）。

*儀器使用和基本故障排除。

*實驗記錄規(guī)范和廢棄物處理要求。

*安全操作規(guī)程和應(yīng)急預(yù)案。

*建議進(jìn)行實際操作考核，確保持證上崗。

**三、常用免疫學(xué)實驗技術(shù)（續(xù)）**

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（續(xù)）

1.**樣本處理（續(xù)）：**

***細(xì)胞因子：**需根據(jù)說明書進(jìn)行細(xì)胞刺激（如LPS、PMA刺激）、裂解或收集上清。若樣本含高濃度鹽分，可能需要透析或稀釋。

***血清/血漿：**分離后可直接使用，或根據(jù)需要稀釋。

***組織樣本：**除了勻漿和離心，對于石蠟包埋組織，需進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)（如熱修復(fù)或酶修復(fù)）等步驟，以暴露抗原決定簇。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***包被（續(xù)）：**

*用包被緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS或Tris-HCl）將抗原稀釋至合適濃度（通常1-10μg/mL）。

*100μL/孔加入酶標(biāo)板，4℃過夜（或37℃2-4小時）。

*次日吸去液體，不吸干，用包被緩沖液洗滌3次（每次5-10分鐘）。

***封閉（續(xù)）：**

*加入封閉液（如5%BSA-TBST或5%脫脂奶粉-TBST），37℃1-2小時，或4℃過夜。

*吸去液體，洗滌3次。

***結(jié)合（續(xù)）：**

*用抗體稀釋液（如0.1M碳酸鈉緩沖液pH9.6，或TBST）將一抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1-10μg/mL）。

*100μL/孔加入，37℃孵育1小時，或4℃過夜。

*吸去液體，洗滌3-5次（關(guān)鍵步驟，用TBST洗滌）。

***結(jié)合二抗（續(xù)）：**

*用抗體稀釋液（如TBST）將HRP標(biāo)記二抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:1000-1:5000）。

*100μL/孔加入，37℃孵育1小時。

*吸去液體，洗滌5次（徹底洗滌，減少背景）。

***顯色（續(xù)）：**

*用底物緩沖液（如100mM檸檬酸緩沖液pH5.0或Tris-HCl緩沖液pH7.6）將TMB底物稀釋至工作濃度（按說明書或預(yù)實驗優(yōu)化）。

*100μL/孔加入，避光反應(yīng)15-30分鐘（時間需根據(jù)OD值變化速率調(diào)整）。

*可在反應(yīng)過程中用酶標(biāo)儀每隔幾分鐘檢測一次吸光度，監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。

***終止（續(xù)）：**

*加入終止液（如2MH?SO?或HCl），100μL/孔，終止酶促反應(yīng)。

*混勻，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值。必要時可設(shè)置參考波長（如630nm）扣除背景。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***抗體濃度優(yōu)化：**一抗和二抗工作濃度需通過預(yù)實驗（如棋盤格法）確定最佳稀釋倍數(shù)，平衡敏感度和特異性。

***溫度和時間：**嚴(yán)格按說明書和優(yōu)化后的條件控制孵育溫度和時間，過高或過低、過長或過短均影響結(jié)果。

***洗滌：**洗滌是降低背景的關(guān)鍵，必須使用洗板機確保洗滌一致性和徹底性。洗滌次數(shù)和每次洗滌時間需優(yōu)化。

***蒸發(fā)：**孵育間隙或洗滌后若板內(nèi)液體蒸發(fā)過多，需用封閉液或TBST潤洗1-2次，防止板底干燥影響結(jié)合。

***質(zhì)控：**每次實驗需設(shè)置陰性對照（未加一抗或一抗用封閉液代替）、陽性對照（已知陽性樣本）、空白對照（不加任何試劑），用于評估實驗的特異性和靈敏度。

（二）流式細(xì)胞術(shù)（FCM）（續(xù)）

1.**細(xì)胞制備（續(xù)）：**

***白細(xì)胞：**外周血需用肝素抗凝（避免EDTA等影響鈣離子）。通過密度梯度離心（如Ficoll-Paque）分離單個核細(xì)胞（PBMC）。淋巴細(xì)胞分離液對紅細(xì)胞和粒細(xì)胞有密度差，可有效分離出純度較高的淋巴細(xì)胞群體。

***組織細(xì)胞：**除了消化酶（如膠原酶、胰蛋白酶），可能需要組織研磨器或高壓勻漿輔助。消化后需用密度梯度離心或尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞碎片。

***細(xì)胞計數(shù)與活力檢測：**制備好的細(xì)胞需進(jìn)行計數(shù)（如使用血細(xì)胞計數(shù)板或細(xì)胞計數(shù)儀）和活力檢測（如臺盼藍(lán)染色法，要求活力>95%）。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***細(xì)胞固定（可選）：**對于某些表面標(biāo)志物，細(xì)胞需在染色前進(jìn)行固定（如4%多聚甲醛或甲醇），以穩(wěn)定細(xì)胞膜和抗原。固定后可能需要滲透化（如0.1%TritonX-100）。

***染色（續(xù)）：**

***直接染色：**用直接標(biāo)記的熒光抗體（如PE、AlexaFluor488/647）標(biāo)記細(xì)胞表面或胞外蛋白，通常在4℃冰箱避光孵育30分鐘。

***間接染色：**先用未標(biāo)記的一抗（如鼠抗人CD3）室溫孵育30分鐘，再用熒光標(biāo)記的二抗（如羊抗鼠PE-Cy7）孵育30分鐘。注意封閉（如用小鼠IgG封閉非特異性結(jié)合位點）和洗滌。

***胞內(nèi)染色：**若需檢測胞內(nèi)蛋白（如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子），需用細(xì)胞穿孔劑/固定劑（如Paraformaldehyde+Cytofix/Cytoperm）處理細(xì)胞，使抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。染色后需用封閉劑封閉非特異性位點。

***抗體組合：**同時檢測多個標(biāo)志物時，需優(yōu)化抗體組合，避免熒光串色?？墒褂貌煌瑹晒馔ǖ赖目贵w，并在不同溫度（如4℃直接染色，室溫間接染色）下進(jìn)行。

***上機檢測（續(xù)）：**

*用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。需設(shè)置合適的激光激發(fā)波長和熒光檢測通道，以匹配所用熒光染料的發(fā)射光譜。

***設(shè)定門控：**根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)初步去除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞（如設(shè)置FSC/SSC閾值），然后根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞群的特征（如特定標(biāo)志物陽性）設(shè)立門控區(qū)域，確保分析的是目標(biāo)細(xì)胞群體。

***采集參數(shù)：**設(shè)置采集事件數(shù)（如10000個事件），調(diào)整PMT電壓，確保熒光信號采集在線性范圍內(nèi)。

***數(shù)據(jù)分析（續(xù)）：**

***數(shù)據(jù)導(dǎo)出：**實驗結(jié)束后導(dǎo)出FCS原始數(shù)據(jù)文件和相應(yīng)的列表文件（ListFile）。

***軟件分析：**使用FlowJo、FCSExpress等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

***散點圖：**查看細(xì)胞群體分布，如FSCvsSSC初步看細(xì)胞質(zhì)和核，不同熒光標(biāo)記抗體繪制雙參數(shù)圖（如CD3vsCD4）或三參數(shù)圖（如CD3vsCD4vsCD8）。

***直方圖：**分析單一熒光標(biāo)記細(xì)胞的陽性率或表達(dá)強度分布（如CD8陽性細(xì)胞比例）。

***設(shè)門優(yōu)化：**精細(xì)調(diào)整門控區(qū)域，排除背景噪聲和無關(guān)細(xì)胞。

***定量分析：**計算陽性細(xì)胞百分比、平均熒光強度（MFI）等。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***抗體質(zhì)量：**選擇高純度、高特異性的抗體，避免批間差異。首次使用新批號的抗體需驗證其性能。

***熒光串色：**不同熒光染料之間可能存在串色，需查閱抗體說明書了解其串色情況，并選擇發(fā)射光譜相互獨立的染料組合。必要時使用熒光淬滅劑。

***染色時間與溫度：**嚴(yán)格遵守說明書推薦的染色時間和溫度。間接染色時，二抗孵育時間不宜過長，避免非特異性結(jié)合。

***細(xì)胞活力：**活細(xì)胞是獲得可靠結(jié)果的保證，避免反復(fù)凍融，染色前細(xì)胞活力應(yīng)>95%。

***對照設(shè)置：**必須設(shè)置對照：

*陰性對照：未加一抗或用同型IgG替代一抗。

*陽性對照：已知表達(dá)該標(biāo)志物的細(xì)胞或標(biāo)準(zhǔn)品。

***Stain-Free：**不加任何熒光抗體，用于評估細(xì)胞自發(fā)熒光水平，判斷染色背景。

***數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：**對于比較不同實驗組的數(shù)據(jù)，建議進(jìn)行細(xì)胞數(shù)校正或MFI標(biāo)準(zhǔn)化。

（三）WesternBlot（續(xù)）

1.**樣本處理（續(xù)）：**

***蛋白定量（續(xù)）：**使用BCA、Bradford或Laemmli快速銀染法（若需直接測序）進(jìn)行蛋白定量。確保上樣量一致（通常20-50μg/lane），并根據(jù)膠濃度和目標(biāo)條帶位置調(diào)整上樣量。

***樣品緩沖液：**根據(jù)蛋白大小選擇合適的樣品緩沖液（如4-20%SDS）。含有SDS（使蛋白變性并帶負(fù)電荷）、甘油（增加樣品密度便于上樣）、溴酚藍(lán)/二甲苯青FF（指示電泳進(jìn)程）、還原劑（如β-巰基乙醇或DTT，斷裂二硫鍵）。

***加熱變性：**將樣品與樣品緩沖液混合后，100℃加熱5-10分鐘，使蛋白充分變性并斷裂二硫鍵。

***上樣前準(zhǔn)備：**加入TrackingDye（如溴酚藍(lán)，用于指示樣品在凝膠中的位置）和LoadingBuffer（如甘油、SDS、染料），確保上樣體積一致。

2.**實驗步驟（續(xù)）：**

***SDS電泳（續(xù)）：**

***凝膠制備：**根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量范圍選擇凝膠濃度（如12-15%SDS）。配制分離膠和濃縮膠，注意pH值（分離膠pH8.8-9.0，濃縮膠pH6.8）。加入APS（引發(fā)劑）和TEMED（加速劑）時需快速混合，并立即灌膠。

***樣品上樣：**用梳子（comb）在濃縮膠上預(yù)留加樣孔。小心加入樣品，確保無氣泡。上樣量需與膠孔容積匹配。

***電泳：**接通電源，設(shè)定合適電壓（濃縮膠80-100V，分離膠100-120V）。觀察溴酚藍(lán)遷移情況，確保樣品在預(yù)定時間內(nèi)進(jìn)入分離膠。

***終止電泳：**當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時，關(guān)閉電源，取出凝膠。

***轉(zhuǎn)膜（續(xù)）：**

***轉(zhuǎn)膜條件：**選擇合適的轉(zhuǎn)膜裝置（PVDF膜或NC膜）。配置轉(zhuǎn)膜緩沖液（如含20%甲醇的Tris-Glycine緩沖液或含20%甲醇的APS緩沖液）。設(shè)定轉(zhuǎn)膜參數(shù)（電壓：100V；時間：1-2小時；溫度：4℃）。PVDF膜需預(yù)濕（甲醇20分鐘，水洗2次，Tris-Glycine緩沖液平衡1小時）。

***轉(zhuǎn)膜過程：**將凝膠、膜、吸水紙按順序放入轉(zhuǎn)膜盒中，確保所有界面接觸良好，膜有輕微褶皺但無氣泡。連接電源，開始轉(zhuǎn)膜。

***轉(zhuǎn)膜后處理：**轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用Tris-Glycine緩沖液洗滌，準(zhǔn)備封閉。

***封閉（續(xù)）：**

***封閉液：**TBST或TBS緩沖液分別加入5%脫脂奶粉或5%BSA，可加入0.1%Tween-20以減少非特異性吸附。

***封閉方法：**將膜放入封閉液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時，或4℃過夜（若需過夜，次日需重新封閉1小時）。

***一抗孵育（續(xù)）：**

***抗體稀釋：**用封閉液將一抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:1000-1:5000）?？杉尤?.1%牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉以減少非特異性結(jié)合。

***孵育條件：**將膜放入含一抗的封閉液中，4℃孵育過夜（最佳選擇），或室溫?fù)u床孵育1-2小時（若時間較短，需增加洗滌次數(shù)）。

***洗滌（續(xù)）：**

***洗滌液：**0.05%Tween-20的TBST或TBS緩沖液。

***洗滌步驟：**用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。對于高豐度蛋白或長時間孵育，建議增加洗滌次數(shù)（如洗滌5-6次，每次10分鐘）。

***二抗孵育（續(xù)）：**

***抗體稀釋：**用TBST將HRP標(biāo)記二抗稀釋至合適濃度（參考說明書，通常1:5000-1:10000）。

***孵育條件：**將膜放入含二抗的TBST中，室溫?fù)u床避光孵育1小時。

***洗滌：**同一抗孵育后，用TBST洗滌3-5次，每次10分鐘。

***顯色（續(xù)）：**

***底物選擇：**TMB（常用，呈藍(lán)色，加入酸后變黃色）或DAB（呈棕色）。

***顯色反應(yīng)：**將膜放入新鮮配制的底物溶液中，避光孵育10-30分鐘（TMB）或5-15分鐘（DAB）。期間可用肉眼或酶標(biāo)儀監(jiān)測顏色變化。

***終止反應(yīng)：**加入終止液（如H?SO?或HCl），終止酶促反應(yīng)，顏色變淺。

***成像與分析（續(xù)）：**

***成像：**使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ECL）或熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。ECL建議在顯色后1小時內(nèi)成像，信號強度隨時間衰減。設(shè)置好曝光時間，確保條帶清晰且背景干凈。

***圖像處理：**使用ImageJ、QuantityOne等軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析。使用內(nèi)參照（如β-actin）對目標(biāo)條帶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

***定量分析：**計算目標(biāo)條帶的相對灰度值，用于比較不同實驗組間的差異。

3.**注意事項（續(xù)）：**

***凝膠跑膠：**保證電壓和電流穩(wěn)定，確保加樣孔位置準(zhǔn)確，避免樣品溢出。

***轉(zhuǎn)膜：**確保膜平整，無氣泡，轉(zhuǎn)膜參數(shù)（電壓、時間、溫度）和轉(zhuǎn)膜緩沖液成分準(zhǔn)確